Extracto
Rho GTPasas son reguladores clave de la invasión de células tumorales y por lo tanto constituyen objetivos atractivos para el diseño de agentes contra el cáncer. Varias estrategias se han desarrollado para modular el aumento de sus actividades durante la progresión del cáncer. Curiosamente, ninguno de estos enfoques ha tenido en cuenta la existencia de la relación antagonista bien conocido entre RhoA y Rac1. En este estudio, lo primero que comparó la invasividad de una colección de líneas celulares de cáncer colorrectal con sus actividades de RhoA, Rac1 y Cdc42. Una marcada disminución de Cdc42 activa y Rac1 correlacionada con el alto potencial invasivo de las líneas celulares establecidas a partir de sitios de metástasis de adenocarcinoma colorrectal (LoVo, SKCo1, SW620 y COLO205). Por el contrario, no se detectó correlación entre la actividad de RhoA y de invasión, mientras que la actividad de su ROCA quinasa efectora fue mayor en líneas celulares de cáncer con un fenotipo más invasiva. Además, la invasividad en estas líneas celulares de cáncer de colon se correlacionó con una ronda y morfología típicos blebbing. A continuación, prueba si el tratamiento con PDGF para restaurar actividades Cdc42 y Rac1 y /o con Y27632, un inhibidor químico de ROCK, podría disminuir la capacidad de invasión de las células SW620. La asociación de ambos tratamientos disminuyó sustancialmente el potencial invasivo de las células SW620 y este efecto fue acompañado por la pérdida de formación de ampollas en la membrana, la restauración de una morfología celular más alargada y re-establecimiento de uniones adherentes E-cadherina-dependiente. Este estudio se allana el camino para el desarrollo de estrategias terapéuticas en las que se combinan diferentes moduladores Rho GTPasa para modular la diafonía entre Rho GTPasas y su entrada específica en la progresión metastásica
Visto:. De Toledo M, C Anguille , Roger L, P Roux, Gadea G (2012) Efecto anti-invasivo Cooperativa de Cdc42 /Rac1 activación y el rock inhibición en células SW620 con cáncer colorrectal con elevada formación de ampollas en la actividad. PLoS ONE 7 (11): e48344. doi: 10.1371 /journal.pone.0048344
Editor: Daotai Nie, Escuela de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de mayo de 2012; Aceptado: September 24, 2012; Publicado: 7 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 de Toledo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por la Ligue Nationale contre le Cancer (équipe labellisée), Asociación para la Investigación del cáncer contre le (contrat 17029), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, y Le Centre National de la Recherche Scientifique. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Rho GTPasas son esenciales para muchas funciones celulares, incluyendo el tráfico de membrana, la activación de la transcripción, apoptosis, progresión del ciclo celular, la polaridad celular, la adhesión y la migración [1], [2], [3], [4]. De hecho, su desregulación tiene consecuencias importantes en muchos procesos fisiopatológicos [5]. En particular, Rho GTPasas son reguladores cruciales de la progresión del cáncer a través de la modulación de la proliferación celular, la apoptosis, la invasión y la formación de metástasis [6].
El papel de tres Rho GTPasas en la migración bi-dimensional ha sido bien caracterizado. Rac1 impulsa la motilidad mediante la promoción de la formación de lamellipodium y salientes de células [7]. la señalización de RhoA activa la familia de la roca de quinasas, promoviendo la formación de fibras de estrés de actina y la generación de la fuerza contráctil Actomiosina que se requiere para la retracción de la parte trasera de células en movimiento de tipo mesenquimal [8], [9]. Cdc42 se activa en el borde delantero de lamelipodia y es necesario para el montaje de actina Arp2 /3-dependientes [10]. Por otra parte, la existencia de una relación antagónica entre Rac1 y RhoA explica el movimiento polarizado durante la migración celular dirigida. Curiosamente, estas dos proteínas suprimen cada otras actividades y fenotipos [11], [12], [13]. En concreto, las actividades de RhoA y Rac1 se controlan espacial y temporalmente para promover cambios en el citoesqueleto dinámicos durante la migración. actividad Rac1 se limita a la borde de ataque para extender las protuberancias en la parte delantera, mientras que RhoA impulsa la contracción en la parte trasera de la célula que migra. RhoA y Rac1 efectos localizados se presumiblemente impulsados por mecanismos de regulación específicos. De hecho, Wildenberg y colegas demostraron que Rac1 que dependen de la regulación por disminución de la actividad de RhoA es controlada por la integridad de unión adherente [14].
