Extracto
cáncer pediátrico es un grupo relativamente raro y heterogéneo de hematológicas y no hematológicas tumores malignos que requieren múltiples procedimientos para su cribado diagnóstico y clasificación. Hasta ahora, la citometría de flujo (FC) no se ha aplicado sistemáticamente al trabajo de diagnóstico de este tipo de tumores malignos, principalmente para tumores sólidos. Aquí se evaluó un panel de marcadores FC para el cribado diagnóstico de cáncer pediátrico y una clasificación más detallada de los tumores sólidos pediátricos. La estrategia propuesta tiene como objetivo el diagnóstico diferencial entre tumoral
vs
. muestras reactivas, y hematológica
vs
. neoplasias no hematológicas, y la subclasificación de tumores sólidos. En total, 52 muestras de 40 pacientes sospechosos de las células tumorales que contienen se analizaron mediante FC en paralelo a los procedimientos de diagnóstico convencionales. La tasa general de concordancia entre los dos enfoques fue del 96% (50/52 muestras de diagnóstico), con el acuerdo 100% para todas las muestras reactivas /inflamatorias y no infiltrados, así como de las correspondientes a los tumores sólidos (n = 35), con solamente dos casos de falsos negativos con diagnóstico de linfoma de Hodgkin y el linfoma anaplásico, respectivamente. Por otra parte, clara discriminación entre muestras infiltradas por hematopoyético
vs.
Se logró sistemáticamente las células tumorales no hematopoyéticas. distintos subtipos de tumores sólidos mostraron diferentes perfiles de expresión de proteínas, lo que permite el diagnóstico diferencial de neuroblastoma (CD56
hi /GD2
+ /CD81
hi), tumores neuroectodérmicos primitivos (CD271
hi /CD99
+), tumores de Wilms (& gt; 1 población de células), rabdomiosarcoma (
nuMYOD1
+ /
numyogenin
+), carcinomas (CD45
- /EpCAM
+) , tumores de células germinales (CD56
+ /CD45
- /NG2
+ /CD10
+) y, finalmente, también hemangiopericitoma (CD45
- /CD34
+). En resumen, nuestros resultados muestran que multiparamétrico FC proporciona datos complementarios rápidos y útiles a la histopatología de rutina para el cribado diagnóstico y clasificación de cáncer pediátrico
Visto:. Ferreira-Facio CS, C Milito, Botafogo V, M Fontana, Thiago LS, Oliveira E, et al. (2013) Contribución de la citometría de flujo multiparamétrica del fenotipo inmune a la proyección de Diagnóstico y Clasificación de cáncer pediátrico. PLoS ONE 8 (3): e55534. doi: 10.1371 /journal.pone.0055534
Editor Syed A. Aziz, Health Canada, Canada |
Recibido: 20 Septiembre, 2012; Aceptado 27 de diciembre de 2012; Publicado: 5 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Ferreira-Facio et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo ha sido parcialmente apoyado por las siguientes subvenciones: EO fue apoyado en parte por subvención de CNPq- brasileña Consejo Nacional de Investigación (Brasilia, Brasil). MF fue parcialmente apoyado por una beca de investigación de la Fundación FAPERJ- apoyo de Río de Janeiro, (Río de Janeiro, Brasil) y ahora ella es parcialmente apoyado por una beca de CAPES /Ministério da Educação (Brasilia, Brasil). VB fue parcialmente apoyado por la Fundación de Investigación FAPERJ- apoyo de Río de Janeiro, (Río de Janeiro, Brasil). CES fue parcialmente apoyado por el subsidio de CNPq- brasileña Consejo Nacional de Investigación (Brasilia, Brasil) y el apoyo FAPERJ- Fundación de Investigación de Río de Janeiro, (Río de Janeiro, Brasil). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. No se recibió financiación externa adicional para este estudio
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Más de 200.000 pacientes pediátricos (& lt; 15.. años de edad) son diagnosticadas con cáncer cada año [1]. A pesar de cáncer es la causa principal de muerte relacionada con la enfermedad en niños en la mayoría de los países [2], los resultados individuales dependen en gran medida de tumor de rápido diagnóstico, clasificación y puesta en escena, para la selección de la terapia apropiada y las tasas de curación maximizadas [3]. Dado que una proporción significativa de los tumores pediátricos carecen de evidencia morfológica de la diferenciación y el origen histológico, una batería de marcadores inmunocitoquímicos e hibridación in situ, ultraestructurales y los procedimientos de diagnóstico molecular, se requieren típicamente para la clasificación de diagnóstico de la enfermedad [3] - [7].
