Extracto
Antecedentes
El receptor de la vitamina D (VDR) es la vía importante en la prevención y potencialmente en el tratamiento de muchos tipos de cáncer. Un mecanismo de acción importante VDR está relacionada con su interacción con la vía /β-catenina Wnt. Unido a agonista VDR inhibe la ruta /β-catenina /TCF oncogénico Wnt interactuando directamente con β-catenina y en algunas células mediante el aumento de la expresión de cadherina que, a su vez, recluta β-catenina a la membrana. Aquí identificamos TCF-4, un socio de la transcripción regulador y β-catenina vinculante como un objetivo indirecto de la vía VDR.
Metodología /Principales conclusiones
En este trabajo, nos muestran que el TCF 4 (nombre de genes TCF7L2) se reduce en la glándula mamaria del ratón knockout VDR en comparación con el ratón de tipo salvaje. Además, se muestra la 1,25 (OH)
2D
3 aumenta TCF-4 en los niveles de ARN y proteínas en varias líneas celulares de cáncer colorrectal humano, cuyo efecto es completamente dependiente de la VDR.
in silico
análisis de los promotores del ratón TCF7L2 humanos e identificaron varios elementos de unión de VDR putativos. Aunque TCF7L2 promotor reporteros respondieron a exógenos VDR, y 1,25 (OH)
2D
3, el análisis de mutaciones y de inmunoprecipitación de la cromatina ensayos, mostró que el aumento de TCF7L2 no requirió la contratación de la VDR de los elementos identificados y indica que la regulación por VDR es indirecta. Esto se ve confirmado por la exigencia de
la síntesis de proteínas de novo
para esta regulación hacia arriba.
Conclusiones /Importancia
A pesar de que en general se supone que la unión de β-catenina a los miembros de la familia TCF /LEF es el cáncer de promoción, estudios recientes han indicado que la TCF-4 funciones en lugar como un represor transcripcional que restringe de mama y el crecimiento de células de cáncer colorrectal. En consecuencia, se concluye que la 1,25 (OH)
2D
3 /VDR mediada por aumento de la TCF-4 puede tener un papel protector en el cáncer de colon, así como la diabetes y la enfermedad de Crohn.
Visto: Beildeck ME, Islam M, Shah S, Welsh J, Byers SW (2009) control de la TCF-4 Expresión de VDR y la vitamina D en las líneas celulares de ratón de la glándula mamaria y cáncer colorrectal. PLoS ONE 4 (11): e7872. doi: 10.1371 /journal.pone.0007872
Editor: Joseph Alan Bauer, Fundación de Investigación Bauer, Estados Unidos de América
Recibido: 15 de mayo de 2009; Aceptado: 14 Octubre 2009; Publicado: 17 Noviembre 2009
Derechos de Autor © 2009 Beildeck et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. R01- CA-129-813 (SWB); DoD CDMRP Premio predoctoral Prácticas: W81XWH-06-1-0786 (MEB) http://cdmrp.army.mil/bcrp/default.htm; Core Facilities Grant: NIH P30 CA51008 (LCCC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
activación de la ruta de la vitamina D se ha asociado con una disminución del riesgo en el desarrollo y la progresión de muchos tipos de cáncer (revisado en [1]). Aunque los estudios epidemiológicos son menos claros en cuanto a la asociación de riesgo de cáncer con los niveles séricos de vitamina D y sus metabolitos, la biología molecular y estudios en animales apoyan el papel de la vitamina D en el aumento de la apoptosis y la diferenciación celular, y la disminución del crecimiento celular. Como la vitamina D es un compuesto que está disponible en la dieta (aunque insuficiente) como un suplemento, o fácilmente sintetizados por el cuerpo, es un candidato atractivo para la quimioprevención y la quimioterapia. Su beneficio clínico en esta capacidad, sin embargo, se inhibe por la hipercalcemia limitante de la dosis, un efecto secundario que se desarrolla a partir de la función principal de la vitamina D en la homeostasis del calcio. En un esfuerzo por utilizar la vitamina D en la clínica como un agente anti-cáncer, se han hecho esfuerzos para generar análogos de la vitamina D que resultan en hipercalcemia reducida. Si bien estos análogos han demostrado una gran promesa
in vitro
y en modelos animales, que están a la altura en la evocación de una respuesta equivalente en la clínica. Por otra parte, un análogo de éxito puede plantear un problema particular en el contexto del cáncer colorrectal, la tercera causa principal de muerte por cáncer en hombres y mujeres en los EE.UU.. Aunque la evidencia para la vitamina D como un agente anti-cáncer en este órgano es particularmente fuerte, el tracto GI está íntimamente involucrado en la mediación de los efectos de la vitamina D en la homeostasis del calcio. Esto indica que en el colon, que puede ser difícil para desacoplar los anti-cáncer y calcio efectos homeostáticos de vitamina D. Aunque, en otros estudios que muestran que algunos antagonistas parciales de vitamina D se activar el receptor de vitamina D en las células que expresan niveles altos de activado β-catenina (células cancerosas), pero no en las células normales y pueden tener el potencial para hacer esto [2].
