Extracto
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es el ADN tumoral caracterizada por daño cromosómico denomina inestabilidad cromosómica (CIN) y los telómeros excesivamente cortos. Hasta el 80% de CRC es microsatélites estables (MSS) y se considera históricamente para ser cromosómicamente inestable (CIN +). Sin embargo, el fenotipo tumoral representa algunos manuscritos CRC con los cambios genéticos poco o nada, siendo así cromosómicamente estable (CIN-). tumores MSS Cin- no han sido evaluados por el desgaste de los telómeros.
Diseño Experimental
SMS cánceres rectales obtenidos de pacientes ≤ 50 años de edad con la etapa II (B2 o superior) o enfermedad en estadio III se evaluaron para CIN, longitud de los telómeros y el mecanismo de mantenimiento de los telómeros (telomerasa activación [ ,,,0],TA]; alargamiento alternativo de los telómeros [ALT]). longitud de los telómeros relativa se mide por qPCR en el ADN epitelial y el cáncer somática. TA se midió con el ensayo de trapecio, y se evaluaron los tumores para la presencia de C-círculos indicativos de ALT. estado de la mutación de p53 se evaluó en todas las muestras disponibles. copia los cambios de número de ADN fueron evaluados con espectral Genómica aCGH.
Resultados
Los tumores fueron clasificados como cromosómicamente estable (CIN-) y cromosómicamente inestable (CIN +) según el grado de cambios de número de copias de ADN. tumores Cin- (35%, n = 6) había cambios menos el número de copias (& lt; 17% de sus clones con el número de copias de ADN cambia) que los tumores CIN + (65%, n = 13) que tenían niveles elevados de número de copias cambios en 20% a 49% de los clones. telómero longitudes eran más largos en comparación con los tumores CIN- CIN + (p = 0,0066) y en aquellos en los que la telomerasa no se ha activado (p = 0,004). Los tumores que muestran la activación de la telomerasa tenían telómeros más cortos tumorales (p = 0,0040); y tendían a ser CIN + (p = 0,0949).
Conclusiones
cáncer rectal MSS parece representar un grupo heterogéneo de tumores que se pueden catalogar tanto sobre la base del estado y del mantenimiento de los telómeros mecanismo de CIN . MSS Cin- cánceres rectales parecen tener telómeros más largos que los de los cánceres rectales MSS CIN + y utilizar ALT en lugar de la activación de la telomerasa.
Visto: Boardman LA, RA Johnson, Viker KB, Hafner KA, Jenkins RB, Riegert Johnson-DL, et al. (2013) Correlación de la inestabilidad cromosómica, longitud del telómero y mantenimiento de los telómeros en microsatélites cáncer rectal estable: una subclase molecular del cáncer rectal. PLoS ONE 8 (11): e80015. doi: 10.1371 /journal.pone.0080015
Editor: Michel M Ouellette, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de mayo de 2013; Aceptado: 27 de septiembre de 2013; Publicado: 21 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Boardman et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por el Instituto Nacional del cáncer (R01 CA132718 y P50 CA102701 Clínica Mayo SPORE en el cáncer de páncreas); el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (P30 DK084567 Mayo Clinic Centro de Señalización Celular en Gastroenterología); la Fundación Lustgarten para el cáncer pancreático; y por el Centro de Mayo Clinic para Medicina Individualizada. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) se puede subdividir en tumores que presentan inestabilidad cromosómica (CIN +) frente a aquellos con cariotipo intacta y la estabilidad cromosómica (CIN). Convencionalmente, sólo los tumores con defectuosa desajuste de reparación del ADN (dMMR), también conocido como tumores inestables microsatélites, (MSI (H)), se cree que es CIN-, y se pensaba que los tumores CIN + tener dMMR intacto y ser microsatélites estables (MSS) . Sin embargo, varios estudios han demostrado que hasta un 50% de los tumores del SMS son CIN-, y una porción significativa, pero más pequeño de MSI (H) los tumores colorrectales son CIN + [1,2]. Aunque MSI (H) cánceres colorrectales están asociados con un mejor pronóstico que los tumores del SMS, estudios recientes han indicado que el nivel de inestabilidad cromosómica, en lugar de el estado de microsatélites, es el marcador de pronóstico útil [3]. fenotipos específicos asociados con el subtipo MSS CIN- incluyen falta de diferenciación tumoral, histología mucinosa y una menor tasa de mutaciones de p53 [1,4]. Por otra parte, el CRC que se presenta a una edad más joven (& lt; 50 años) es más probable que sea MSS diploide, con diploidia ser un sustituto medida de la estabilidad cromosómica. Cromosómicamente estable (CIN-) microsatélites estables (MSS) CRC es relativamente una nueva clasificación de los CRC que proporciona otro marco de comprensión de las vías que subyacen a este cáncer.