Desde hace varias décadas, la citometría de flujo multiparamétrica (MFC) immunophenotyping ha demostrado ser esencial para el diagnóstico rápido, clasificación y seguimiento de la terapia de la mayoría de las neoplasias hematológicas, incluyendo leucemias y linfomas pediátricos. Por el contrario, sigue siendo una herramienta de investigación para tumores sólidos pediátricos [8] - [15]. Tal uso limitado de MFC en el diagnóstico de tumores sólidos pediátricos probablemente se refiere a la necesidad de suspensiones de células individuales y la disponibilidad de los paneles relativamente restringidas de marcadores fiables y validados, entre otros factores [16] - [18]. Por lo tanto, el uso de la citometría de flujo en los tumores sólidos pediátricos ha sido casi restringida a la evaluación del contenido de ADN de las células tumorales en ambas muestras incluidas en parafina y tejido congelado, en combinación o no con la tinción simultánea de uno o unos pocos marcadores fenotípicos [19] - [24]. En consecuencia, mientras que los estudios inmunofenotípicos se aplican rutinariamente en la mayoría de los linfomas pediátricos para el diagnóstico diferencial entre B- y precursores de células T linfomas linfoblástica y linfoma de Burkitt 25-28, se han reportado pocos estudios hasta el momento, en el que MFC se aplica sistemáticamente al estudio de las características fenotípicas de los tumores sólidos pediátricos [29] - [31]. Además, los pocos informaron estudios se han centrado principalmente en análisis descriptivos de los patrones de tinción para uno o unos pocos marcadores, por lo general en un solo subtipo de diagnóstico de la enfermedad
.
A pesar de todos los estudios preliminares, anteriores han demostrado que tumores neuroendocrinos muestran una CD45
- /CD56
+ fenotipo [32] - [35]; a su vez, las células tumorales de [35], mientras que los tumores neuroectodérmicos primitivos (PNET) coexpresan CD57 y CD99, así como CD56 [31], [34], [36] neuroblastoma coexpress GD2 - [38], y las células tumorales del rabdomiosarcoma son miogenina
+ [31], [39] - [41]. A pesar de esto, la especificidad de estos fenotipos entre los distintos subtipos de tumores sólidos pediátricos aún debe ser establecida, y ningún estudio ha informado hasta el momento, en el que un panel amplio de marcadores dirigidos a la detección de diagnóstico, diagnóstico diferencial y clasificación de los distintos tipos de tumores pediátricos, se han propuesto y evaluado.
a continuación, se evaluó un nuevo panel integral MFC de marcadores para el diagnóstico de detección de cáncer pediátrico y la asignación correcta de los tumores sólidos pediátricos a entidades patológicas específicas.
materiales y Métodos
pacientes y muestras
Un total de 52 muestras de 40 pacientes sospechosos de cáncer pediátrico -21 varones (52,5%) y 19 mujeres (47,5%) - se recogieron entre noviembre de 2009 y diciembre de 2011, en tres centros distintos: Instituto de Puericultura y Pediatría Martagão Gesteira /Universidade Federal do Rio de Janeiro (IPPMG /UFRJ) y Servidores del hospital do Estado (HSE), ambos de Río de Janeiro (Brasil), y el hospital de Clínicas /Universidade Federal do Paraná (HC /UFPR) en Curitiba (Brasil). mediana de edad fue de 5 años (rango: 1-14 años). La mayoría de las muestras (48/52; 92,3%) fueron analizados en el diagnóstico
En todos los casos, el diagnóstico definitivo y la clasificación se estableció en base morfológica y los análisis inmunohistoquímicos realizados en un laboratorio de referencia, a raíz de la Organización Mundial de la Salud (OMS. ) criterios [42] - [44] Treinta y un pacientes (78%) tenían cáncer, de los cuales 17 (55%) mostraron enfermedad metastásica; los 9 niños restantes (23%) tenían enfermedades inflamatorias /reactivas. De acuerdo con el diagnóstico histopatológico /inmunohistoquímica, 11 pacientes (12 muestras) tenían neuroblastoma, 3 (4 muestras) tuvo rabdomiosarcoma, 2 (2 muestras) de un tumor neuroectodérmico primitivo (PNET), 8 (9 muestras) tenían linfoma, 2 (2 muestras) Los tumores de Wilms, 2 (3 muestras) tumores de células germinales, y un paciente tenía un carcinoma suprarrenal, uno un carcinoma nasofaríngeo, y uno un hemangioperycitoma; las otras 17 muestras correspondían a 9 muestras reactivas y 8 muestras de pacientes con enfermedades neoplásicas que no mostraron infiltración tumoral. El origen específico de los especímenes se detalla en la Tabla S1.
