Extracto
En el cáncer de colon, una enfermedad muy agresiva, progresión a través de la secuencia maligna se acompaña de numerosas reordenaciones cromosómicas cada vez. Para colonizar órganos diana, las células invasoras atraviesan varios tejidos de diversos módulos elásticos. Si el aumento de tejidos blandos malignidad o en los límites de contraste de células de colon invasivo difusión sigue siendo una pregunta abierta. El uso de películas multicapa polielectrolito que imitan microambientes de diferentes módulos de elasticidad, que reveló que las células de cáncer de colon SW480 humano muestran cada vez más frecuentes en las anormalidades cromosómicas segregación cuando se cultivan en sustratos con la disminución de la rigidez. Nuestros resultados muestran que, a pesar de la disminución de la rigidez se correlaciona con el aumento de la letalidad celular, una proporción significativa de las células cancerosas SW480 escapó de los sustratos muy suaves, incluso cuando se lleva la segregación cromosómica anormal, lograr la mitosis y se someten a un nuevo ciclo de replicación en contraste con colon humano células HCoEpiC fallecidas en sustratos blandos. Esta observación abre la posibilidad de que la capacidad de las células cancerosas para superar los defectos de la segregación de cromosomas en sustratos muy blandos podría contribuir al aumento de reordenamientos cromosómicos y agresividad de las células tumorales
Visto:. Rabineau M, Kocgozlu L, Dujardin D, Senger B, Haikel Y, Voegel JC, et al. (2013) Contribución de los sustratos blandos a la malignidad y la supresión tumoral durante la división celular del cáncer de colon. PLoS ONE 8 (10): e78468. doi: 10.1371 /journal.pone.0078468
Editor: Thomas Claudepierre, Facultad de Medicina de la Universidad de Leipzig, Alemania |
Recibido: 15 Abril, 2013; Aceptado: September 13, 2013; Publicado: 22 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Rabineau et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado por una beca de Alsacia Contra el cáncer. M. R. está en deuda con la Faculté de Cirugía Dentaire de Estrasburgo de apoyo financiero. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Durante los últimos 10 años, se ha hecho evidente que el comportamiento de las células no sólo depende de las señales químicas, sino que las propiedades mecánicas del entorno celular juega un papel tan importante. Esto fue espectacularmente demostrado por los experimentos de señal del grupo de Discher que mostraron que las células madre mesenquimales pueden o bien diferenciarse en osteoblastos, fibroblastos o las neuronas dependiendo del módulo de Young del sustrato de adhesión [1]. También es bien aceptado que diferentes tipos de células necesitan sustratos de diferentes módulos jóvenes a adherirse y proliferar correctamente. Los osteoblastos requieren módulos jóvenes en el rango de MPa a adherirse mientras que los fibroblastos se adhieren en sustratos blandos cuyos módulos de aproximadamente 10 kPa [2] y las neuronas crecen sobre sustratos extremadamente suaves de alrededor de 1 kPa [1]. Estos valores característicos son de acuerdo a los módulos de Young que caracterizan a los tejidos que rodean a estos diferentes tipos de células. Estos resultados son de gran importancia por ejemplo en la ingeniería de tejidos para diseñar andamios que permiten un crecimiento apropiado de las células o en la integración del implante. Sin embargo, la adhesión no es el único aspecto que caracteriza el comportamiento de las células: la división celular también es un aspecto crucial para el destino celular. Nuestro grupo comenzó recientemente para examinar la influencia de las propiedades mecánicas del sustrato sobre la división celular [3]. Estos datos pusieron de relieve que las propiedades mecánicas del sustrato desempeñan un papel fundamental en la segregación cromosómica durante la mitosis de las células epiteliales. De hecho, se observó un aumento progresivo de las anomalías de segregación cromosómica con la disminución de la rigidez del sustrato en las células de riñón de rata canguro no cancerosas PtK2 [3]. Por otra parte, los sustratos blandos (por debajo de 50 kPa) se describe como una barrera física microambiente inhibir casi por completo las células PtK2 [3].