Sin embargo, los mecanismos que median la motilidad de las células tumorales son diferentes en matrices tridimensionales más complejas . En este contexto, algunas células tumorales adoptan una forma ameboide de movimiento [15], [16] que se caracteriza por un redondeado, la morfología celular blebbing, la independencia de las proteasas extracelulares y el requisito de altos niveles de Actomiosina contractilidad aguas abajo de la RhoA-ROCK vía para deformar el movimiento de la matriz extracelular y la unidad celular [17], [18], [19], [20]. Los estudios que utilizan microscopía intravital han demostrado que el movimiento ameboide de las células tumorales puede ser muy rápida in vivo (~ 5 m /min [21]). A la inversa, el movimiento de tipo mesenquimal se caracteriza por una morfología alargada, lo que resulta del conjunto de actina Rac1-dependiente en el borde delantero. Estos dos modos de movimiento son inter-convertibles y las células tumorales pueden someterse a ameboide-mesenquimal y transiciones mesenquimales-ameboide [15], [18], [20] que parece estar controlada por un antagonismo entre las vías de señalización Rac1 y RhoA. El descubrimiento de las proteínas Rac1 GTPasa de la activación ROCK-regulada (BPA) ayudó a la comprensión de cómo la vía RhoA /ROCK puede suprimir la polimerización de actina mediada Rac1 [14], [22], [23]. En cualquier caso, esta plasticidad puede permitir que las células se adaptan a su modo de migración a los diferentes entornos y por lo tanto pueden ser beneficiosos para las células tumorales
.
Además de la regulación espacio-temporal estricto de las diferentes Rho GTPasas, también la actividad de sus socios aguas arriba y aguas abajo está estrictamente controlada. De hecho, los efectos de Rho GTPasa sobre el comportamiento celular se pueden modular también a través de interacciones específicas con los reguladores (por ejemplo, factores de intercambio de nucleótidos de guanina, GEF) para regular los procesos aparentemente incompatibles. Por ejemplo, DOCK10, un Cdc42 GEF, es un jugador clave en la migración ameboide a través de una vía de señalización DOCK10-Cdc42-Pak2. De acuerdo con ello, la expresión de Cdc42 activado induce una transición mesenquimal-ameboide. Sin embargo, la inhibición de Cdc42 resulta en la pérdida de la morfología mesenquimal, lo que sugiere que Cdc42 juega un papel también en de tipo mesenquimal morfología través de diferentes vías que podrían implicar a otros GEFs [24]. Además, en modelos de cultivo de dos dimensiones, RhoA se activa no sólo en la cola contráctil, sino también en el borde delantero. De hecho, la actividad de RhoA se mantiene alta en ondulaciones de la membrana en lamelipodia incipiente [25]. Estas observaciones sugieren que RhoA está implicada en la regulación de la membrana fruncido Rac1-dependiente. De hecho, RhoA colabora con Rac1 para inducir ondulaciones de la membrana a través de la contratación de su mDia efector específico. Tomados en conjunto, estos datos indican claramente que la diafonía entre estas GTPasas Rho excluye la hipótesis de que cada uno de ellos es responsable de sólo un modo de migración. GTPasas
Rho regulan también la organización del citoesqueleto de actina y la adhesión celular. E-cadherina, una glicoproteína de un solo tramo trans-membrana, establece interacciones homofílicas con moléculas de E-cadherina adyacentes que son expresados por las células vecinas, formando de este modo el núcleo de las uniones adherentes epiteliales [26], [27]. A través de sus citoplasmática de dominio, asociados E-cadherina con un número de proteínas, incluyendo tres Cateninas (alfa, beta y p120), que vinculan la E-cadherina al citoesqueleto de actina. El complejo de E-cadherina-catenina y el citoesqueleto de actina subyacente se someten a una serie de reorganizaciones que son controlados por la Rho GTPasas Rac1 y RhoA y que resultan en la expansión y la finalización de la adhesión célula-célula. En vista de su papel en el mantenimiento de las uniones adherentes y su vínculo estrecho con Rho GTPasas, pérdida de E-cadherina podría promover la metástasis al permitir que el primer paso de la cascada metastásica: la pérdida de contactos célula-célula. De hecho, la disminución de la E-cadherina expresión se ha asociado con la invasión tumoral, diseminación metastásica y el mal pronóstico clínico [28], [29], [30].