Declaración de Ética
El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de los hospitales IPPMG y HSE y se obtuvieron muestras después de consentimiento informado fue dado por los niños y sus padres o tutores, de acuerdo con el protocolo Declaración de Helsinki. Los padres /tutores siempre que su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio y este consentimiento informado escrito fue aprobado por los comités de ética locales.
Preparación de muestras de tejidos y fluidos corporales
Las muestras de tejido libre de grasa y el tejido necrótico (peso medio: 144 mg; rango: & lt; 3 a 3.600 mg) se recogieron en la unidad quirúrgica. Ellos fueron evaluados directamente por un patólogo experimentado, y se dividieron en dos bloques contiguos. Un bloque se fijó en formalina, incluidas en parafina y se procesaron para la histopatología de rutina, mientras que el otro se colocó en solución salina fría tamponada con fosfato (4 ° C) (PBS; pH = 7,4) para los análisis de más de citometría de flujo. La muestra después se pesó, se colocó en una placa de Petri con PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino (BSA; Calbiochem, La Jolla, CA), picado en trozos pequeños (2-4 mm) con una hoja de bisturí y mecánicamente desglosados con dos estéril agujas; después, se filtró a través de una jeringa estéril Filcon (100 micras de tamaño de poro) para eliminar grupos de células y los desechos, se centrifugó (10 min a 540 g) y se resuspendió en PBS que contenía 1% de BSA a una concentración final de 10
6 células /mL. Después, la muestra se tiñó inmediatamente para MFC inmunofenotipo. La médula ósea (BM) y otras muestras de fluidos corporales se tiñeron directamente o después de una etapa de centrifugación (por ejemplo, orina), como se describe a continuación.
multiparámetro Citometría de Flujo Los estudios inmunofenotípico
Cada muestra se tiñó con las siguientes combinaciones de anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo (MAbs) - isotiocianato de fluoresceína (FITC) /ficoeritrina (PE) /PE-cyanin7 (PECy7) /peridinina proteína-Cy5.5 clorofila (PerCP-Cy5.5) /aloficocianina (APC) /APC-Hilite7 (APC-H7) /azul del pacífico (PACB) /naranja pacífico (PACO) - dedicado a la identificación simultánea de las células tumorales y normales B- /reactivo y linfocitos T, monocitos y neutrófilos: i) citoplasmática (Cy) MPO /
CyCD79a /CD19 /CD34 /CD7 /membrana de superficie (Sm) CD3 /
CYCD3 /CD45 [45]; ii) la inmunoglobulina de membrana CD8-superficie (
SmIg) λ /CD56-sIgκ /- /CD19 + CD4 /CD3 /- /CD20 /CD45 (panel de la orientación en la Tabla S2). Siempre que se detectaron células tumorales sospechosas siguiendo la estrategia gating ilustra en la figura 1, una mayor caracterización fenotípica de estas células tumorales sospechosas se realizó con paneles de caracterización de distintas dependiendo de la naturaleza de las células: no hematopoyético vs B vs T vs otras células hematopoyéticas (Tabla S2). Se realizó tinción de las células de los tejidos sólidos o BM, sangre periférica (PB) y otros fluidos del cuerpo como se ha descrito previamente en detalle [46], [47]. Brevemente, las muestras (50 l por tubo) se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad, en presencia de 3 a 20 l de cada uno de los anticuerpos monoclonales anteriormente mencionados (MAb), de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes. Después, se diluyeron 2 ml de solución de lisis FACS (Becton Dickinson) 01:10 (v /v) en agua destilada se añadieron, y las muestras se incubaron durante otros 10 min bajo las mismas condiciones que las mencionadas anteriormente, con el fin de lisar no glóbulos rojos -nucleated. Entonces, se centrifugaron las células (5 min a 540 g) y el sedimento celular se lavó dos veces con 4 ml de PBS. Finalmente, las células se resuspendieron en 0,5 ml de PBS. Para la evaluación de citoplasmática (Cy) o antígenos nucleares (NU), se fijaron las células, inmediatamente después de que se incubaron con el mAb