receptores nucleares de hormonas pueden influir en la cascada de señalización Wnt canónica mediante la interacción con β-catenina [3 ]. Este fenómeno puede ser especialmente relevante en el cáncer de colon, donde el 80% de los casos son un puerto de mutaciones APC que activan aberrantemente [4] β-catenina, lo que lleva a la acumulación de activado β-catenina en el núcleo (revisado en [5]). Dentro del núcleo, β-catenina es responsable de co-activación de la transcripción de genes cuyos promotores están ocupados por miembros de la familia TCF /LEF de factores de transcripción. Algunos de estos genes, como
c-myc
[6] y
La ciclina D1-
[7], están involucrados en la regulación del ciclo celular y puede contribuir a un fenotipo oncogénico. El tratamiento de las células con algunos agonistas (pero no todos) los receptores nucleares de hormonas (NHR) provoca una sobre regulación de los genes que responden a NHR mientras que al mismo tiempo causando una disminución de la TCF /β-catenina transcripción de genes diana. Esto se ha atribuido a la unión competitiva entre TCF y los NHR para β-catenina [3], [8] - [11], y /o co-activadores comunes, tales como p300 [2]. Un segundo modo de inhibición de Wnt la transcripción de genes diana ha sido atribuida a la prevención de la β-catenina translocación nuclear por el reclutamiento de citoplásmica β-catenina a las uniones adherentes [9], [12], [13]. En tercer lugar, existe evidencia de que los NHR se unen a miembros de la familia TCF /LEF, directamente, y por lo tanto inhibir la transcripción de /β-catenina genes de respuesta TVC [14] - [18]. Esto es probablemente debido a la contratación de co-represores, tales como epilepsia del lóbulo temporal (Groucho) [19], NCoR y SMRT [20].
Aquí mostramos un mecanismo adicional de interacción entre la vía de β-catenina y la vitamina los receptores D (VDR) y la vía. Para aclarar, utilizaremos la siguiente nomenclatura: TCF7L2 en el contexto de plásmidos, ADN y ARN, y TCF-4 en el contexto de proteínas, solamente. Se encontró que el TCF-4 se expresa diferencialmente en células derivadas de tumores de mama de ratón inducidos por DMBA de VDR de tipo salvaje y ratones knock out, y la glándulas mamarias sí mismos. La exploración adicional reveló una VDR-dependiente sobre regulación de TCF7L2 en el mRNA y los niveles de proteína mediante el tratamiento con 1,25 (OH)
2D
3 en las células CaCo2. Análisis del promotor TCF7L2 ratón humano y predijo varios elementos de unión putativo del receptor de la vitamina D proximal al sitio de inicio de la transcripción. Aunque la clonación de esta región promotora reveló la regulación por el VDR /1,25 (OH)
2D
3, el análisis de mutación posterior, inmunoprecipitación de la cromatina y experimentos de síntesis de proteína de inhibición de indicar que este efecto es probable transporta indirectamente, a través de una VDR /1,25 (OH)
2D
intermediario 3-sensible. El aumento de la TCF-4 niveles de proteína se traducen en una mayor actividad TopFlash después de 24 horas de tratamiento ligando en las células CaCo2. Se propone un mecanismo por el que este efecto puede inhibir la actividad oncogénica
en cellulo
.