Por lo tanto, Rho GTPasas parece ser atractivo objetivos para la terapia del cáncer . Varias estrategias se han desarrollado para contrarrestar Rho GTPasa señalización desregulación durante la tumorigénesis, como la orientación directa de las actividades de Rho GTPasa [31], [32], o la inhibición de efectores corriente abajo, como el rock, con resultados prometedores en la prevención de la invasión
in vivo
[33]. Una estrategia alternativa consiste en la selección de los reguladores de estado activo Rho GTPasa, como GEF, las lagunas y los inhibidores de la disociación de nucleótidos de guanina (gdis) [32] [34]. Aunque los inhibidores de Rho GTPasa aún no han sido ampliamente adoptados para uso clínico, su valor potencial como medicamentos contra el cáncer todavía conduce considerable investigación y desarrollo farmacéutico [35]. Sin embargo, la diafonía entre Rho GTPasas y su dualidad funcional, que es una característica clave de su regulación, nunca han sido considerados por estas estrategias de focalización.
En este estudio, se comparó la primera invasión de una colección de líneas celulares de cáncer colorrectal con sus actividades de RhoA, Rac1 y Cdc42. Nos informan de que el alto potencial invasor de las células de cáncer colorrectal con la actividad de formación de ampollas elevada se correlaciona tanto con una mayor activación rock y condiciona la actividad de Cdc42 y Rac1. El tratamiento combinado con PDGF para restaurar la función Cdc42 y Rac1 y con Y27632 para inhibir ROCA reduce sinérgicamente el potencial invasivo de estas células de cáncer colorrectal. Esto ofrece nuevas perspectivas para el desarrollo de agentes anticancerígenos que pueden combinar la inhibición simultánea de roca y re-activación de Cdc42 y Rac1 actuar en ambas vías específicas y comunes.
Resultados
El nivel de Cdc42 y Rac1 activa, pero no de RhoA, se reduce en las líneas celulares colorrectales altamente invasivos
la transición a un fenotipo muy móviles es una característica de las células cancerosas invasivas y una indicación de que un tumor puede producir metástasis. Para clasificar su potencial invasivo, se comparó la capacidad de una colección de líneas celulares de cáncer colorrectal para invadir Matrigel, una matriz tri-dimensional que se asemeja a la membrana basal e imita el complejo entorno extracelular que se encuentra en muchos tejidos. por tanto, se evaluó la capacidad de invasión de las dos líneas normales de células de colon (FHC y CON), del colon línea celular de carcinoma HCT-116, de las líneas de células Caco2, LS174T, SW480, HT29 y WiDr que se derivaron de los adenocarcinomas colorrectales y de cuatro células líneas (LoVo, SKCo1, SW620 y COLO205) establecen a partir de los sitios de metástasis de adenocarcinoma colorrectal. Las cuatro líneas celulares emitidas desde los sitios de metástasis mostraron la más alta capacidad de invadir Matrigel, lo que indica que estas células han conservado su capacidad de invadir incluso después de llegar a su sitio secundario (Figura 1a)
.