acortamiento de los telómeros se han relacionado con la inestabilidad cromosómica (CIN) en el contexto de las enfermedades relacionadas con la edad asociados con la alteración genética y la carcinogénesis [5]. Los telómeros están compuestos de secuencias de repetición TTAGGG que protegen los extremos de los cromosomas lineales de ser dejado vulnerable a los daños, y el acortamiento de los telómeros disfuncional ha sido implicado como el precursor de la inestabilidad cromosómica. Críticamente los telómeros cortos exponen extremos cromosómicos, se acoplan a la respuesta al daño del ADN, y precipitan fusiones de extremo a extremo y eventos de recombinación. células epiteliales mamarias primarias con telómeros más cortos son más frecuentemente implicados en los acontecimientos mala segregación y exhiben no sólo reordenamientos cromosómicos sino también cambios cromosómicas numéricas [6], lo que indica que la más corta longitud de los telómeros pueden permitir el desarrollo de NIC. longitud de los telómeros en el ADN de los tumores MSS Cin- no ha sido evaluado.
Los telómeros pueden alargarse por la activación de la transcriptasa inversa de la telomerasa ribonucleoprotein llamado [7] .. activación de la telomerasa está presente en muchos tipos de cáncer. telómeros acortados crítico normalmente inician la senescencia celular y la apoptosis y detener la proliferación de células que contienen el ADN dañado de manera significativa. activación de la telomerasa puede inmortalizar eficazmente las células cancerosas mediante la restauración de suficiente longitud de los telómeros para proteger la numéricamente /y el ADN estructuralmente alterado de ser neutralizado por la respuesta al daño del ADN y de someterse a la senescencia celular. Otra vía de mantenimiento de los telómeros a través del cual los telómeros pueden ser desviados de la senescencia es a través de alargamiento alternativo de los telómeros (ALT), que es un mecanismo basado en la recombinación homóloga que utiliza un molde de ADN para preservar la longitud del telómero [8].
buscado para determinar si la vía (s) de mantenimiento distinto de los telómeros se correlaciona con la presencia o ausencia de CIN en el cáncer rectal MSS. Para aclarar aún más el fenómeno de MSS CIN- comparación con CIN + cáncer de recto, hemos utilizado CGH array (aCGH) para evaluar los tumores para cromosómica estructural y alteraciones genéticas sub-cromosómicas.
Como nuestro estudio anterior encontró que casi el 50% de los casos joven del inicio MSS CRC que surgieron en el colon proximal o en el recto eran diploides mediante citometría de flujo [9], se estudiaron sólo los casos de aparición temprana edad y se centró en cánceres rectales de fase similar. Se midió la longitud del telómero en la correspondiente de leucocitos de sangre periférica, colon normal adyacente, y el ADN del cáncer rectal y se evaluó el ADN del cáncer rectal para la activación de la telomerasa y ALT para determinar si alguno de los dos mecanismos principales de mantenimiento de los telómeros se correlaciona con el nivel de CIN en los jóvenes cáncer rectal MSS inicio.