Resultados
glándulas mamarias de ratones knockout VDR tienen menos TCF-4 de las glándulas mamarias de VDR salvaje Los ratones de tipo
VDR145
+ /+ y VDRK240
- /- líneas celulares se derivan de tumores mamarios de ratón inducidos por DMBA de tipo salvaje (WT) y los ratones knock-out (KO VDR), respectivamente, y se ha descrito previamente [21]. ratones KO VDR son más susceptibles a mamaria inducidos por carcinógenos y carcinógenos colon, así como otras lesiones [22], [23]. Los experimentos preliminares indicaron que TCF-4 fue más abundante en las células WT que las células KO (no mostrado). Se realizó el análisis Western blot para la TCF-4 y confirmamos que VDRK240
- /- células tienen niveles muy bajos de TCF-4 en comparación con VDR145
células + /+ (Figura 1A). A continuación realizó un ensayo desplegable en el que se utilizaron dos proteínas de fusión β-catenina marcada con GST. WT marcada con GST β-catenina se une TCF /LEF a través de la región de repetición armadillo, mientras que GST-dTCF-β-Cat, que alberga las mutaciones en los residuos 253, 312 y 435 dentro de la región armadillo, ha afinidad drásticamente reducido para TCF /Los LEF [24]. En consonancia con los datos de transferencia Western, la proteína de fusión WT bajó más TCF-4 de VDR145
+ /+ lisados que de VDRK240
- /- lisados. La proteína de fusión mutado tiró hacia abajo mucho menos TCF-4 desde el VDR145
células + /+ y ninguno de la VDRK240
- /-. Células (Figura 1B)
(A) Western blot de lisados de células enteras, por duplicado, a partir VDR145
+ /+ (VDR + /+) células (carriles 1 y 2) y VDRK240
- /- (VDR - /-) células (carriles 3 y 4) sondeado para el TCF-4, VDR y GAPDH. (B) Tire hacia abajo de las proteínas en VDR + /+ y VDR - /- lisados con construcciones de β-catenina marcada con GST y probaron para TCF-4. GST-WT-β-catenina (GST-β-Cat) se utiliza en los carriles 1 y 2. mutado β-catenina que no se unirán eficazmente proteínas TCF /LEF (GST-dTCF-β-Cat) se utiliza en los carriles 3 y 4. Beads se utilizan sólo en los carriles 5 y 6. (C) OT actividad en VDR + /+ y VDR - /- células transfectadas con
Renilla
y VP16-β-catenina. Se normalizaron los datos de
Renilla
. Las barras de error representan SEM. p-valores representan la prueba t de Student para diferencias significativos llevados entre las líneas celulares. RLU: unidades relativas de luz (D) OT actividad en VDR + /+ y VDR - /- células transfectadas con
Renilla
, VP16-β-catenina y con o sin un plásmido TCF7L2. Las barras de error representan SEM. Las estadísticas son la prueba t de Student para las diferencias entre las células transfectadas y transfectadas de control. * P & lt; 0,05; *** P & lt; 0,0005. (E) los tejidos glándulas mamarias de VDR WT (paneles superiores) y VDR KO (paneles inferiores) los ratones se tiñeron para TCF-4 se muestran a tres aumentos.
A continuación utiliza el AT /DE reportero sistema de actividad /β-catenina ensayo de TCF en estas células. El reportero OT contiene tres tándem TCF /LEF elementos de unión aguas arriba de un gen de la luciferasa y el reportero de control correspondiente (OF) ha mutado sitios de unión TVC y representa la unión de fondo. Debido a que estas células tienen actividad de β-catenina endógena baja, VP16-β-catenina fue co-expresada con los vectores indicadores en todas las muestras. En consonancia con sus niveles reducidos de TCF-4, VDRK240
- /- células tenían una menor actividad β-catenina que VDR145
+ /+ células (Figura 1C). Esta diferencia fue significativa pero no era grande e indica que VDRK240
- /- células tienen otros miembros de la familia TCF que pueden compensar TCF-4, y /o los bajos niveles de TCF-4 que permanecen en estas células es suficiente para la activación , al menos en el contexto de altos niveles de activado β-catenina [25], [26]. La co-transfección con TCF7L2 exógeno rescató la actividad β-catenina reducida en el VDRK240
- /- las células (Figura 1D). Para determinar si este fenómeno también estaba sucediendo
in vivo
, se tiñeron los tejidos mamarios normales de VDR ratones WT y KO VDR para el TCF-4. En concordancia con el resto de los datos de la Figura 1, los tejidos mamarios de animales VDR WT tienen tinción más prominente en comparación con los tejidos mamarios de animales KO VDR (Figura 1E). TCF-4 tinción no está completamente ausente en VDR KO glándulas mamarias, aunque es mucho menos frecuente y menos intenso (Figura 1E, panel inferior derecho).