En los últimos años, se ha establecido que la progresión influencias rigidez del tejido del tumor y pueden promover el comportamiento maligno [4-6]. Mediante la introducción de células de cáncer en matrices de fibrina 3 dimensiones, Liu et al. mostraron que las matrices blandos del módulo de Young de 100 Pa promovieron el crecimiento de colonias circulares con el aumento de la agresividad cuando xenoinjertado en ratones inmunodeficientes [7]. Muy recientemente, Tang et al. puesto de manifiesto la atenuación de mechanosensitivity celular de las células tumorales cuando se cultiva en sustratos blandos [8]. En el cáncer de colon, una enfermedad muy agresiva, progresión a través de la secuencia maligna se acompaña de aumento de reordenamientos cromosómicos [9-12]. Para colonizar órganos diana, las células invasoras cruzan varios tejidos de diversos módulos de elasticidad (como ejemplo, 175, 918, 320, 120 y 640 Pa para la membrana basal, estroma, linfa, ganglios linfáticos y el hígado, respectivamente) [2,4] y, mientras que la mayoría de estas células mueren durante el viaje, pocos se resisten y puede generar metástasis [13]. Si el aumento de tejidos blandos malignidad o en contraste límites propagación de células invasoras sigue siendo una pregunta abierta. Uso de las películas multicapas de polielectrolitos (PEM) [14-18], que reveló que las células de cáncer de colon SW480 humano muestran el aumento de frecuencia en las anormalidades cromosómicas de segregación cuando se cultivan en sustratos con la disminución de la rigidez (Figura 1) y [3]. En el presente trabajo, nos informan de que los sustratos con la rigidez de 50 kPa y menor causa la muerte masiva de células mitóticas, pero que pocas células a resistir y lograr la mitosis mediante la superación de la segregación cromosómica anormal. Para este propósito, las células SW480 sincronizadas se sembraron en una serie de películas hechas de un ácido hialurónico /poli-L-lisina (PLL /HA)
24 estrato coronada por poli (estireno) sulfonato /polialilamina (PSS /PAH)
n
estratos (
n
= 0, 1 y 2; el aumento de
n
aumenta la rigidez del sustrato [19]) y seguido de imágenes de células vivas.
Prueba exacta de Fisher muestra la proporción de E
50 (18 células con anomalías cromosómicas en 121 células analizadas) es significativamente diferente que la de vidrio (6/153,
p Hotel & lt; 0,003), y la proporción de e
20 (14/78) es significativamente diferente que la de vidrio (
p
& lt; 0,001). Las barras de errores representan los intervalos de confianza del 95%.
Resultados y Discusión
1. Influencia del sustrato blando en la mitótico progresión tumoral
Para determinar si las células tumorales son capaces de progresar a través de la mitosis en sustratos muy suaves, células SW480, sincronizado con el método de agitación en off mitótico, se sembraron en películas PEM con la disminución rigidez (módulos joven decrece de 50 a 0 kPa, Tabla 1) y seguido de imágenes de células vivas durante 2h30. Las películas se componen de un (PLL /HA)
24 estrato coronada por un segundo (PSS /PAH)
n
estrato (
n
= 0, 1 y 2 ). Un ejemplo típico de confocal sección z observación de una película compuesta de PLL /HA estrato y PSS /PAH se muestra capping en la Figura 2. A pesar de que la química de la superficie del vidrio y de las multicapas de polielectrolitos es diferente, hemos demostrado en un trabajo previo que la cantidad de proteínas de FBS depositado sobre la superficie no depende ni de la química de la superficie ni en el número de capas que constituyen la película multicapas de polielectrolitos [16]. Además, las células se sienten esencialmente las proteínas del suero que se adsorben en la superficie antes de la deposición celular. Por lo tanto el principal parámetro que cambia entre el vidrio, E0 y E50 /E20 es la rigidez y debe estar en el origen de las diferencias en el comportamiento celular observados en nuestro sistema. En E
0, las células fueron rápidamente a través de un proceso lítico, como se indica por la liberación de citoplasma en el medio de cultivo se observa en 100% de los casos (Figura 3A, punta de flecha en la fila E
0, Película S1). Sin embargo, en E
50 y E
20 sustratos, el seguimiento de la segregación de cromosomas, la descondensación de ADN y la citocinesis (Figura 3A y de la película S2-S4) revelaron que, respectivamente, 60% y 10% de las células fueron capaces de lograr mitosis en 2h30 (Figura 3C). El resto de las células, ya sea Lyse (18% en E