Métodos
de selección de muestras y procesamiento
Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Clínica Mayo. Se incluyeron pacientes con cáncer rectal a partir de tres fuentes: (1) Biobanco para la salud gastrointestinal de Investigación, un repositorio prospectivo compuesta de material biológico con anotaciones de individuos con CCR que tuvieron la evaluación en la Clínica Mayo de Rochester, MN desde abril de 2000 hasta agosto de 2005 y que dieron su consentimiento para ser en el repositorio; (2) casos de cáncer rectal de una serie recogida prospectiva de pacientes con CRC que se sometieron a resección quirúrgica en la Clínica Mayo (Rochester, MN) a partir de diciembre de 1995 y hasta abril de 1997. [10] y (3) una serie prospectiva de pacientes con CRC que se sometieron a cirugía de 1987 hasta 1988 [11]. Se seleccionaron 19 participantes con SMS cánceres de recto con inicio en la edad ≤ 50 años de edad y que fueron ya sea en estadio II (B2 o superior) o la etapa III. Sólo se seleccionaron los participantes con sangre y /o normales de colon y muestras de epitelio de tumores recogidos antes de cualquier quimioterapia o radioterapia para este estudio. Se extrajo el ADN a partir de leucocitos de sangre periférica usando el Gentra Autopure salificación de química (Gentra, Minneapolis, MN) y se cuantificó por absorbancia UV. la calidad del ADN se evaluó mediante la relación de densidad óptica 260/280. estado de MSI se midió utilizando una combinación de técnicas de inmunohistoquímica y el análisis basado en la PCR de MSI. Tinción inmunohistoquímica para MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2, y las pruebas de la inestabilidad de microsatélites se realizaron como se describe anteriormente [12]. Los marcadores microsatélites BAT26, D17S250; D5S346; ACTC, BAT40, BAT 25, BAT 34C4, D10S197, MYCL y D18S55 se utilizaron para evaluar el estado de MSI, y un tumor se llama SMS si ninguno de los marcadores mostró MSI y todos inmunotinciones mostró expresión intacta de proteínas MMR [13].
procesamiento de tejido tumoral y la extracción de ADN CGH array
muestras tumorales congeladas se utilizan para los estudios de CGH array. de espesor total del tumor y los tejidos epiteliales del colon normales fueron extirpados de las piezas quirúrgicas, broche de congelados en nitrógeno líquido y se almacenan a -70 ° C. seccionar los tejidos se realizó en un criostato a -20 ° C. El tejido tumoral estaba-macro diseccionado para enriquecer para la densidad del tumor (& gt; 70% de núcleos tumorales). En pocas palabras, una sección de tumor congelado de espesor 6 micras se tiñó con hematoxilina y eosina y se marca como un portaobjetos de guía por nuestro patólogo (TCS) para identificar las regiones que contienen ≥ 70% de núcleos tumorales. A continuación se utilizó esta diapositiva para identificar la región del bloque de tumor congelado correspondiente con sólo el área destinada con la densidad de tumor 70% seccionado para ser utilizado como la fuente de tejido tumoral para el ADN. Acompañando a la mucosa colónica normal, un mínimo de 8 cm del margen del tumor, se microdissected para el tejido epitelial. Las secciones se colocaron en tampón de extracción y el ADN genómico fue extraído de tumor o ADN normal epitelio de colon mediante extracción con fenol /cloroformo y cuantificados por absorbancia UV, y la calidad del ADN se evaluó por la relación de la densidad óptica 260/280. En todos los casos, el ADN se extrajo de la quimiorradioterapia cáncer rectal ingenuo.
Array CGH
aCGH se realizó utilizando el chip espectral ™ 2600 (espectral Genómica, Houston, TX) que contiene 2600 clones BAC manchado en duplicado. Ambos experimentos de marcaje de avance y retroceso se realizaron para cada muestra de tumor. Etiquetado y la hibridación se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante para el espectral de Chip ™ 2600. Ultra-pura desionizada H
2O se utilizó para la preparación de todos los reactivos; se utilizó Promega Genomic DNA Male (Madison, WI) como ADN de referencia; experimentos de tinte de inversión en la que se realizaron 2 microarrays para cada muestra con etiquetado recíproco del ADN de prueba y de referencia. El ADN de prueba y de referencia se cebado aleatoriamente marcada mediante la combinación de 2 g de ADN genómico y ddH