(a) Resultados de la ensayo de invasión de Matrigel por las diferentes líneas celulares de cáncer de colon. Se detectaron las células que habían invadido a través de Matrigel en el lado inferior del filtro por fluorescencia y se contaron como se describe en Materiales y Métodos. Los valores son la media +/- SD (barras de error) de al menos tres experimentos independientes. (B) Las células se lisaron y el nivel de Cdc42-GTP unido se midió como se describe en Materiales y Métodos. Cdc42-GTP precipitó con GST-PAK1 y Cdc42 total en los lisados se detectaron mediante inmunotransferencia con un anticuerpo anti-Cdc42. Los valores son la media +/- SD (barras de error) de al menos tres experimentos independientes. (C) las células se lisaron y el nivel de Rac1 unido a GTP se midió como se describe en Materiales y Métodos. Rac1-GTP precipitó con GST-PAK1 y Rac1 total en los lisados se detectaron mediante inmunotransferencia con un anticuerpo anti-Rac1. Los valores son la media +/- SD (barras de error) de al menos tres experimentos independientes. (D) Las células se lisaron y el nivel de RhoA unido a GTP se midió como se describe en Materiales y Métodos. RhoA-GTP precipitó con GST-RBD y RhoA total en los lisados se determinó por inmunotransferencia con un anticuerpo anti-RhoA. Los valores son la media +/- SD (barras de error) de al menos tres experimentos independientes.
A continuación, se evaluó si la invasividad y el nivel de activos Rho GTPasas, que son componentes clave de la maquinaria invasiva, se correlacionaron mediante la comparación del nivel de GTP unido a Cdc42, RhoA y Rac1 en las diferentes líneas celulares de cáncer colorrectal. Se observó una marcada disminución de Cdc42 activa y Rac1 en las líneas más invasivos colorrectales celulares de cáncer (Figura 1B y 1C). Por el contrario, el nivel de RhoA unido a GTP no se correlacionó con la invasividad de las células. En particular, se observó una fuerte actividad de RhoA en las células HCT-116, que se caracterizan por su baja capacidad de invadir Matrigel (Figura 1d). Las variaciones en el nivel de GTPasas activos en las diferentes líneas celulares no se deben a una diferencia en su expresión de la proteína, ya que era casi equivalente en todas las líneas celulares (no mostrado). Llegamos a la conclusión de que, en las líneas celulares de cáncer colorrectal ensayados, el nivel de Cdc42 activa y Rac1, pero no de RhoA, se correlaciona inversamente con la capacidad de invasión de estas células (respectivas
valores de p
: 0,0008, 0,0003 y 0,134 ).
Cofilin fosforilación aumenta con la invasividad de las diferentes líneas celulares de cáncer colorrectal
el hallazgo de que la actividad de RhoA no estaba relacionada con la capacidad de invasión de las diferentes líneas celulares de cáncer de colon no está de acuerdo con la participación frecuente de la vía de RhoA en la invasión de células tumorales, en particular a través de la activación de su ROCA efector quinasa. por tanto, hemos probado la hipótesis de que, en estas líneas celulares, el nivel de activación de roca no puede reflejar el nivel de RhoA unido a GTP. Para este fin, se evaluó la activación de ROCK en las líneas celulares de cáncer colorrectal estudiados mediante la cuantificación del estado de fosforilación del sustrato ROCA Cofilin, que controla la formación de paquetes orientados actomyosin II en el cuerpo de la célula [36]. Fosforilada Cofilina se detectó mediante inmunotransferencia con anticuerpos anti-cofilina fosforiladas específicas y su expresión se normalizó a la de Cofilina total (Figura 2a). Cofilina era débilmente fosforilado en la línea de CoN célula de colon normal, así como en las líneas de forma poco invasiva de células HCT-116 y SW480 en comparación con las líneas celulares más altamente invasiva LoVo, SW620, Colo205 y SKCo-1, en el que fosforila Cofilina era muy abundante. Estos resultados sugieren que el nivel de escombros activos, pero no de RhoA activa, se asocia con la invasividad de células de cáncer de colon.
Las células se lisaron y la cantidad de fosforilados Cofilina y del total Cofilina presente en los lisados se analizaron por inmunotransferencia. (A) Representante de inmunotransferencia. (B) La cuantificación de la fosforilación de Cofilina. Los histogramas representan las proporciones de la señal de fosfo-cofilina sobre el total de la señal Cofilin. Los valores son la media +/- SD (barras de error) de tres experimentos independientes.