dirigido contra marcadores de membrana de la superficie celular (véase más arriba); entonces, se permeabilizaron y se tiñeron con MAb dirigido contra los antígenos citoplasmáticos y /o nucleares, utilizando el Fix & amp; kit de reactivos Perm (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), siguiendo estrictamente las recomendaciones del fabricante. Para no conjugado MAb, después de la incubación con los anticuerpos monoclonales específicos, una etapa de lavado seguida por una segunda etapa de incubación con una IgG anti-ratón de reactivo conjugado con FITC (CYTOGNOS SL, Salamanca, España), se llevó a cabo (15 min) en la oscuridad. Con el fin de confirmar la especificidad de los marcajes, un control negativo con una muestra no marcado se llevó a cabo sistemáticamente en paralelo. Las células teñidas fueron adquiridos a baja velocidad en un flujo FACSCanto II citómetro -Becton /Dickinson Biosciences (BD), San José, CA, EE.UU., - utilizando el software FACSDiVa (BD). Todos excepto dos muestras se procesaron en las primeras 4 horas después de la cirugía. Para el análisis de datos se utilizó el programa de software Infinicyt ™ (CYTOGNOS SL). se utilizó la expresión de antígenos para identificar los diferentes tipos de células presentes en la muestra y cada población de células identificadas se clasificó como negativo (-), dim positivo (+ LO), positivo intermedio (+) y fuertemente positiva (+ hi) usando arbitraria intensidad relativa de fluorescencia lineal media (MFI) valores de 10
0-10
2, 10
2-10
3, 10
3-10
4, & gt; 10
4, respectivamente, en función de los valores de MFI observados vs niveles de línea de base de autofluorescencia se encuentran en el tubo de control; la expresión de antígenos para un determinado marcador fue descrito como heterogénea, cuando se detectaron niveles de expresión variables para ese marcador dentro de una población de células.
En el panel A, que ilustra un ejemplo de la estrategia de disparo y las combinaciones de dos variables gráfico de puntos utilizados para se muestra la identificación de células tumorales CD45-, células del estroma residual CD45- (por ejemplo, células endoteliales y células mesenquimales) y la infiltración de células hematopoyéticas (por ejemplo, neutrófilos, células B y T). A su vez, en los paneles B a J el perfil inmunofenotípico de las células tumorales CD45- de un neuroblastoma (paneles B y H), un PNET (paneles C y I) y un rhabdomyossarcoma (paneles D y J) del tumor se muestran junto con imágenes representativas de los perfiles histophathological e inmunohistoquímicos de los mismos tumores teñidos con hematoxilina & amp; eosina además cromogranin (células de neuroblastoma en el panel E), CD99 (células PNET en el panel F) y
(nu) miogenina (células rhabdomyossarcoma en el panel G).
Exclusión de tumor no viable Las células se basó en su avance inferior (FSC) y sideward (SSC) características de dispersión de luz; la viabilidad celular mediana de las muestras de tejido fue de 75%. En 19/33 (57,5%) de muestras de tejidos sólidos, tinción paralelo con yoduro de propidio (PI, Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) se realizó para evaluar la viabilidad celular, & gt; 90% de las células muertas de la PI-manchado correspondiente sistemáticamente a los eventos que fueron excluidos como las células no viables en la puerta FSC /SSC
histológicos y análisis inmunohistoquímicos
examen histopatológico se realizó en hematoxilina /eosina (H & amp; e). secciones de tejidos teñidos ( 3 m). En todas las muestras que se sospechaba la infiltración tumoral y /o detectadas, las secciones de tejidos también se tiñeron por inmunohistoquímica convencional para el CD99, nuclear
(nu) MYOD1,
(nu) myogenin, sinaptofisina, cromogranina, NSE, LCA, CD20, CD19, CD10 y Ki67 marcadores. Los cortes teñidos fueron evaluados de forma independiente por dos patólogos experimentados. Para BM, PB y las muestras de orina, se realizó un análisis citológico convencional.