50 y 88% en E
20) o se mantiene bloqueado en la mitosis (22% en E
50, y 2% en E
20). Tilghman et al. mostraron que las células cancerosas cultivadas en substratos de gel de poliacrilamida suaves mostraron un ciclo celular más largo, debido a una prolongación de la fase G1 del ciclo celular, en comparación con las células cancerosas que crecen en sustratos más rígidos [20]. Con el fin de demostrar que la proporción significativa de células SW480 capaz de progresar en la mitosis en E
50 estaba relacionado con la naturaleza de estas células cancerosas, su comportamiento se compararon con los de las células no cancerosas epiteliales de colon humanas HCoEpiC. La producción de células mitóticas por HCoEpiC shakeoff mecánico se reduce considerablemente. Por lo tanto, se utilizaron cultivos de células estándar HCoEpiC asincrónica para investigar la influencia de E
50 en las células epiteliales de colon humanas. Los resultados muestran que después de 6 h de la cultura en E
50, asíncrono células HCoEpiC adoptaron una morfología en forma redonda (Figura 4A) a diferencia de la forma de propagación de estas células observadas en el vidrio (Figura 4A). En E
50, las células HCoEpiC pasaron por un proceso lítico, como se indica por la liberación de citoplasma en el medio de cultivo en 100% de los casos (Figura 4A). Algunas de estas células mostraron fragmentación de su núcleo sugiriendo la muerte por apoptosis (Figura 4C). Consistente con estas observaciones, no ensamblaje de microtúbulos y los filamentos de actina se pudo observar por los experimentos de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos para la α-tubulina y la faloidina (Figura 4C). Todas las células en interfase HCoEpicC murieron el E
50 (Figura 4B) revelan que estas células son evidentemente incapaces de progresar en el ciclo celular y volver a entrar en la mitosis. Podemos señalar que se llevaron a cabo nuestros estudios sobre sustratos con módulos joven en el intervalo de 1-50 kPa y se observó que las células no cancerosas no pueden sobrevivir en este tipo de sustratos blandos. Este resultado parece a primera vista contradictoria con la observación de la división celular en el colon, cuyo módulo de Young es de 2 - 25 kPa [21]. Sin embargo, en el colon son células en un tejido 3D especializado con contactos celular /celulares que influyen decisivamente en el comportamiento celular. Tal efecto no se reproduce en nuestra 2D experimentos in vitro. Sin embargo, nuestro modelo in vitro es más apropiado para las células tumorales individuales o pequeños grupos de células que escapan de la masa tumoral para invadir el estroma y participar en el proceso que conduce a la formación de metástasis después de un largo viaje a través de los tejidos de muy diferentes módulos jóvenes. En conjunto, nuestros resultados muestran que la disminución de la rigidez se correlaciona con un aumento de la letalidad celular in vitro para saludable, así como las células cancerosas. No obstante, es muy importante, se observó que algunas células cancerosas pueden escapar de sustratos muy suave y se puede lograr la mitosis. Estos hallazgos son muy importantes tanto para la homeostasis normal de los tejidos sólidos y para los ajustes patológicos.
Arquitectura
E
p (kPa)
a
notación gratis (PLL /HA)
24 ~ 0E
0 (PLL /HA)
24 - (PSS /PAH)
1 ~ 20E
20 (PLL /HA)
24 - (PSS /PAH)
2 ~ 50E
50Table 1. módulo elástico aparente de (PLL /HA)
24- (PSS /PAH)
n
con
n = 1 y
2.
Las películas fueron compuestas de un ácido /poli-L-lisina hialurónico (HA /PLL)
24 estrato coronada por un sulfonato clorhidrato segundo poli (estireno) /polialilamina (PSS /PAH)
n
estrato. Las películas se caracterizan por su módulo de Young (
E
p: módulo elástico aparente), determinado por microscopía de fuerza atómica experimentos nano-indentación, que se correspondería con el módulo de elasticidad real de la capa si se comportó estrictamente elásticamente. El módulo elástico de la nativa (PLL /HA)
24 arquitectura es de aproximadamente 0 kPa.
a Los valores tomados de [19]. Descargar CSV CSV
imagen de la sección vertical de un (PLL /HA)
23-PLL
FITC-HA-(PSS /PAH)
2-PSS
Rho-HAP película de capas múltiples observado por CLSM.