Combinado restauración de las actividades y la inhibición de la formación de vesículas en las células disminución ROCA Cdc42 y Rac1 e inducir el alargamiento celular
ROCK-dependiente de la contractilidad actomiosina es crítico para la morfología celular. La alta actividad de Rock también puede inducir la formación de vesículas de membrana dinámica. Para comprobar si la activación de ROCK en las diferentes líneas de células colorrectales se correlacionó con la morfología celular, que supervisó las células utilizando microscopía de contraste de interferencia diferencial de lapso de tiempo. Mientras que las células SW480 HCT-116 y retienen algunas características epiteliales (forma alargada, contactos célula-célula), las células SW620 eran esféricas y exhibieron una intensa actividad de formación de ampollas periférica (Figura 3a, paneles superiores: fotografías fijas a partir de vídeos S1, S2, S3, S4, S5 y S6), de acuerdo con la contractilidad actomiosina elevada debido a su actividad ROCA mucho más alta en comparación con las otras dos líneas celulares (véase la figura 2b). Para probar si la disminución observada en Cdc42 y Rac1 y aumento de la actividad roca fueron ambos implicados en la progresión tumoral a etapas más avanzadas, se trataron estas líneas celulares de cáncer de tres puntos con PDGF para volver a activar Cdc42 y Rac1 y /o con Y27632 al bloque ROCK. PDGF Combinado y Y27632 tratamiento dio como resultado la adquisición de un fenotipo más epitelial con células alargadas, particularmente en la línea celular SW620 (Figura 3a, paneles inferiores). De hecho, estas células, que eran redondas y con formación de ampollas en la membrana elevada al comienzo del tratamiento combinado, se detuvo la formación de ampollas y aplanado hacia fuera (Figura 3b y vídeo S7). La cuantificación del número de células alargadas siguiendo los diferentes tratamientos demostrado claramente que la restauración combinado de las actividades y la inhibición de la ROCA Cdc42 y Rac1 tenía un efecto aditivo (Figura 3c). Para controlar la activación de PDGF-dependiente de Cdc42 y Rac1 en las tres líneas celulares, que mide el nivel de GTP unido a Cdc42 y Rac1 (Figura 3d y e). PDGF no afectan en gran medida la cantidad de GTP unido a Cdc42 y Rac1 en las células HCT-116 y SW480, mientras que aumentó claramente en las células SW620. Además, también registramos Y27632 efecto en cadena de la miosina de luz 2 (MLC2) fosforilación, como una lectura de la contractilidad ROCK-dependiente y encontramos que fosforilada MLC2 se redujo en Y27632 tratados SW620 células (Figura 3F). Tomados en conjunto estos datos sugieren que el tratamiento combinado con PDGF y Y27632 para restaurar la actividad Cdc42 y Rac1 e inhiben la roca puede convertir, células SW620 blebbing invasivos para un fenotipo más epitelial.
(a) las imágenes con lapso de tiempo Todavía DIC de células tratadas o no (control) con PDGF y Y27632 (de Video S1, S2, S3, S4, S5 y S6). Frames muestran el cambio en la morfología (de redonda a una forma más alargada) de las células en el comienzo de las películas. Las barras de escala, 10 m. (B) las imágenes con lapso de tiempo de DIC SW620 células antes y después del tratamiento con PDGF + Y27632 (de vídeo S7). Frames muestran el cambio en la morfología celular en los tiempos indicados. Las barras de escala, 10 m. (B) La cuantificación de la elongación celular. Una célula se consideró alargado cuando su dimensión más larga era dos veces el más corto y cuando se mostró al menos un saliente [23]. Los histogramas representan el porcentaje de células SW620 alargadas después del tratamiento o no (control) con PDGF y /o Y27632 durante 24 horas. Los valores son la media +/- SD (barras de error) de tres experimentos independientes y la significación estadística se calculó utilizando la prueba t no pareada. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001. Se determinó la actividad (d) Cdc42 después del tratamiento o no (control) con PDGF durante 24 horas como se describe en Materiales y Métodos. Los valores son la media +/- SD (barras de error) de cuatro experimentos independientes y la significación estadística se calculó utilizando la prueba t no pareada. * P & lt; 0,05. actividad (e) Rac1 se determinó después del tratamiento o no (control) con PDGF durante 24 horas como se describe en Materiales y Métodos. Los valores son la media +/- SD (barras de error) de cuatro experimentos independientes y la significación estadística se calculó utilizando la prueba t no pareada. * P & lt; 0,05. (F) se lisaron las células SW620 y la cantidad de fosforilados miosina de cadena de luz 2 (MLC2) y del total MLC2 presente en los lisados se determinó por inmunotransferencia en diferentes puntos de tiempo (0 a 30 minutos) después del tratamiento con 10 mM Y27632. Se muestra un inmunoblot representativo.