CYP24A1 es el mejor caracterizado, diana aguas abajo de la vitamina vía D y su ARNm es exquisitamente sensibles a los agonistas de VDR. CYP24A1 está involucrado en el metabolismo de los compuestos activos de la vitamina D en metabolitos inactivos. La actividad del reportero CYP24A1 estaba ausente y no se ve afectado por la 1,25 (OH)
2D
3 en VDRK240
- /- las células, pero fue restaurada después de la transfección de VDR (Figura 2A). Colectivamente, estos datos muestran que las células que son nulo para el VDR tienen niveles basales bajos de TCF-4 y que este disminuye la actividad de β-catenina en nuestro modelo mamaria VDR-nulo
.
(A) la actividad de CYP24-luc en VDRK240
- /- (VDR - /-) y VDR145
+ /+ (VDR + /+) las células que fueron transfectadas con GFP o VDR y se trató con 10
-7 M 1,25 ( OH)
2D
3, al control de EtOH durante 24 horas como se indica. RLU = unidades relativas de luz. (B) Análisis de PCR de la transcriptasa inversa de CYP24A1 ratón (panel superior), el ratón y VDR humano (paneles intermedios) y β-actina (panel inferior) transcripciones en respuesta a la expresión exógena humana VDR y 1,25 (OH)
2D
3 tratamiento como se describe en la parte A. (C) se incubaron varias líneas celulares de cáncer colorrectal durante 24 horas en 10
-7 M de 1,25 (OH)
2D
3 o EtOH, como indicado. Las proteínas celulares se analizaron para TCF-4 expresión (panel superior) y GAPDH se controló para la igualdad de carga de carril (panel inferior). Ambos TCF-4 bandas representan diferentes isoformas de TCF-4 que tienen diferente longitud C-terminales. (D) células CaCo2 se transfectaron con diferentes cantidades de VDR o siRNA durante 24 horas y se trataron con 10
-7 M 1,25 (OH)
2D
3 o EtOH durante subsiguientes 24 horas, como se se indica, y se sondearon para TCF-4. NT: no director. análisis (E) densitométrico de tres transferencias de Western, como se indica en la parte A. Los datos se representaron gráficamente en relación con cada control de EtOH-tratada. los valores de p fueron generados por una cola t-test: * p & lt; 0,05; ** P & lt; 0,005; *** P & lt; .0005 (F) CaCo2 células fueron transfectadas durante 24 horas con ERVD-luc,
Renilla Opiniones y siRNA y tratada durante otras 24 horas con 10
-7 M 1,25 ( OH)
2D
3 como se indica. RLU: unidades relativas de luz. células CaCo2 (G) fueron transfectadas con siRNA durante 24 horas y se trataron durante 24 horas posteriores con 10
-7 M 1,25 (OH)
2D
3 o EtOH como se indica. CYP24A1 transcripciones se analizaron por qPCR. Se normalizaron los datos de expresión de GAPDH y se representan en relación con cada control de EtOH.
VDR /1,25 (OH)
2D
3 Regula TCF7L2 ARNm y proteínas en líneas celulares de cáncer colorrectal
A continuación transfectadas VDRK240
- /- células con VDR humano y encontramos que la proteína TCF-4 y ARNm TCF7L2 no se vieron afectados por VDR o 1,25 (OH)
2D
3 (suplementario Figura S1A y S1B). Sorprendentemente, a pesar de que la actividad del reportero CYP24A1 era sensible a exógenos VDR y 1,25 (OH)
2D
3 en estas células (Figura 2A), al igual que TCF7L2,
endógena
ARNm de CYP24A1 no era, a pesar de la optimización de la transfección que nos permitió lograr una eficiencia del 60% (Figura 2B). Estos datos indican que VDRK240
- /- células tienen alteraciones de larga vida en la capacidad de los genes diana endógenas para responder a la restauración transitoria de VDR. Como promotores expresados exógenamente son sensibles, esto es probablemente el resultado de los cambios en la organización de la cromatina que no pueden revertirse mediante la expresión a corto plazo del VDR y el tratamiento con 1,25 (OH)
2D
3.