a) Después de la siembra de las células SW480 sincronizados sobre vidrio, e
50, e
20 y e
0, la imagen de lapso de tiempo se tomaron cada 5 minutos durante 2h30; se muestran imágenes representativas. La flecha indica la posición inicial de la célula mitótica. las imágenes fusionadas de fluorescencia (DNA en rojo) y de contraste de fase (en gris); barra de escala: 20 micras. B) la segregación de vigilancia por lapsos de tiempo de cromosomas en las células SW480 realizadas como se describe en A. Imágenes representativas de anomalías cromosómicas de segregación se muestran para E
50 y E
20; barra de escala: 10 micras. C) Porcentaje de células SW480 que completan la mitosis considerado en A, determinado sobre agruparon 2 experimentos independientes. Prueba exacta de Fisher muestra que la proporción de células que completan la mitosis en E
50 (46 células en 77 células en mitosis) es significativamente más pequeña de la proporción de vidrio (185/212,
p
& lt; 0,001) . La proporción de E
20 (16/161) es significativamente menor que en E
50 (
p
& lt; 0,001) y la proporción de E
0 (0/146) es significativamente menor que en E
20 (
p
& lt; 0,001). D) El porcentaje de células con cromosomas rezagados. En C, D, las barras de error representan intervalos de confianza del 95%
A) Imágenes representativas de células HCoEpiC Después de 6 h de la cultura en vidrio y en E
50, punta de flecha indica una célula lisada.; barra de escala: 50 micras. B) Porcentaje de células lisadas HCoEpiC considerados en A, determinado sobre agruparon 2 experimentos independientes. Fisher Exact prueba muestra la proporción de células lisadas en el vidrio (5/142) es significativamente menor que en E
50 (112/112,
p
& lt; 0,001). Las barras de error representan intervalos de confianza del 95%. Imágenes c) de fluorescencia de ADN, α-tubulina y actina después de 6 h de la cultura en E
50 a partir de células HCoEpiC fijos; barra de escala: 20 micras
2.. Comportamiento de las células tumorales que llevan anomalías segregación cromosómica
Foto de intervalo segregación cromosómica de vigilancia mostraron que las células SW480 sembradas en E
50 y el E
20 visualiza los cromosomas menos (Figura 3B, flechas) que indica defectos en mecanismos de segregación cromosómica. A finales de la telofase, los núcleos reformados y la citocinesis completado (Figura 3B, 3D y películas S5 y S6). Entre las células SW480 que progresan a través de la mitosis 4,8%, 11% y 13% mostraron anormalidades segregación de los cromosomas en el vidrio, E
50 y E
20, respectivamente. Estos resultados mostraron que a pesar de aumentar la frecuencia de anomalías inducidas por sustratos blandos, algunas células cancerosas SW480 son capaces de progresar a través de la mitosis. Lo cual es consistente con la observación hecha en sustratos rígidos que las células que tienen mecanismos de control de huso deficientes pueden proceder a través de la mitosis, incluso en presencia de cromosomas mal conectados al husillo [22].
3. El compromiso β1-integrina por las células tumorales de la mitosis en respuesta a sustratos blandos
Las interacciones con la matriz extracelular a través de las integrinas han demostrado que influyen en diferentes aspectos de la organización del huso mitótico [23,24]. En particular, es bien sabido que las células mitóticas se redondean en la preparación para la citocinesis y permanecen adheridas al sustrato a través de fibras de retracción a través de la participación de la integrina [25]. Las fibras de retracción proporcionan una fuerza resistiva que se propaga dentro de los microtúbulos para orientar el huso mitótico [23-26]. por tanto, se investigaron los efectos de la rigidez diferente sustrato sobre β1-integrina en las células SW480. En respuesta a los sustratos blandos (E
50 y E
20), compromiso β1-integrina se mide por los sitios de unión a ligando inducida por anticuerpos (beta 1-integrina LIBS activadas) usando conformacional específico se mantuvo sin cambios en comparación con el sustrato de vidrio (figura 5A-C, el carril de MAPK corresponden a controlar la carga). Curiosamente, estos datos están en contraste con un estudio anterior utilizando células PtK2 no tumorales que muestran progresivamente disminuye de compromiso β1-integrina en sustratos blandos [3]. Estas observaciones están de acuerdo con otros estudios que demuestran que las células de cáncer de mama murino conservan altos niveles de activos β1-integrina después de 24 horas de cultivo sobre un sustrato blando [27]. la acumulación de la integrina en la célula zona media también es necesaria para inducir la adhesión celular mitótico y para apoyar la citocinesis, proporcionando anclaje mecánico para el anillo contráctil actomiosina [28]. Para examinar la localización de la integrina β1-, inmunofluorescencia realizado en células en la telofase reveló la acumulación de β1-integrina en la parte media del cuerpo, sobre el E
50 y el E
20, al igual que en el vidrio (Figura 5D). Sobre vidrio, E
50 y E
20 actina acumula también en este celulares zona media (Figura 5D). Estos resultados sugieren la participación β1-integrina continua durante la mitosis a pesar de los sustratos blandos, compatible con la participación de apoyar la citocinesis.