Combinado de restauración de la actividad y la inhibición de Cdc42 y Rac1 ROCA re-localizar E-cadherina a las uniones de las células
Tras el tratamiento combinado con PDGF y Y27632, células SW620 parecía tener uniones adherentes restauradas (Figura 3A). Con el fin de aclarar este punto, se evaluó la expresión de E-cadherina por inmuno-tinción en el control y células tratadas (Figura 4a). Mientras que se observó casi ningún cambio en la expresión de E-cadherina en las células SW480 HCT-116 y, la fuerte tinción de E-cadherina en las células SW620 indicaba claramente que los contactos célula-célula se restablecieron después del tratamiento con PDGF y Y27632. La cuantificación de las uniones adherentes de las células SW620 confirmó el efecto sinérgico de PDGF y Y27632
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(a) tinción representativa E-cadherina en células de cáncer de colon tratados o no (control) con PDGF y Y27632 durante 24 horas. Las barras de escala, 10 m. (B) La cuantificación de los cruces E-cadherina. Anotamos como positivas todas las células que muestra al menos una unión de E-cadherina con una o más células vecinas. Los histogramas representan el porcentaje de células de cáncer de colon SW620 con uniones E-cadherina después del tratamiento o no con PDGF y /o Y27632 durante 24 horas. Los valores son la media +/- SD (barras de error) de tres experimentos independientes y la significación estadística se calculó utilizando la prueba t no pareada. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt;. 0.001
Combinado restauración de la actividad y la inhibición de las propiedades invasivas ROCA deterioran SW620
Como combinado Cdc42 y Rac1 PDGF y Y27632 tratamiento llevado a la re-establecimiento de las uniones adherentes en la línea celular SW620 invasivo, que después se ensayaron directamente el efecto de PDGF y Y27632 tratamiento en la invasividad de estas células en ensayos de invasión de Matrigel. Una vez más, la asociación de PDGF y Y27632 fue más eficaz que los tratamientos individuales en la inhibición de las propiedades invasivas de las células SW620 (Figura 5). PDGF y Y27632 casi no tenían efectos sobre HCT-116 y la invasividad SW480 (datos no mostrados). En conjunto, nuestros datos sugieren que el comportamiento invasivo de la línea celular de cáncer de colon metastásico SW620 puede verse afectada dramáticamente por el uso combinado de PDGF y Y27632 que lleva a ameboide del epitelio de transición y restablecimiento de la E-cadherina dependiente de las uniones adherentes.
La invasividad de las células de cáncer de colon SW620 después del tratamiento o no (control) con PDGF y /o Y27632 se cuantificó mediante el uso de ensayos de invasión de Matrigel como se describe en Materiales y Métodos. Los valores son la media +/- SD (barras de error) de al menos tres experimentos independientes y la significación estadística se calculó usando la prueba t no pareada. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt;. 0,001, ns no significativo
Discusión
En este estudio, se investigó la posible relación entre la invasividad y el nivel de actividad de los principales Rho GTPasas en una colección de líneas celulares de cáncer colorrectal. Se demuestra que la capacidad de invadir de estas líneas celulares de cáncer colorrectal se correlaciona con una disminución marcada de Cdc42 y Rac1 actividad y un aumento de la roca, pero no RhoA, la actividad. Como este fenotipo molecular se asoció con una ronda, formación de ampollas en la morfología celular luego preguntamos si la morfología del epitelio normal podría ser restaurado mediante la inhibición de la roca con la Y27632 y reactivar Cdc42 y Rac1 con PDGF. De hecho, en la línea celular SW620 invasivo, el tratamiento combinado con PDGF y Y27632 formación de ampollas en las células detenidas y adquiere una morfología aplanada propagación y más. En estas condiciones, uniones adherentes también fueron restaurados como se indica por la reaparición de la expresión de E-cadherina en contactos célula-célula. Esta conversión morfológica se asoció con una fuerte reducción en su capacidad para invadir a través de Matrigel. Es muy posible que estas características (contactos célula-célula /morfología y la invasión) están directamente vinculados
.