en consecuencia, para determinar con mayor precisión los efectos de VDR y su ligando clásico sobre TCF-4 expresión, que ensayaron varias líneas celulares de cáncer colorrectal para los cambios en la TCF-4 expresión en respuesta a la 1,25 (OH)
2D
3 (Figura 2C, que complementa la figura S2). A pesar de todas estas células incremento en la expresión de TCF4 en respuesta a la vitamina D se optó por utilizar la línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano, CaCo2 por varias razones. Estas células son bien estudiados en el contexto de la señalización de la vitamina D y su crecimiento es inhibido por 1,25 (OH)
2D
3 [27]. Además, son un sistema único que imita epitelio intestinal normal una vez que se hacen confluentes se diferencian en cultivo [28]. Estas células también expresan VDR, pero a niveles más bajos (es decir, normales) con respecto a varias otras líneas celulares de cáncer de colon [29], [30]. El tratamiento de células CaCo2 confluentes con 10
-7 M 1,25 (OH)
2D
3 con o sin la transfección de VDR conducir a un aumento robusto y estadísticamente significativa en la proteína TCF-4 (Figura 2D y MI). Los efectos de la 1,25 (OH)
2D
3 son moderadamente potenciados por exógenos VDR y esto es probablemente una subestimación, ya que sólo el 50-60% de las células se transfectan. Más importante, el aumento de la TCF-4 inducida por 1,25 (OH)
2D
3 es absolutamente dependiente de la VDR, como su caída inhibe no sólo los efectos de la 1,25 (OH)
2D
3 sobre la actividad de un reportero promotor VDRE y en la inducción CYP24A1 ARNm, sino también de TCF-4-inducción (Figura 2D-G). En contraste con VDRK240
- /- células (Figura S1B), TCF7L2 y CYP24A1 ARNm se incrementaron en un 1,25 (OH)
2D
3 en CaCo2 células (Figura 3A). Tanto TCF7L2 y los niveles de CYP24A1 fueron elevados después de 4 horas con TCF7L2 alcanzar una inducción máxima a las 24 horas (Figura 3B). Esta regulación también está sujeta a la densidad celular, como diferencias estadísticamente significativas en TCF7L2 mRNA sólo se ven en mayor densidad (Figura S3). Esto puede ser análogo a los efectos modestamente potenciada de VDR exógeno sobre la 1,25 (OH)
2D
3 mediada por aumento de TCF-4 (Figura 2E), como células CaCo2 se conocen hasta de regular VDR en confluencia /diferenciación [31].
(a) qPCR análisis de las células transfectadas CaCo2 y tratados como se describe en la Figura 2D y 2E. TCF7L2 (panel izquierdo) y CYP24A1 (panel derecho) transcripciones. Se normalizaron los datos a GAPDH y se representan con respecto a cada control de EtOH-tratada. p-valores se derivan de la comparación de la prueba t de Student entre EtOH y D
3 controles: * P & lt; 0,05; **; p & lt; 0,005; *** P & lt; .0005 (B) células CaCo2 fueron tratados en diferentes puntos de tiempo con un 10
-7 M de 1,25 (OH)
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3 hasta 48 horas antes de la recolección. ARNm para TCF7L2 (panel izquierdo) y CYP24A1 (panel derecho) se ensayó mediante qPCR. Los datos se normalizaron a GAPDH y se representan como factor de cambio en relación con el punto de tiempo 0 Hr. los valores de p se derivaron de la prueba t de Student, en comparación con 0 Hr punto de tiempo: * p & lt; 0,05; **; p & lt; 0,005; *** P & lt;. .0005
VDR /1,25 (OH)
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3 regula la actividad del promotor en TCF7L2 mamario de ratón y células de cáncer colorrectal humano
Desde TCF7L2 está regulada por la 1,25 (OH)
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3 en el nivel de ARNm en células CaCo2, escaneamos el ratón y los genes humanos TCF7L2 aproximadamente 4000 pares de bases aguas arriba del sitio de inicio de transcripción la presencia de la mitad de los sitios que cumplen con el RGKTSA consenso ERVD (R = a o G, K = G o T; S = G o C), o medias sitios que se desvían ligeramente de los consensos, pero que han sido descritos como ERVD funcional sitios de media en la literatura. Se identificaron varios VDREs putativos codificados en el promotor TCF7L2 tanto del gen humano y de ratón (Supplemental Tabla S1 [32] - [41]). Desde el ratón y el promotor TCF7L2 humanos comparten más de 80% de identidad de secuencia en la primera ~ 2000 pares de bases, hemos clonado dos porciones del promotor de ratón en un constructo de luciferasa (Figura 4A). Un reportero, -1037-luc, contiene la región entre +522 y -515 pares de bases respecto al sitio de inicio de la transcripción y contiene la 5'UTR y la caja TATA en -25 pares de bases predicho. El reportero -2068-luc se extiende por la región entre 430 y -1542 con relación al sitio de inicio transcripcional. Los nombres de plásmido y VDREs posteriormente mencionados se refieren a la distancia desde el codón de inicio y no el sitio de inicio de la transcripción ya que los sitios de inicio de transcripción base de datos varían. Los sitios de media de los elementos -187 /-177 DR4, (dos hexameric medias sitios dispuestos como repeticiones directas separadas por cuatro nucleótidos) comparten la mitad de sitio entre ellos.