A) transferencias Western de LIBS β1-integrina y la proteína MAPK para SW480 células sembradas 30 min post-sincronización sobre vidrio, e
50 y e
20. Histograma muestra los análisis correspondientes de B) LIBS-β1 integrina y C) de carga p44 /p42 MAPK de control. resultados su Representante de 2 experimentos independientes (las barras de error representan la S.E.M. .; un valor arbitrario de 1 se atribuyó al valor medio correspondiente a las celdas de vidrio). D) α-tubulina y β1-integrina distribución 30 min post-sincronización en vidrio, E
50 y E
20 a partir de células SW480 fijos, la superposición de las células con anti-α-tubulina (verde) y anti-β1 -integrina (rojo) (α-tubulina /β1-integrina). La flecha indica un punto de β1-integrina concentrado en la parte media del cuerpo fino. Imágenes representativas se muestran para 2 experimentos independientes para un total de 10 células para cada condición; barra de escala: 10 micras. Sobre vidrio, E
50 y E
20 a partir de células SW480 fijos, la superposición de las células con el ADN (azul) y actina (rojo) (ADN /actina). Punta de flecha indica la acumulación de actina en la célula zona media. Imágenes representativas se muestran para 2 experimentos independientes para un total de 10 células para cada condición; barra de escala: 10 micras
4.. organización huso mitótico de las células tumorales en respuesta a sustratos blandos
A continuación registramos montaje de huso mitótico en matrices suaves por inmunofluorescencia con anti-α-tubulina y la tinción de ADN con Hoechst. Los husos mitóticos de células SW480, visibles en sustratos rígidos (de vidrio), se conservaron en E
50 e incluso en E
20 (Figura 6A y B). Este resultado contrasta con la observada para las células mitóticas PtK2 no cancerosas sembradas en matriz blanda ya que para el módulo de Young ≤ 50 kPa, no se pudo observar el huso mitótico [3]. De acuerdo con nuestro análisis célula viva (Figura 3B y D), los eventos anormales de segregación de cromosoma se pudieron observar (Figura 6B y D), sin embargo, sin evidencia de husos multipolares o monopolares en los diferentes sustratos probablemente debido a beta 1 integrina compromiso mantenido en el sustrato muy suave. De hecho, no se observaron husos multipolares para las células que llevan mutado β1-integrina [23].
células SW480 30 min-2h post-sincronización en el vidrio, E
50 y E
20 a partir de células fijas. Las imágenes se superponen con anti-α-tubulina (blanco) y Hoechst para el ADN (rojo) (α-tubulina /ADN). La flecha indica el huso mitótico, sin anomalía (A), con anomalía (B), punta de flecha indica la anomalía; barra de escala: 10 micras. C) Porcentaje de células SW480 con huso mitótico de A, determinado sobre 3 agruparon experimentos independientes. Prueba exacta de Fisher muestra que la proporción de células con un huso mitótico en E
50 (93/140) es significativamente diferente de la proporción de vidrio (139/142,
p
& lt; 0,001). La proporción de E
20 (16/50) es significativamente menor que en E
50 (93/140,
p
& lt; 0,001). D) Porcentaje de células que llevan anomalías de segregación de cromosoma, entre las células con huso mitótico considerado en C. En C y D, las barras de error representan intervalos de confianza del 95%.