Nuestros datos indican que una fuerte disminución de la actividad Cdc42 y Rac1 está claramente asociada con un aumento de la invasividad del cáncer de colon. Estos resultados corroboran los obtenidos en otras líneas celulares epiteliales. En las células epiteliales Madin Darby de riñón canino (MDCK), la activación de Cdc42 y Rac1 ha sido implicado en la formación de uniones adherentes [37]. Además, las formas constitutivamente activadas de Cdc42 y Rac1 pueden prevenir Factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) inducida por la dispersión de las células mediante el aumento de E-cadherina mediada por adhesión célula-célula [37]. Nuestros resultados se extienden estas observaciones para las células de carcinoma de colon humano. Específicamente, en la restauración de los niveles de GTP unido a Cdc42 y Rac1 por tratamiento PDGF, la actividad de formación de ampollas en células SW620 fue fuertemente suprimida y las células se extendió con la formación de filopodios y laminillas. Además, se podría confirmar que la expresión de Cdc42 constitutivamente activa o inhibe Rac1 SW620 propiedades invasivas (datos no mostrados). Por otra parte, también favoreció el PDGF dependientes restablecimiento de E-cadherina de las uniones adherentes. Otros estudios han demostrado que la activación de los resultados de Rac1 en la adhesión célula-célula E-cadherina mediada y, posteriormente, la inhibición de la migración y la invasión de las células epiteliales [38] [39] [40] [41]. Por el contrario, en los tumores hepáticos, PDGF está implicado en el mantenimiento de la EMT [42]. Por otra parte, Cdc42 y Rac1 también podrían desempeñar un papel clave en la migración celular y la invasión a través de la formación de filopodios y lamelipodia. De esta manera, el control de contacto célula-célula para mantener las células como un epitelio de cohesión y la regulación de la migración celular a los favores de la invasión que podría considerarse como dos efectos antagónicos de Cdc42 y Rac1 en la progresión tumoral. En nuestro estudio, el tratamiento con PDGF restaurado contactos célula-célula E-cadherina-dependiente, pero no fue suficiente para evitar la invasión cuando se utiliza solo. De hecho, PDGF necesitaba ser combinada con la inhibición de roca para mostrar un fuerte efecto aditivo sobre la invasividad. Nuestros resultados indican que cada vía muestra características independientes y que la inhibición de la invasión podría preverse a través de la manipulación eficaz de ambas vías. Sin embargo, estos resultados se relacionan con el modo ameboide de la migración de la línea celular SW620 utilizado en este estudio. A medida que las células cancerosas pueden invadir el uso de diferentes modos de migración, no sabemos si esta estrategia modulador podría aplicarse a otros tipos de invasión de células cancerosas.
Rock también juega un papel central en la inhibición de RhoA dependiente de Rac1 [22], [23], [43], [44], [45]. Los avances recientes han identificado FilGAP, una proteína de unión filamin-dotado de una función de Rho GTPasa de la activación de Rac1-specfic, como mediador crucial de la inhibición de ROCK-inducida de Rac1. Después de la fosforilación por ROCK, la actividad RacGAP de FilGAP es estimulado y, como consecuencia, FilGAP induce la formación de la ampolla y suprime la propagación de células y la formación de punta, que son características de inhibición de la actividad Rac1 [22]. Por otra parte, la señalización ROCA también activa ARHGAP22 (otro RacGAP) que, a su vez, inhibe la activación de Rac1 para evitar la supresión de la formación de ampollas en el movimiento dependiente (ameboide?) [23]. Sin embargo, RhoA también puede mediar la activación de Rac1 y la formación lamelipodia posterior a través de la contratación de mDia, que se asocia con ondulaciones de la membrana [43], [46]. Teniendo en cuenta esta doble función, la ausencia de correlación entre la activación de RhoA y la invasión de células informe que aquí no es sorprendente. actividad roca es más probable que esté asociado con la invasividad, mientras que la influencia de RhoA oscila entre mDia y activación ROCK, dependiendo del tipo de célula. Por consiguiente, los efectos de la exoenzima C3, un inhibidor de la Rho, y de Y27632, un inhibidor de ROCK, son muy diferentes. En las células estimuladas con LPA Swiss 3T3, Y27632, pero no C3, tratamiento aumentó la actividad Rac1 inducida y la formación de la colmena de la membrana [43].