(A), el promotor TCF7L2 Ratón de dos constructos fueron clonados aguas arriba de un indicador de luciferasa. Los cuatro sitios putativos VDRE en relación con el sitio de inicio de la traducción se indican, y todos los VDREs se codifican en la hebra no codificante. Las -177 y -187 VDREs se superponen y comparten un medio sitio entre ellos. El constructo -1037 (-1037-luc) contiene la región de -1 hasta -1037 con relación al sitio de inicio de traducción y posee la -177 /-187 VDRE, solamente, mientras que el -2068 reportero (-2068-luc) contiene el región entre -96 y -2068 con relación al sitio de inicio de traducción del promotor TCF7L2 ratón, y posee los cuatro VDREs putativos. Se transfectaron (B) células CaCo2 durante 24 horas con
Renilla Opiniones y reporteros como se indica, así como diferentes cantidades de p53. Se normalizaron los datos de
Renilla Opiniones y al reportero de expresión vacía. RLU = unidades relativas de luz. (C) -1038-Luc o construcciones de vectores vacíos fueron transfectadas en células CaCo2 con
Renilla Opiniones y diferentes cantidades de VDR, como se indica. 24 horas después de la transfección, las células fueron tratadas durante 24 horas adicionales con 10
-7 M de 1,25 (OH)
2D
3 o control del vehículo EtOH. Las barras de error representan SEM. Las estadísticas se derivan de ANOVA de dos vías para las diferencias entre EtOH- y 1,25 (OH)
2D
3 muestras tratadas con: * P & lt; 0,05; **; p & lt; 0,005; *** P & lt; 0,0005. Se transfectaron (D) células CaCo2, tratados y analizados como en la parte C utilizando -2068-luc en lugar de -1038-luc. Las estadísticas se generan mediante ANOVA de dos vías para las diferencias significativas entre la cantidad de VDR transfectadas: *** p & lt; 0,0005. Las barras de error representan SEM. RLU:. Unidades Relativas de Luz
Reportero -1037-luc contiene sólo la primera ERVD putativo, compuesto, mientras que el reportero -2068-luc contiene los cuatro VDREs. p53 disminuye la actividad de reportero TCF7L2 humana y se encontró que p53 también inhibió la actividad de ambos -2068-luc y reporteros de ratón -1037-luc [42], [43] (Figura 4B). Además, la actividad basal del informador -2068-luc fue notablemente menor que el reportero -1037-luc que indica la presencia de un elemento represor fuerte en esta región (Figura 4B). En las células CaCo2, el constructo -1038-luc responde modestamente, pero significativamente, a la adición de ligando pero el efecto no fue potenciada por VDR exógena (Figura 4C, panel izquierdo). Por el contrario, -2068-luc responde fuertemente a exógeno VDR pero no con el tratamiento con 1,25 (OH)
2D
3 en CaCo2 y VDRK240
- /- células (Figura 4C, panel derecho y complementaria Figura S4A, respectivamente). Estos datos indican que el VDR y el tratamiento con 1,25 (OH)
2D
3 influye en la actividad del promotor TCF7L2 pero no demuestran que el efecto es directo.