2O a un volumen total de 50 l y sonicación en un sonicador de vaso curvado invertida para obtener fragmentos de 600 pb a 10 kb de tamaño. la limpieza del ADN se realizó con el Kit de Limpieza de Zymo (Orange, CA) según el protocolo. El eluyente se dividió en partes iguales entre 2 tubos y, a cada uno, 20 l de 2,5 × cebadores aleatorios de se añadió BioPrime DNA Labeling Kit Invitrogen de (Carlsbad, CA), se mezcló bien, hervidas 5 minutos, e inmediatamente se colocó en hielo durante 5 minutos. A cada uno se le añadieron 0,5 l espectral Labeling Buffer (espectral Genómica), 1,5 l de Cy3-dCTP o 1,5 l Cy5-dCTP respectiva de cada experimento tinte de inversión (PA53021, PA55021; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), y 1 l de Klenow fragmento (kit de marcado de ADN BioPrime; Invitrogen). El contenido se incubaron durante 1 hora a 37 ° C. Los tubos se vuelve a calentar a ebullición durante 5 minutos y se devuelven al hielo durante 5 minutos. Se añadió otra alícuota de 5 ul de la memoria intermedia de etiquetado a la mezcla y los tubos se incubaron a 37 ° C durante otra hora. Al final de la segunda hora, la adición de 5 l 0,5 M EDTA pH 8,0 e incubando los tubos en un baño seco durante 10 minutos a 72 ° C se detuvo la reacción de marcaje. ADN de muestra y control de mezclas se combinan en el tubo de muestra, se añadieron a cada tubo y M NaCl 5 y 100% de isopropanol 45 ul de Hyb I (bloqueo de ADN y el portador de esperma de salmón de ADN) se añadieron a los tubos para precipitar el ADN. sedimentos de ADN se lavaron con 70% X1 etanol y después se secaron en la oscuridad. Después de volver a la hidratación de los gránulos con agua, se añadió HYBII (Hybrisol) a la mezcla y el ADN se desnaturalizó durante diez minutos a 72 ° C y luego pre-hibridó durante 30 minutos antes de ser colocado en la matriz y se cubre con una hoja de cubierta 24X60mm . Los portaobjetos se incubaron durante la noche en un horno de 37 ° C.
Los lavados post-hibridación se realizaron con cada diapositiva en placas de Petri profundas individuales en una incubadora de balanceo. Después de retirar el cubreobjetos, los portaobjetos se sumergen brevemente en 0,5% SDS a temperatura ambiente. A continuación, cada diapositiva se transfirió a 2XSSC, 50% formamida desionizada pH 7,5 durante 20 minutos; a continuación 2X SSC, 0,1% de Igepal CA-630 pH 7,5 durante 20 minutos, seguido de 0,2 x SSC pH 7,5 durante 10 minutos, cada pre-calienta a 50 ° C y se agitó en una incubadora a 50 ° C. Por último, cada diapositiva fue brevemente enjuagados en dos baños de temperatura ambiente ddH
2O e inmediatamente se secó por soplado con comprimido N
2 y escaneado.
datos de la matriz de análisis
Escaneo se realizó con un escáner GenePix 4000B microarrays de Axon (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y las imágenes se analizaron con Genepix Pro 3.0 para preparar los archivos de datos para el análisis de la representación con Spectralware V2.2 software. (Espectral Genómica, Houston, TX). Las manchas se definen por la característica de rejilla automática del software y ajustar manualmente cuando sea necesario. Spots muestran ninguna señal o defectos obvios fueron excluidos del análisis de datos, el fondo local era restan, y las intensidades totales, así como las relaciones de intensidad de fluorescencia de los dos colorantes, se calcularon para cada punto. Análisis del gráfico se realizó utilizando la versión accesible en línea de software de SpectralWare (Genómica Espectral) mediante la normalización media global de los datos. Además, los conjuntos de datos se analizaron utilizando Microsoft Excel. (experimento de dos señales procedentes del clon duplicado de la matriz y las dos señales del color inverso) después de realizar media mundial y normalizaciones mediana globales, las relaciones medias de cuatro señales fluorescentes para cada clon se calcularon. Todos los análisis se llevó a cabo en el registro
2 ratios. Para reducir los resultados falsos positivos, los clones que muestra el valor del ratio de prueba /referencia mayor que 1,2 se consideraron ganaron y los clones que muestran prueba /referencia de valor de la relación menor que 0,8 se consideran perdidos, pero sólo si los resultados de las cuatro señales fluorescentes fueron consistentes. Los clones fueron excluidos del análisis si los valores de la relación de los cuatro puntos hibridados de cada clon superan los valores umbral (0,8-1,2) en cuestión no concordante.
Evaluación cuantitativa por PCR de la longitud del telómero
longitud de los telómeros se evaluó en ADN tumoral de todos los casos de cáncer de recto y de otras con ADN utilizando ADN epitelio normal del colon adecuada como se ha preparado para el ensayo de CGH array [14 ]. En una parte de los casos, el ADN estaba disponible PBL y se extrajo usando las químicas de Gentra Autopure como se describe anteriormente.