Por último, una de las principales conclusiones de nuestro estudio es que el rock, pero no RhoA , la actividad está relacionada con la invasividad en la colección de líneas celulares de cáncer de colon. Esto plantea la cuestión de la vía (s) de señalización que activa selectivamente ROCK en las líneas celulares más invasivos. Podemos especular que otros activadores ROCA podrían aliviar la actividad de RhoA en su ausencia. Por ejemplo, RhoC, que promueve principalmente la invasividad [47], [48], [49], [50], [51], estimula e interactúa con el rock con más fuerza que RhoA [52]. De acuerdo con esto, la expresión y la activación RhoC coinciden con EMT de células de cáncer colorrectal que se asocia con aumento de la agresividad durante la tumorigénesis [53]. Tomados en conjunto estos datos sugieren que Rho GTPasas puede funcionar en un compensatoria, pero distinta, de manera [54]. Sin embargo, nuestro conocimiento sobre la implicación de Rho GTPasas en la invasión del cáncer depende en gran medida de la sobre-expresión de formas constitutivamente activadas. Esto podría perturbar el equilibrio natural de los reguladores y efectores Rho GTPasa. Por ejemplo, la exposición de las células a los altos niveles de RhoA activa debe favorecer la señalización a través ROCK, mientras que los niveles bajos de RhoA promueven la señalización a través mDia [52]. Por lo tanto, la sobre-expresión de una forma constitutivamente activada de RhoA promoverá invasividad ROCK-dependiente y podría oscurecer la vía antagonista mDia. Por otra parte, la acumulación de pruebas indica que la GTPasa resultado de señalización depende no sólo de los efectores, sino también en las GEFs que impulsarán las GTPasas y los efectores en estrecha proximidad, creando micro-áreas con altas concentraciones locales de efectores [55] [56] . Como consecuencia, la actividad de RhoA no puede explicar totalmente para la activación de roca. Por otra parte, la actividad de RhoA crudo también podría ser no totalmente indicativa de las cuales la vía de señalización (es decir, GEF y efectores asociados) se dedica.
En conclusión, nuestro trabajo proporciona información importante sobre cómo Rho GTPasas consecuencias de la activación de tumor colorrectal progresión y más precisamente en la invasividad de formación de ampollas en células colorrectales. Nuestra conclusión principal es la interacción entre el rock y las actividades Cdc42 y Rac1. Estas vías de señalización tienen efectos opuestos sobre la invasión y sus fluctuaciones son en parte mutuamente relacionados, aunque nuestros datos también sugieren la existencia de contribuciones intrínsecas independientes. Esto tendría consecuencias importantes sobre las estrategias para el desarrollo de nuevos medicamentos contra el cáncer. Centrarse sólo en general los niveles de expresión elevados de Rho GTPasas en el cáncer podría conducir a inconvenientes terapéuticos si sus efectos opuestos no son tomados en cuenta. De hecho, el diseño altamente selectiva Rho GTPasa señalización moduladores y combinando sus efectos podrían ofrecer mayores oportunidades terapéuticas.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y reactivos
Las líneas de células de colon normales FHC , Con y las líneas celulares de cáncer colorrectal HCT116, Caco2, LS174T, SW480, HT29, WiDr, LoVo, SKCo1, SW620 y COLO205 se adquirieron de ATCC y se cultivaron como se recomienda. Las células se trataron con 40 ng /ml de PDGF-BB (Upstate) y 10 M Y27632 (Calbiochem). lisados de proteínas se obtienen por sonicación breve de las células tratadas en 2 x tampón de Laemmli.