putativos dentro del VDREs promotor del ratón TCF7L2 no son importantes para la regulación por VDR en mamario de ratón y células de cáncer colorrectal humano
para probar la hipótesis de que los VDREs putativos fueron importantes en la transmisión de la respuesta del promotor TCF7L2 al VDR, la tercera y cuarta nucleótidos dentro de cada media in situ se mutaron a residuos de alanina dobles (Figura 5A). medio-sitio 5 'de -187 no se mutó ya que el 3'half-sitio si este VDRE se comparte con -178 VDRE, y fue mutado en esa construcción. Estas mutaciones alteran las medias sitios de tal manera que no se ajustan a la secuencia consenso ERVD, y no deben obligar a VDR. Las mutaciones se generaron tal que cada VDRE (que contiene dos medias sitios, cada uno) se mutó en los siete posibles combinaciones de mutaciones individuales, mutaciones dobles, y una mutación triple. La transfección de estas construcciones reveló que retienen la capacidad de respuesta a exógenos VDR en células CaCo2 y VDRK240
- /- (Figura 5B y Figura complementario S4B, respectivamente). A continuación realizó ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) para poner a prueba la contratación del VDR a las seis VDREs putativos identificados en el promotor TCF7L2 humana (Figura 5C). CaCo2 células se sembraron a una densidad elevada y se trataron durante 4 horas con 10
-7 M de 1,25 (OH)
2D
3. Tanto el receptor X retinoide (RXR) y el VDR fueron reclutados para las VDREs publicados sobre el promotor CYP24A1 (Figura 5D, los carriles 1 y 2), sin embargo, ni NHR fue reclutado para cualquiera de los VDREs putativos en la región promotora TCF7L2 humano. Estos datos sugieren que el aumento de la expresión TCF7L2 no es debido a la contratación de la VDR a estos VDREs putativos en el ratón y promotores TCF7L2 humanos. Esto podría significar que o bien el VDR Se va a contratar a otras regiones del genoma y el control de la transcripción de TCF7L2 directamente, o el VDR es la regulación de este fenómeno a través de un 1,25 (OH)
2D
intermediario 3-sensibles .
(A) representación gráfica de los cuatro VDREs putativo dentro de los primeros ~1500 pares de bases del promotor TCF7L2 ratón y sus secuencias. DR3: repetición directa intercaladas por tres nucleótidos. 2xDR4: dos, repeticiones directas intercaladas por la superposición de cuatro nucleótidos. Aunque los VDREs putativos se codifican en la hebra no codificante, sus secuencias se escriben a la inversa-complemento de tal manera que los VDREs pueden ser identificados como en conformidad con el consenso RGKTSA. (B) constructo -2068-luc que contiene los tres conjuntos de mutaciones medio del sitio (D1502 /d1153 /D177) se transfectó en células CaCo2 y se trató con ligando como se describe en la Figura 4C con sólo 3 concentraciones de VDR (bajo, medio y alto ). Las barras de error representan SEM. Estadísticas representan análisis utilizando ANOVA de dos vías: * p & lt; 0,05. RLU-Relativa unidades de luz. (C) Representación de los seis VDREs putativos identificados dentro de 4000 pares de bases aguas arriba del sitio de inicio de transcripción de la región promotora TCF7L2 humana y se nombran con relación a su distancia del sitio de inicio de la traducción (+ estar aguas abajo, y el bienestar de aguas arriba). Todas las regiones excepto 88 (marcados con) se codifican en la hebra no codificante. (D) La cromatina inmunoprecipitación de VDR y RXR-obligado fragmentos de ADN a partir de células CaCo2 tratados durante 4 horas con 10
-7 M de 1,25 (OH)
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3 (carriles-D de número par) o EtOH (carriles E-impares). Las regiones que amplifican las regiones que contienen ERVD se denotan lo largo de la parte superior de los carriles. El producto CYP amplifica una región del promotor CYP24A1 humano que se sabe que se une VDR y RXR en presencia de ligando y sirve como un control positivo. IgG representa la amplificación no específica. Entrada demuestra material equivalente utilizado en cada muestra.
Reglamento de TCF7L2 por VDR /1,25 (OH)
2D
3 es probable mediada por un mecanismo indirecto en células de cáncer colorrectal
Para probar esta última hipótesis, se empleó el inhibidor de la traducción, cicloheximida (CHX). CaCo2 células fueron tratadas previamente con diferentes cantidades de CHX durante 30 minutos y después se trataron con 10
-7 M de 1,25 (OH) 2D
3 durante 24 horas. En las células CaCo2, en concentraciones tan bajas como 12,5 mg /ml, CHX fue capaz de bloquear significativamente la inducción de ARNm TCF7L2 by1,25 (OH)
2D
3, al igual que DKK-4, otro objetivo de la vitamina D indirecta que está regulada negativamente (Figura 6) [44]. Estos datos indican la necesidad de
la síntesis de proteínas de novo Opiniones de regulación por parte de la 1,25 (OH
) 2D
3. El ARNm de CYP24A1 inducción por 1,25 (OH)
2D
3 también es marcadamente inhibida por CHX, pero aún así se induce ~ 20 veces mediante la 1,25 (OH)
2D
3 en el mayor concentración de CHX (Figura S5), un fenómeno que se ha demostrado para otro gen diana directa de vitamina D, la E-cadherina [9]. La regulación de CYP24A1 es tan dramática que probablemente requiere la síntesis continua de proteínas co-activador para apoyar una inducción de esta magnitud. Tomados en conjunto, estos datos implican que la regulación de TCF7L2 por VDR /1,25 (OH)
2D
3 es indirecta.