Se prepararon dos mezclas de reacción de reactivos de PCR, uno con el primer par T y el otro con el par de cebadores S. Quince microlitros de la mezcla maestra T se añadieron a cada pocillo de muestra, el control del pozo y así curva estándar de la primera placa y se añadieron 15 l de la mezcla maestra S para cada muestra, así, controlar bien y estándar así curva de la segunda placa.
Para cada muestra ensayada, se añadieron tres alícuotas de 5 idénticos mu l de la muestra de ADN (15 ng /alícuota) a la placa 1 y se añadieron otros 3 alícuotas a la misma posición bien en la placa 2. Para cada curva estándar , una muestra de ADN de referencia se diluyó en serie en TE por 1: 2 veces por dilución para producir seis concentraciones de ADN que van desde 0,78 a 25 ng /l.
Cinco microlitros de cada concentración se distribuyó a los pozos de la curva estándar en cada placa. Las placas se sellaron con una tapa adhesiva transparente, se centrifugaron brevemente a 800 g y se transportan en hielo para el instrumento ABI 7900HT para el análisis.
El T y S PCR se prepararon de forma idéntica, con la excepción de los cebadores de oligonucleótidos. Las concentraciones finales de los reactivos en la PCR fueron 20 mM Tris-HCl, 0,2 mM de cada dNTP, MgCl² 2,0 mM, 1% de DMSO, 150 de tinte ROX nM, 0,2X SYBR Green I (Molecular Probes), DTT 5 mM, 1,25 U ADN polimerasa AmpliTaq Gold (Applied Biosystems). Las concentraciones finales de los telómeros de cebadores fue 1b tel, 600 nM; tel 2b 900 nm. El gen de control (B2-globina en 11 cromosomas) las concentraciones era HBB1 300 nm; HBB2 700 nm. Las secuencias de los cebadores (escrito 5 '- 3') era tel 1b: CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT;
tel 2b: GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT;
HBB1: GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC;
HBB2: CACCAACTTCATCCACGTTCACC.
Todos los PCR se realizaron en el ABI rápida en tiempo real 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las condiciones de ciclo térmico para ambos pares de cebadores comenzaron con una incubación C 95 ° durante 10 minutos para activar la ADN polimerasa AmpliTaq Gold. Para los telómeros PCR, esto fue seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos, 54 ° C durante 2 minutos. Para la PCR HBB, esto fue seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos, 58 ° C durante 60 segundos, y 72 ° C durante 30 segundos. A continuación, los datos se analizaron con el software ABI SDS para generar la curva estándar para cada placa.
Metodología para ABI 7900HT utilizando SYBR Green Tinte 1 |
La hebra doble SYBR Green 1 colorante de unión se une no específicamente a ADN de doble cadena y genera un perfil de emisión de excitación. Para la PCR cuantitativa, SYBR Green 1 se utilizó con un colorante de referencia pasivo (ROX). El instrumento 7900HT analizó el ciclo de cambio de ciclo en la señal de fluorescencia como resultado de la amplificación durante una PCR. Durante la amplificación normal del producto PCR tres regiones caracterizan la progresión de la PCR.
telómeros de longitud de análisis
longitudes
telómeros medidos por PCR suelen presentarse como una relación de los telómeros (T) y mediciones gen estándar (S) (T /S). Como la longitud de pares de bases es intuitivamente fácil de comprender, las relaciones fueron transformadas en longitud de pares de bases utilizando una fórmula previamente validado informado con la técnica por Cawthon descrito anteriormente [14]. Los resultados de las pruebas estadísticas que comparan grupos son los mismos si se utilizan relaciones de la T /S o la longitud del telómero. Como la longitud de pares de bases es intuitivamente fácil de entender, se realizaron transferencias de Southern para determinar los fragmentos de restricción longitud del telómero (TRF) en un subgrupo de participantes (n = 16) y una regresión lineal se utilizó para comparar la longitud TRF a la relación T /S , dando como resultado la siguiente ecuación: BP = [T /S] * 1470,8 + 7674,5 donde 1470,8 representa la pendiente de la línea de la comparación de la relación relativa /S T para la medición de la longitud de los telómeros en pares de bases por la media TRF y 7674,5 es la y en el origen.
mutación p53 análisis
Las cantidades suficientes de ADN tumoral estaban disponibles en 17 de los 19 tumores para detectar mutaciones de p53 somáticas. amplificación
PCR se realizó en un volumen total de 12,5 l que contenía 5 ng de ADN genómico, cada cebador a 0,2 mM, dNTP a 0,2 mM, MgCl 2,0 mM
2, 0,5 U de Taq polimerasa (AmpliTaq oro, Applied Biosystems, CA) con tampón de reacción PCR proporcionado por el fabricante. cromatografía líquida de alta resolución desnaturalizante (DHPLC) Los análisis seguido por secuenciación directa de los productos de PCR se realizaron como se describe anteriormente (14).