Métodos Estadísticos
Con el fin de establecer la significación estadística de las diferencias observadas entre los grupos, se utilizó la prueba de Mann-Whitney ( las variables continuas; programa de software SPSS, versión 18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). El número de verdaderos positivos (TP; muestras con la presencia de una población de células tumorales como se detecta por ambas técnicas de diagnóstico convencionales y citometría de flujo), verdadero negativo (TN; muestras sin población de células tumorales, según lo determinado por los enfoques convencionales y citometría de flujo) , falsos positivos (FP; muestras con la presencia de una población de células tumorales mediante citometría de flujo no detectada por los métodos de referencia) y falsos negativos (FN; muestras con células tumorales indetectables por citometría de flujo, pero positivo por los enfoques de referencia), fueron calculado. La sensibilidad y especificidad fueron definidos como TP /TP + FN y TN /TN + FP, respectivamente, mientras que el positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN) se calcularon como TP /TP + FP y TN /TN + FN, respectivamente.
Resultados
Diagnóstico diferencial entre reactiva /no infiltrada y tumor /muestras infiltradas
Con base en el panel de selección (panel 1 en la Tabla S2), 9/52 muestras (17 %) correspondió a muestras reactivas; otras 8 (15%) muestras obtenidas de pacientes con cáncer con fines de ensayo o de seguimiento de la enfermedad, también fueron negativos para malignidad. Todas las otras muestras (n = 35; 68%) mostraron infiltración por las células tumorales. La tasa general de concordancia entre MFC e histopatológico convencional, inmunohistoquímica y /o procedimientos de diagnóstico citológico fue de 96% (50/52 muestras). En detalle, se alcanzó un acuerdo de 100% para las 17 muestras reactivas /inflamatorias y no infiltrados, mientras que una tasa de concordancia del 94% (33/35 muestras) se logró mediante el MFC para muestras de tumor infiltrado. Las dos muestras de tumores que fueron mal clasificados por MFC correspondieron a muestras infiltradas por células de linfoma de Hodgkin y el linfoma anaplásico de una, respectivamente. Todas las muestras infiltradas por tumores sólidos y B- o linfomas de células T se identificaron correctamente (Tabla 1). Por lo tanto, se alcanzó un rendimiento global del 96% (100% de especificidad y sensibilidad del 94%) (VPP del 100% y un VPN del 90%). La composición celular de ambas muestras no infiltradas reactivos /inflamatorias y otras se muestra en la Tabla S3, mientras que se muestra la distribución de las células del estroma (inflamatoria, células endoteliales y fibroblastos /mesenquimales) en 14/26 muestras que contenían tumores sólidos no hematopoyéticas en la Tabla S4.
identificación de linfoma
Versus
no hematopoyéticas células tumorales
Un total de 35 muestras (de 31 pacientes) contenía células tumorales en base a la grupo de selección (panel 1 en la Tabla S2) y los paneles de caracterización (paneles de 2 a 5 de la Tabla S2). De ellos, 9 corresponden a las células hematopoyéticas malignas y 26 a los tumores sólidos no hematopoyéticas. En los dos casos de linfoma de falsos negativos, un rico infiltrado de linfocitos policlonal fue observada por MFC, sin una población de células tumorales claramente definido. A su vez, todos los casos de linfoma de células B (5/5) pueden distinguirse fácilmente de tumores sólidos pediátricos con el panel de detección 1 (Tabla S2) por la expresión de marcadores de células B (CD19
+, cyCD79a
+ , CD22
+) en asociación con CD45
+ LO o CD45
+, mientras que estos marcadores fueron sistemáticamente ausente en los 26 tumores sólidos pediátricos. Con el panel de la caracterización de células B (panel 3 de la Tabla S2) tres muestras de linfoma de células B mostraron membrana superficial