5. Rac1 expresión de las células tumorales en respuesta a sustratos blandos
Rac1, las proteínas de la familia pequeña GTPasa Ras, están involucrados en la orientación del huso mitótico y aumenta su actividad en la membrana plasmática de las caras polares durante la citocinesis [29 ]. Sincronizamos además una colección de células SW480 y analizamos la expresión Rac1 a través de experimentos de Western blot [29]. No hubo diferencias en la expresión de Rac1 para células mitóticas SW480 sembradas ya sea en sustratos blandos (E
50 y E
20) o en el sustrato rígido (vidrio) (Figura 7A-C). Nuestros resultados mostraron que las células SW480 tumorales mitótico mantener la expresión Rac1 en sustratos blandos. Por el contrario, se observó previamente que las células no cancerosas PtK2 disminuye progresivamente esta expresión en sustratos blandos [3]. Es importante destacar que el compromiso β1-integrina y expresión Rac1 mantienen sobre los sustratos blandos (E
50, E
20) no fueron suficientes para permitir la división de las células SW480 masiva del tumor. De hecho, en estos sustratos sólo el 60% (E
50) y 10% (E
20) de las células son capaces de progresar en la mitosis
A) transferencias de Western de la proteína Rac1 y MAPK para SW480 células de vidrio, e
50 y e
20, 30 minutos después de la sincronización. Histograma muestra los análisis correspondientes para Rac1 (B) y para p44 /p42 MAPK (C). su Representante resultados de 2 experimentos independientes (las barras de error representan la S.E.M .; un valor arbitrario de 1 se atribuyó a la media correspondiente a las celdas de vidrio).
6. la actividad de la replicación del ADN de las células tumorales en respuesta a sustratos blandos
Para determinar si las células SW480 que fueron capaces de progresar a través de la mitosis eran capaces de ciclo celular vuelven a entrar, se determinó su capacidad para someterse a ADN 4h replicación después de haber sido sembradas en diferentes sustratos. SW480 células sembradas sobre E
50 y E
20 muestran sitio de la replicación distribuyen uniformemente en el núcleo (Figura 8A) con, respectivamente, 60% y 23% de las células con BrdU señal nuclear (Figura 8B). Es de notar que los porcentajes de células SW480 que incorporan BrdU correlacionados con el porcentaje de células que alcanzaron mitosis en E
50 y E
20 (Figuras 3C y 8B), lo que sugiere que las células SW480 capaces de completar la segregación de cromosomas en sustratos blandos son más capaces de someterse a un nuevo ciclo de replicación del ADN.
A) BrdU se visualizó mediante inmunofluorescencia indirecta de células SW480 4h post-sincronización en el vidrio, E
50 y E
20; barra de escala: 10 micras. B) Porcentaje de células con BrdU nuclear determinado sobre 3 agruparon experimentos independientes. Prueba exacta de Fisher muestra que la proporción de células con BrdU nuclear E
50 (108/170) es significativamente menor que en el vidrio (400/400,
p
& lt; 0,001) y la proporción en E
20 (35/150) es significativamente menor que en E
50 (
p
& lt; 0,001). Las barras de error representan intervalos de confianza del 95%.
Conclusión
En conclusión, nos informan de que a pesar de la muerte celular masiva en sustratos muy blandas (E
0), células tumorales como las células de cáncer de colon SW480, incluso cuando lleva la segregación cromosómica anormal, se resisten a los sustratos muy blandas (e
20 y e
50) y lograr la mitosis. Estos hallazgos podrían ser de gran importancia para la fisiopatología del cáncer y la diseminación de las células tumorales de colon. De hecho, su naturaleza canceroso al menos algunas de las células tumorales puede ayudar a superar las anomalías de segregación cromosómica vinculados con el cambio en la rigidez del sustrato y, por tanto, escapan a los sustratos blandos para proseguir su viaje hasta el sitio de la formación de metástasis. Además, esta capacidad de superar las anomalías de segregación podría dar lugar a más reordenamientos cromosómicos, que pueden contribuir al aumento de la agresividad de las células tumorales. investigar aún más la respuesta de las células tumorales a los cambios del entorno físico puede ayudar a identificar nuevas dianas potenciales para la terapia contra el cáncer.