La secuencia de codificación y los sitios de unión de empalme de
TP53
exones 5-8 fueron amplificados mediante PCR 4 pares de cebadores intrónicas de la siguiente manera:
Exon5F 5 'CGC GTC TTC CAG TTG CTT 3'
Exon5R 5 'CAA CCA CCG TCG CTG TCT TC 3'
Exon6F 5 'GGG GCT GGA GAG ACG ACA 3'
Exon6R 5 'TCC TCC CAG AGA CCC CAG TT 3'
Exon7F 5 'CTT GCC ACA GGT CTC CCC AA 3 '
Exon7R 5' AGG GGT CAG CAA CGG ACG GA 3 '
Exon8F 5' AAA TGG GAC GAC AGG TAG 3 '
Exon8R 5' AAG TGA ATC TGA GGC ATA AC 3 'en
Todas las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen de reacción de 25 l que consta de tampón 10X PCR II (Applied Biosystems, Foster City, CA), MgCl2 2 mM, 2,5 mM de cada dNTP, 10 mM de cada cebador, 0,75 unidades de ADN polimerasa Taq AmpliGold (Applied Biosystems, Foster City, CA), y 10 ng de ADN molde. PCR se realizó usando un termociclador tétrada (MJ Research, Waltham, MA) con las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94 ° C durante 9 minutos, seguido de 35 ciclos a 94 ° C durante 30 segundos, (58 ° C durante 30 segundos exones 5,6,7) y (55 ° C para el exón 8), 72 ° C durante 45 segundos, y extensión final a 72 ° C durante 10 minutos. Los productos de PCR se corrieron en un gel de agarosa de verificación 2%. Los productos de PCR se prepararon para la secuenciación de ADN como sigue: 5 l de producto de PCR con 1 l cada exonucleasa y 10 veces con fosfatasa alcalina de camarón TUF el tampón después corrió en un termociclador tétrada con las siguientes condiciones: 37 ° C durante 15 minutos, 80 ° C durante 15 minutos. 1.6pmol de imprimación junto con la plantilla fueron secuenciados en el ABI PRISM ™ 3700 DNA Analyzer (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA 94404) en la Facilidad Core. Mutación Surveyor Software (SoftGenetics LLC, State College, PA) se utilizó para analizar los resultados.
Evaluación de la activación de la telomerasa en el CCR
actividad de la telomerasa
se midió usando el trapecio
TM detección de telomerasa equipo. (Chemicon International). tejido tumoral macrodissected se homogeneizó en 200 l de tampón de lisis 1x CHAPS, después se incubaron durante 30 min en hielo y se centrifugó a 4 ° C y 12.000 g durante 20 minutos. A 2,0 l de este sobrenadante, 5,0 l de tampón 10X TRAP, 1,0 l de una mezcla de 10 veces d-NTP, se añadió 1,0 l de mezcla de cebador TS y 0,4 l de TaqDNA polimerasa hasta un volumen total de 50 l. extensión de los telómeros a 30 ° C durante 10 minutos fue seguida por 30 ciclos de PCR a 94 ° C durante 30 segundos y 60 ° C durante 30 segundos. 10 l de producto de PCR se ejecutó en un gel de poliacrilamida 12% y se tiñeron con SYBR
TM oro (Molecular Probes, Eugene, OR). El gel se fotografió con un transiluminador UV y la escalera. Actividad de la telomerasa se expresó como la relación de bandas entre la escalera del producto de PCR y el control interno.