restricción de cadena ligera (Sm) Ig (2 casos
SmIgλ
+ y uno
SmIgκ
+) junto con un Tdt
+, CD20
+ hola, CD38
+ hola, CD10
+ hola, cyBcl2
- inmunofenotipo que es muy característico de linfoma de Burkitt infantil, excepto para la expresión TdT. Los otros dos tumores de células B se presenta con un CD45
+ he aquí, CD19
+, CD20
-, CD22
+, CD10
-, CD38
+, CD58
+, CD81
+, CD9
+
SmIg
-
CyIgμ
- fenotipo compatible con LLA de células B linfoma linfoblástica aguda (BCP-ALL) tanto por MFC y la histopatología. A su vez, 2 muestras de linfoma de células T podían distinguirse fácilmente de ambos tumores sólidos pediátricos y los linfomas de células B con el panel de selección (panel 1 en la Tabla S2) en función de su CD45
+ he aquí
SmCD3
+ hete
CYCD3
+ fenotipo; Además, estas células también mostraron una CD4
+, CD8
-, CD1a
+, CD99
+, CD2
+, CD5
+, CD27
+, CD71
+ y CD81
+ perfil fenotípico, que carece de CD7
-, CD117
- y los marcadores de células B una vez que los paneles de selección y caracterización adecuadas (paneles 1 y 4 de la Tabla S2, respectivamente) usado. Los 26 tumores sólidos no hematopoyéticas analizados fueron negativos para todos los B y las células T específicas de antígenos investigados con el panel de selección (panel 1 en la Tabla S2), y eran CD45
-. Veintidós de estos últimos casos (84%) expresaron CD56
+, junto con patrones variables de expresión de otros marcadores asociados con diferentes tejidos no hematopoyéticos, que estaban incluidos en el panel de la caracterización de tumores sólidos (panel 2 Cuadro S2) como se describe a continuación
inmunofenotípico Caracterización de las células tumorales no hematopoyéticas
Casi la mitad de los tumores no hematopoyéticos correspondían a neuroblastoma. (12/26; 46%). Mostraron una población uniforme de CD45
-, CD56
+, CD9
+, CD81
hola, GD2
+ células tumorales con expresión heterogénea de CD57
- /+ y CD58
+ /++; CD90 fue positiva en todos menos un tumor, mientras que CD271 se expresaba parcialmente en un único tumor (Tabla 2). Curiosamente, el único tumor ganglioneuroblastoma analizados mostraron dos poblaciones claramente diferentes de células tumorales: 39% tenían un inmunofenotipo idéntica a la de los otros neuroblastomas, mientras que las células restantes (61%) muestran mayor dispersión de la luz (FSC y SSC) y una mayor expresión de CD56, CD81 y CD57. Ninguno de los otros marcadores de la prueba (por ejemplo, CD99, CD38, CD19, CD20,
CyCD79a, CD34,
numyogenin,
nuMYOD1) fue expresada por células de neuroblastoma. De todos los tumores, neuroblastoma fue el único GD2
+ neoplasia hi, al mismo tiempo que también mostró niveles más altos CD56 por célula (Tabla 2; Figuras 1 y 2). Aunque los tumores PNET mostraron un fenotipo que se parecía a la de neuroblastoma (CD45
-, CD56
hola, CD90
+, CD9
+, CD81
+
nuMYOD1
- ,
numyogenin
- en ausencia de B, T y marcadores de asociación mieloide), que fueron negativos para GD2, a excepción de uno con baja expresión en una pequeña población del tumor del 48%, y mostraron una expresión más fuerte de CD99
hI y CD271
hi (Tabla 2, las figuras 1 y 2)
Panel A:. mapa de calor que resume la intensidad y el patrón de expresión de diferentes marcadores de diagnóstico en subtipos distintos de tumores sólidos pediátricos basado en la intensidad de fluorescencia media por nivel /célula. Panel B: Comparación de la expresión de intensidad media de fluorescencia de los marcadores individuales por /célula en diferentes subtipos de la OMS de tumores sólidos pediátricos. Las cajas se extienden desde el 25 al percentiles 75, las líneas en el centro representan los valores medios, mientras que las líneas horizontales corresponden a los intervalos de confianza del 95%.