Materiales y Métodos
1. Materiales y fabricación de PEM
PLL (MW = 5,7 x 10
4 Da, Sigma, St. Quentin Fallavier, Francia) y HA (MW = 4.0 x 10
5 Da, Bioibérica, Barcelona ) fueron utilizados para la acumulación (PLL /HA)
24 películas, y PSS (MW = 7.0 x 10
4 Da, Sigma, St. Quentin Fallavier) y PAH (MW = 7.0 x 10
4 Da , Sigma) durante (PSS /PAH)
n
tapado películas (
n
se corresponde con el número de pares de capas), que se deposita en la parte superior de (PLL /HA)
24 estratos. PLL, HA, PSS, y PAH se disolvieron en 1 mg /ml en una solución tampón que contiene NaCl 150 mM y 20 mM de tris (hidroximetil) -aminomethan (TRIS, Merck) a pH 7,4, y se llevaron a cabo todos los pasos de aclarado en el mismo tampón. (PLL /HA)
24 y estratos (PSS /PAH)
n
se prepararon películas de tapado utilizando una máquina de inmersión (Inmersión del robot DR3, Riegler & amp; Kirstein GmbH, Berlín, Alemania), en portaobjetos de vidrio (VWR Scientific, Fontenay sous Bois, Francia). La rigidez de la (PLL /HA)
24- (PSS /PAH)
n
película aumenta con el número de pares de PSS /capa HAP depositados (Tabla 1) [19]. Las notaciones de taquigrafía E
0, E
20 y E
50 son para (PLL /HA)
24, (PLL /HA)
24- (PSS /PAH)
n
películas con
n
= 0, 1 y 2, respectivamente.
2. PEM caracterización
CLSM observaciones se realizaron con Zeiss LSM 510 microscopio utilizando x40 /1.4 objectif aceite de inmersión. FITC-fluorescencia detectada después de excitación a 488 nm con el espejo dicroico de corte 488 nm y emisión de filtro de paso de banda 505-530 nm. Rho-fluorescencia detectada después de la excitación a 543 nm, espejo dicroico 543 nm, y la emisión pase largo filtro de 585 nm.
3. Las células y la sincronización
células SW480 de adenocarcinoma colorrectal epiteliales (ATCC, CCL-228) fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (Invitrogen) suplementado con glutamax, 10% de SFB (Invitrogen), 100 mg /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina (Invitrogen), 0.025 U /ml de insulina, 50 mg /ml de hidrocortisona y 1,25 mg /ml de G418 se mantuvo a 37 ° C con 5% de CO
2. Tres días antes de la sincronización, las células se volvieron a sembrar en 1.2x10
4 por cm
2. Las células se sincronizaron por shakeoff mecánica. Se centrifugaron las células mitóticas (800
g
, 7 min), se resuspendieron en medio de cultivo, y se volvieron a sembrar en 1.2x10
4 por cm
2 en cubreobjetos recubiertos con película para nuevos análisis. Las células humanas de colon epiteliales (HCoEpiC, Sciencell Research Laboratories) se cultivaron en colónica de células epiteliales Medio (CoEpiCM, Sciencell MIDE Laboratories) suplementado con colónicos epitelial suplemento de crecimiento celular (CoEpiCGS, Laboratorios de Investigación Sciencell) y con solución de penicilina /estreptomicina (P /S, Sciencell, Laboratorios de investigación) mantuvo a 37 ° C con 5% de CO
2. 2 duplicaciones de la población se sembraron a 5x10
5 por cm
2 en sustratos para nuevos análisis.
4. Immunolabeling
Las células fueron fijadas /permeabilizadas en 3,7% (w /v) de PFA en PBS más 0,1% de Triton X-100 durante 15 min y se bloquearon con 10% FBS descomplementado (Invitrogen). Las células se incubaron con β1-integrina (dilución 1:20, Santa Cruz seguido de rodamina conjugado con anticuerpo secundario (dilución 1: 250, Santa Cruz), o con anti-α-tubulina (dilución 1: 100, Santa Cruz) seguido de anticuerpo secundario conjugado con FITC. (dilución 1: 500, AnaSpec, CA) y el ADN se revelaron con Hoechst 33258 (20 mg /ml, Sigma) Para los estudios de la replicación del ADN, las células cultivadas previamente con BrdU (37 ° C) (1:50 , RPN 201, GE Healthcare) fueron fijadas /permeabilizadas, se incubaron con anti-BrdU y DNasa durante 1 hora a 37 ° C (dilución 1: 100, RNP 202, GE Healthcare), seguido de TRITC conjugado anticuerpo secundario (1: 500 , AnaSpec).