Evaluación de ALT
ADN C-Circle telomérico son parcialmente círculos de ADN de los telómeros de cadena sencilla específicos para células exhibiendo ALT [15]. C-círculos se evaluaron en el ADN tumoral mediante la amplificación isotérmica de C-círculo cadena complementaria e hibridación con
32P (CCCTAA)
3 sonda por Capital Biosciences (Capital Biosciences, Maryland, EE.UU.). Una muestra de ADN fue llamado ALT + si se detectaron C-círculos. C-círculos son el ADN telomérico extracromosómico parcialmente compuesta de dobles círculos teloméricas multifilares con un ADN telomérico parcialmente bicatenario con una rica hebra continua C y G incompleta rica cadena. C-círculos están fuertemente asociados con la presencia de ALT [15].
Enfoque analítico
Para establecer el estado de CIN sobre la base de las ganancias o pérdidas cromosómicas, los datos fueron analizados en R utilizando el paquete de aCGH Bioconductor [16].
El filtrado se llevó a cabo para eliminar clones sin asignar, clones de mapeo para el cromosoma Y, y los clones que faltan en más del 25% de los sujetos. a continuación, se imputó observaciones faltantes utilizando un enfoque LOWESS. La fracción de los participantes con las ganancias o pérdidas de cada clon fue trazada por el número de cromosomas y la ubicación, por estado de CIN (Figura S1)
.
Además, se utilizó la prueba de Wilcoxon para evaluar la diferencia en la longitud de los telómeros CRC tumoral entre: 1) CIN + y Cin- muestras de cáncer de recto, 2) ALT + y M-, y 3) la telomerasa + y muestras telomerase- [17]. pruebas de Chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher se utilizaron para evaluar la asociación entre el estado y el estado de ALT CIN, y entre el estado de activación de la telomerasa y el estado de la NIC. Se calculó la correlación de Spearman entre la longitud de los telómeros tumor de cáncer rectal y el porcentaje de clon con ganancias o pérdidas.
Resultados
Array CGH evidenció una amplia variación en el número de copias de ADN cambios
Se estudiaron 19 jóvenes de aparición del SMS cánceres rectales para la evidencia de CIN usando aCGH compuesto por aproximadamente 3000 BAC. Hemos demostrado que hay MSS tumores rectales que tienen niveles muy bajos de cambios de número de copias de ADN. Seis tumores (32%) tenían niveles bajos de interrupción cromosómico con & lt; 1% a 17% de los clones que tienen cambios de número de copias de ADN y se clasificaron como CIN- por aCGH. Trece tumores (68%) tuvieron & gt; 20% de los clones que muestran cambios de número de copias de ADN y se clasificaron en el grupo CIN +. tumores MSS Cin- tenían de 0 a menos de 5 brazos cromosómicos que fueron completamente aumentaron o disminuyeron, en comparación con el grupo CIN +, que tenían entre 8 y 18 brazos cromosómicos que muestra la ganancia o pérdida (Figura S2) completa.
Fracción de ganancias o pérdidas en el cáncer de recto CIN + y CIN-
La fracción de los participantes con las ganancias y pérdidas por región cromosómica para sujetos con CIN + cáncer rectal en comparación con aquellos con cáncer de recto CIN- se muestran en la figura S1. No se observaron diferencias en las ganancias o pérdidas en todo el genoma, con las diferencias más pronunciadas en los cromosomas 13, 17 y 18. CIN + cáncer rectal había más ganancias /pérdidas que el cáncer de recto CIN- (media: 33,1 vs 9,7, p = 0,0007, Tabla 1 ).
CIN +
CIN-
Media (DE) o% Media (DE) o% p-valueFraction ganancias /pérdidas, con una media (SD) 33,08 (8,76) 9,66 (7,92) 0,0007 longitud de los telómeros, la media (SD) 8211 (308) 9178 (1396) 0.0066Telomerase0.0949 Yes80.0% 25,0% 75,0%% No20.0 ALT0.2335 Yes50.0% 100,0% 0,0%% No50.0 Yes36 p530.3348 0,4% 66,7% 33,3% No63.6% Tabla 1. Características de CIN + y el cáncer de recto CIN-
la tumores de cáncer colorrectal evaluados con CGH array se clasificaron como 1) CIN- si. & lt; 20% de los clones mostró copias de ADN cambios de número o como 2 + CIN) si ≥ 20% de los clones mostró copias de ADN cambios de número. CIN + CRC tuvo un mayor número de casos que exhibió ganancias y pérdidas por región cromosómica en comparación con los de CIN- CRC. CIN + CRC tiene telómeros significativamente más corta tumorales (8211 pb) que CIN- CRC (9178 pb; p = 0,0066). tumores CIN + eran más propensos a mostrar la activación de la telomerasa que eran CIN- CRC, aunque no hubo correlación con el estado CIN de un tumor y con qué frecuencia un tumor utiliza el alargamiento de los telómeros alternativa como un mecanismo de mantenimiento de los telómeros (p = 0,2335). La presencia de mutaciones de p53 no se correlacionó con el estado CIN del tumor (p = 0,3348). Descargar CSV CSV
longitud de los telómeros en CIN + y el cáncer de recto CIN-
El cáncer rectal longitud de los telómeros se asoció significativamente con el estado de CIN, de tal manera que CIN- cáncer rectal tenía telómeros más largos que el CIN + cáncer rectal (p = 0,0066, Figura 1). longitud de los telómeros también se correlacionó significativamente con el porcentaje de clones con ganancias o pérdidas (r = -0.50, p = 0.0310).