A partir de los mismos paneles de detección y caracterización (paneles 1 2 y en la Tabla S2, respectivamente), los cuatro rabdomiosarcomas (RMS) mostraron una específica
nuMYOD1
hola,
numyogenin
hi fenotipo. Por otra parte, los casos de RMS también eran CD45
-, CD56
+ he aquí, CD90
+ y CD57
-; dos expresaron CD81
+, CD9
+ y CD58
+ y uno fue parcialmente positivo para CD99 (40% de las células tumorales), un patrón fenotípico que era específico para este subtipo de tumor (Tabla 2; Figuras 1 y 2)
Las 8 muestras tumorales restantes correspondieron a 5 subtipos distintos de tumor (tumor de Wilms, 2 casos;. tumor de células germinales, 3; carcinoma suprarrenal, carcinoma nasofaríngeo y hemangiopericitoma, un caso cada uno). la expresión de EpCAM fuerte estaba restringida a los dos carcinomas, mientras que las células HEMANGIOPERICITOMA eran la única que muestra CD34
+ hi expresión; ambos grupos de tumores carecían sistemáticamente CD45, B- y los marcadores de células T (Tabla 2; las Figuras 1 y 2). A su vez, todos los tumores de células germinales presentan con un CD45 distinta
-, CD56
+, CD10
+, CD38
-, CD19
-, CD22
-, NG2
+ fenotipo, a excepción de CD10 y NG2 que fueron negativos en 1/3 de los casos (Tabla 2 y Figura 2). Por el contrario, los dos tumores de Wilms mostraron dos (coexistentes) poblaciones de células tumorales claramente diferenciadas con un CD56 común
+ y CD58
+, CD45
-, CD99
-, GD2
-
nuMYOD1
-,
numyogenin
-, CD10
- y NG2
- fenotipo, pero la reactividad distinta (negativo frente a la expresión positiva) para CD90, EpCAM y CD57 (Tabla 2; Figuras 1 y 2).
en general, estos resultados muestran que los subtipos de tumores pediátricos distintas se asociaron con fenotipos únicos y específicos.
NuMYOD1 y
expresión numyogenin se restringió a RMS (Figura 1J; Figura 2), CD99 se expresa en niveles significativamente más altos en PNET y una subpoblación de RMS (embrionario) (Figura 1I; Figura 2), mientras que una fuerte reactividad para GD2 era específico para el neuroblastoma (Figura 1H; Figura 2), y un CD34
hi CD45
- fenotipo se limita al caso hemangiopericitoma estudiados (Figura 2). Otros marcadores menos específicos, tales como CD56, CD9, CD57, CD81, CD99 también contribuyeron a algunos diagnósticos diferenciales, por ejemplo, la distinción entre el neuroblastoma y el RMS (CD56, CD57, CD81) y entre ambos PNET y RMS (CD9) y el neuroblastoma (CD99, CD56, CD81 y CD57) (Figura 1I-J; Figura 2)
Discusión.
cáncer pediátrico se deriva principalmente de precursores linfoides tempranas y mesenquimales y precursores neuroectodérmicos embrionarias, que pueden mostrar patrones morfológicos e histopatológicos similares [3], [5] - [7]. En consecuencia, el diagnóstico de la mayoría de los tumores pediátricos con frecuencia requiere una caracterización adicional de las células neoplásicas en, por ejemplo, motivos de inmuno /inmunofenotípicas. A su vez, el diagnóstico rápido de estos casos es crucial, ya que influye directamente en el proceso de toma de decisiones de tratamiento y los resultados del paciente [2], [3]. Por lo tanto, la disponibilidad de técnicas rápidas de la pantalla precisamente por el linaje de células tumorales y establecer los diagnósticos diferenciales relevantes, son en su mayoría de bienvenida.
Hasta ahora, se han reportado pocos estudios que evalúan la utilidad de MFC immunophenotyping para el cribado diagnóstico y subclasificación de tumores sólidos pediátricos [11] - [13], [27] - [28], [31], [35] - [39], [41], [48] - [51] Cabe destacar, una relativamente baja (59%) tasa de concordancia entre el inmunofenotipo de las muestras con aguja fina aspirados por citometría de flujo y análisis citológicos convencionales se ha informado, debido a la baja celularidad de la muestra [36]. Curiosamente, aquí se obtuvieron suficientes células viables en cada muestra analizada mediante el uso de procedimientos de desagregación mecánicas de las muestras obtenidas recién y procesados, apoyando la noción de que la desagregación mecánica mantiene la expresión del antígeno junto con una viabilidad celular aceptable [16] - [18], [52 ].
Es de destacar que ninguna de las muestras clasificadas como reactivo /inflamatoria por criterios citológicos /histopatológico fue diagnosticado erróneamente como cáncer por MFC. A su vez, todas las muestras tumorales, sino dos muestras de linfoma poco común, fueron identificados como que contiene tumor por MFC. Los dos casos negativos falsos observados podría ser debido a la falta de marcadores específicos para células de linfoma anaplásico (por ejemplo, CD30) en nuestro panel de detección (panel 1 en la Tabla S2) Reed-Stenberg y y la relativamente baja frecuencia y /o la viabilidad de estas células en suspensiones de células individuales. inclusión prospectiva de marcadores adicionales (por ejemplo, CD30) en el panel de selección para la identificación de estas células potencialmente puede superar esta limitación [53], [54].