5. réplica de la
1.2 × 10
4 células sincronizadas se sembraron por cm
2 y se incubaron con BrdU (37 ° C) (1:50 ;.. RPN 201, GE Healthcare) Las células fueron fijadas /permeabilizadas en 3,7% PFA en PBS más 0,5% de Triton X-100 durante 15 minutos Después de lavar con PBS, las células se incubaron con anti-BrdU y DNasa durante 1 h a 37 ° C (diluido 1: 100; RNP 202, GE Healthcare). Después de lavados con PBS, las células se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con TRITC (1: 500; AnaSpec).
6. microscopía de fluorescencia
Las muestras se montaron en Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA). imágenes de fluorescencia fueron capturados utilizando Nikon TE200 Elipse con 63 × PL APO (1,4 NA) objectif equipado con cámara digital Nikon (DS-Q11MC con los programas informáticos NIS-Elements), y se procesan con ImageJ (http://rsb.info.nih.gov /ij /).
7. imágenes de células vivas
En la división de ensayos, las células se incubaron 20 min con Hoechst 33242 (0,1 mg /ml, Sigma) antes de la shakeoff mecánica, replated en 1.2x10
4 por cm
2 en la cubreobjetos y montado en una Cámara Ludin (Servicios de imágenes de la vida, Basilea Suiza) a 37 ° C recubierto con película, 5% de CO
2, en un microscopio Leica DMIRE2 equipado con una × HCX PL APO PH2 40 (0,75 NA) objetivo y una Leica DC350FX CCD (Leica FW4000 de software). Las imágenes fueron adquiridas cada 5 min durante 2h30, por fluorescencia y contraste de fases.
8. Western Blot
Las células se sembraron en superficies (Nunc) a 2 × 10
5 por cm
2 y se incubaron durante 30 min post-sincronización en medio de cultivo a 37 ° C. Las células fueron lisadas en 20 mM Tris-base, pH 8, (0,15 M NaCl, EDTA 2 mM, 1% NP-40, 10% de glicerol, ortovanadato sódico 1 mM que contenía 1% de cóctel inhibidor de proteasa; Sigma). mezclas de extracción se sacudieron a 4 ° C y se centrifuga (3 min, 13k rpm a 4 ° C). La concentración de proteína se determinó usando el ensayo de proteínas DC (Bio Rad, EE.UU.). Cantidades iguales de extractos de proteínas totales se sometieron a SDS PAGE (NuPAGE, Invitrogen, Francia) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (transferencia Iblot Stack, Invitrogen, EE.UU.) bloqueado en T- TBS (0,1% de Tween 20, mM Tris-base 50, pH 7,6, 0,15 M NaCl) que contiene 1% de BSA (Euromedex, Francia) y se sondaron durante la noche a 4 ° C. Las transferencias se incubaron 2h con el anticuerpo primario: LIBS ß-integrina activados, (clon B44) (diluido 1: 1000, Millipore), anti-Rac1 (diluido 1: 1000, Millipore) y MAPK p44 /p42 (diluido a 1: 1000, se utiliza la señalización celular, EE.UU.). Las transferencias se incubaron durante 2 h con HRP-conjugado anti-conejo, anticuerpos anti-ratón (diluido 1: 2000; GE Healthcare). Las bandas se detectaron utilizando el kit ECL Western Blot Sistema de Análisis (RNP2109, GE Healthcare). Las autorradiografías se cuantificó con el software Kodak Digital 10 Ciencias. Se presentan los valores medios representativos de al menos dos experimentos independientes con errores estándar (cuatro puntos de tiempo por banda).
Apoyo a la Información
película S1.
película correspondiente a la figura 3A para las células SW480 en E
0.
doi: 10.1371 /journal.pone.0078468.s001 gratis (AVI)
película S2.
película correspondiente a la figura 3A para las células SW480 en E
50.
doi: 10.1371 /journal.pone.0078468.s002 gratis (AVI)
película S3.
película correspondiente a la figura 3A para las células SW480 en E
20.
doi: 10.1371 /journal.pone.0078468.s003 gratis (AVI)
película S4.
película correspondiente a la figura 3A para las células SW480 sobre el vidrio.
doi: 10.1371 /journal.pone.0078468.s004 gratis (AVI)
película S5.
película correspondiente a la figura 3B para las células SW480 en E
50.
doi: 10.1371 /journal.pone.0078468.s005 gratis (AVI)
película S6.
película correspondiente a la figura 3B para las células SW480 en E
20.