CaCo2 células fueron tratadas previamente durante 30 minutos con diferentes concentraciones de el inhibidor de la síntesis de proteínas cicloheximida (CHX) antes de la adición de 10
-7 M de 1,25 (OH)
2D
3 o EtOH durante 24 horas, tal como se indica. El análisis de la abundancia de ARNm de TCF7L2 (panel superior) y DKK4 (panel inferior) se ensayó mediante qPCR. Las barras de error representan SEM. * P & lt;., 05 a través de la prueba t de Student para diferencias significativas entre D
3 frente a las células tratadas EtOH
1,25 (OH)
2D
3 Aumenta Reportero TCF la actividad en las células del cáncer colorrectal
Si bien la regulación de TCF7L2 es importante para muchos resultados patológicos, que queríamos mirarlo en el contexto del cáncer. Hemos elegido para analizar los efectos de mediado por la VDR TCF-4 sobre regulación a través del sistema reportero TopFlash clásica que ha sido descrito previamente (TopFlash, a diferencia de OT, utiliza un mínimo
c-fos
promotor). células CaCo2 tienen una mutación somática APC que permite β-catenina se acumule y se translocan al núcleo. En el caso de sobre-abundantes, β-catenina activa podemos esperar un aumento en la expresión TCF7L2 para dar lugar a una mayor actividad TopFlash. De hecho, repetimos los mismos experimentos de titulación de VDR como se describe en los experimentos reportero promotor TCF7L2 (Figura 4C), utilizando TopFlash (normalizado al plásmido control, FOPFLASH) en lugar, y observó un aumento consistente y significativo en la actividad TopFlash con 24 horas de 10
-7 M de 1,25 (OH)
2D
3 en las células CaCo2 (Figura 7) que, al igual que los datos de proteínas (Figura 2D y 2E) es potenciada por el VDR. Estos datos apoyan un papel para VDR-dependiente, aumento de 1,25 (OH)
2D
3 mediada de TCF-4 en mamario de ratón y células tumorales colorrectales humanos, los efectos de que pueden regular diferencialmente β-catenina la actividad
in vivo
.
CaCo2 células fueron transfectadas durante 24 horas con TopFlash,
Renilla Opiniones y diferentes cantidades de VDR y tratada durante otras 24 horas con 10
-7 M de 1,25 (OH)
2D
3 o EtOH. datos de la luciferasa se normalizaron a
Renilla
y FOPFLASH y se representa en relación con cada muestra de control EtOH-tratada. Las barras de error representan SEM. p-valores reportados son de la prueba t de Student. RLU:. Unidades Relativas de Luz
Discusión
La vitamina D ha demostrado una gran promesa como un agente anti-cáncer en ambos estudios moleculares y animales, así como algunos estudios epidemiológicos (revisado en [45]). En un esfuerzo para desacoplar los efectos anticancerígenos de la vitamina D de los efectos calcémicos que limitan su utilidad en la clínica, muchos laboratorios están diseccionando sus actividades derivadas. Varios mecanismos moleculares que contribuyen a la potencial acción terapéutica de la vitamina D implican interacciones con la vía de β-catenina. Una interacción directa entre β-catenina y un NHR, en este caso, el receptor de ácido retinoico fue descrito por primera vez en 1999 [3]. Desde entonces, muchos estudios han encontrado interacciones similares para receptor de andrógenos [8], [10], [11], el proliferador de peroxisomas activado del receptor [18], y VDR [2], [9]. Estos estudios muestran que los miembros de la familia de NHR y TCF /LEF compiten por la unión a beta-catenina y /o co-activadores comunes, tales como p300. En presencia de ligando, β-catenina y /o favores P300 unión a la NHR, causando una regulación sinérgica (en combinación con ligando NHR) de genes regulados-NHR, así como una baja regulación simultánea de TCF /β catenina genes de respuesta.