En los pacientes pediátricos, MFC se ha aplicado principalmente al estudio de muestras de PB y BM de pacientes sospechosos de padecer leucemia aguda. A pesar de esto, los primeros estudios en pacientes con neuroblastoma ya mostraron infiltración BM por CD45
- /CD56
+ células tumorales, en ausencia de proteínas que denotan compromiso hematopoyéticas [29], [33]. Debido a la relativamente alta frecuencia de afectación metastásica BM en el neuroblastoma, esto es, con mucho, el tumor pediátrico no hematopoyético mayormente estudiada por MFC. De hecho, el fenotipo de células de neuroblastoma ha sido evaluado en recurrente (3- o 4-color) solo o multicolor combinaciones de anticuerpos tanto en BM y muestras de tejido del tumor [35], [48] - [51], [55]. Sin embargo, la mayoría de estos estudios se dirigen a evaluar los niveles de enfermedad residual mínima en el BM de pacientes con neuroblastoma, sin explorar la utilidad de immunophenotyping para el cribado diagnóstico y diagnóstico diferencial de neuroblastoma
vs.
Otros tumores pediátricos, como completada aquí
de todos los marcadores evaluados hasta el momento en los tumores sólidos pediátricos, CD56 (NCAM) ha sido investigado con mayor frecuencia [31] -. [34]. Curiosamente, CD56 se expresa por la mayoría de los tumores sólidos pediátricos [37] - [39], [51], que también se encuentran en nuestros casos. Sin embargo, la cantidad de expresión de CD56 variar en gran medida entre los diferentes subtipos de tumores. Neuroblastoma y PNET eran aquellos tumores que muestran los más altos niveles de CD56, el apoyo a la utilidad de CD56 tanto discriminar no hematopoyético vs. neoplasias hematopoyéticas [31], [34], y para el diagnóstico diferencial entre distintos subtipos de CD45
- no hematopoyéticas tumores sólidos pediátricos. Del mismo modo, varios estudios han evaluado la utilidad de CD81 y CD9 (junto con CD45
- y CD56
+), para la discriminación entre las células de neuroblastoma y células hematopoyéticas BM, con fines de estadificación [13], [48] - [49], [55], sin extender este análisis a otros subtipos de tumores sólidos pediátricos. Entre nuestros casos, CD81 y CD9 mostraron un patrón variable y heterogénea de la expresión con utilidad limitada como marcadores individuales, en el diagnóstico diferencial entre neuroblastoma y otros tumores pediátricos. Sin embargo, una vez que se combina con otras moléculas, CD81 contribuyó a la discriminación de neuroblastoma y PNET. A pesar de esto, GD2 y CD271 fueron los dos marcadores más útiles para diferenciar entre neuroblastoma (GD2
+ CD271 hi
- /Lo) y PNET (GD2
- /lo CD271
+ hi). En general, estos resultados apoyan la idea de que CD271
expresión hi identificado en PNET puede estar asociado con el origen de células madre mesenquimales de estos tumores [56]. Curiosamente, en el único paciente neuroblastoma que mostraron CD271
- /+ Mín células tumorales, la expresión de CD271 se restringió al tumor primario, mientras que negativa en células BM metastásicos; esto podría ser debido a un grado diferente de maduración de las células del tumor en ambos sitios, la ausencia de CD271 estando asociado con un comportamiento más inmaduros y agresivo tumor [57] - [58]. De nota, CD99 fue también altamente expresado en PNET, mientras que típicamente negativo en los otros tumores, lo que sugiere que, además de CD271, CD99 también puede contribuir al diagnóstico de PNET.
Pocos estudios inmunofenotípicos MFC de RMS tener han reportado hasta el momento. De acuerdo con nuestras observaciones de estos estudios mostraron que RMS células suelen mostrar una CD45
-, CD56
+, CD90
+
numyogenin
+ fenotipo con expresión variable de CD57, desmina, vimentina y CD99 [31], [36], [39], [41].