Panel A: La longitud de los telómeros de ADN tumoral en el cáncer rectal cromosómicamente estable (CIN-) es significativamente más larga que la del cáncer cromosómicamente inestable (CIN +) rectal (p = 0,0066). CIN estado se determina como si CIN- de & lt; 20% de los clones muestran el número de copias de ADN ganancias o pérdidas. El cáncer rectal es CIN + si más del 20% de los clones tienen ganancias o pérdidas.
Panel B: activación de la telomerasa (telomerasa +) en el cáncer rectal se correlaciona con la más corta longitud de los telómeros tumor que en los tumores que no utilizan la telomerasa (telomerasa -) como un mecanismo de mantenimiento de los telómeros (p = 0,0040)
Entre los tumores Cin-, los telómeros eran más largas en el ADN tumoral en comparación con el ADN de las células epiteliales normales correspondientes. En contraste, los telómeros en el ADN del tumor CIN + eran más cortos que los de DNA correspondiente epitelio normal. (P = 0,0039).
Además, evaluó si las diferencias en longitud de los telómeros o el estado CIN pueden estar relacionados con la activación de la telomerasa o ALT. Hemos observado que los tumores con telómeros más cortos eran más propensos a tener la activación de la telomerasa (p = 0,0040; Figura 1, Panel B), pero la longitud del telómero tumor no se correlacionó con la presencia de ALT (p = 0,4923; Tabla 2). tumores CIN + eran más propensos a mostrar la activación de la telomerasa que eran tumores Cin- (p = 0,0949; Tabla 1], pero no había una diferencia en las ganancias /pérdidas entre CRC con la activación de la telomerasa y la CRC sin activación de la telomerasa (p = 0,3168; Tabla 1 .) lo contrario era cierto con respecto a ALT tumores Cin- eran más propensos que los tumores CIN + para mostrar evidencia de ALT (p = 0,2335;. La tabla 1), aunque aquellos tumores que eran ALT- tuvieron más ganancias /pérdidas que ALT + CRC (media : 39,3 vs 22,6, p = 0,0091; Figura 2, Tabla 2) Los tumores que se alargan los telómeros a través de la formación de C-Círculo exhibido no está presente en los tumores Alt (Figura 3) guía empresas longitud del telómero
ganancias fracción.. /pérdidas
media (DE)
valor p
media (DE)
valor p
CIN CIN Status0.00660.0007 + 8211 (308) 33,1 (8,8) CIN- 9178 (1396) 9,7 (7,9) Telomerease0.00400.3168 Yes8193 (295) 28,8 (14,3) No9307 (1512) 19,2 (16,4) ALT0.49230.0091 Yes8676 (1208) 19,6 (13,5) No8226 (397) 38,7 (7,9) p530.54140.7726 Yes8443 (370) 26,3 (17,0) No8676 (1281) 22,9 (12,0) Tabla 2. la longitud del telómero y la fracción de las ganancias /pérdidas de clones por las características del tumor.
tumores del cáncer rectal evaluados con CGH array fueron clasificados como 1) CIN- si se convierte la ; el 20% de los clones mostró copias de ADN cambios de número o como 2) + CIN si ≥ 20% de los clones mostró copias de ADN cambios de número. Los tumores con telómeros más cortos eran más propensos a ser CIN + (p = 0,0066) y de tener la telomerasa activado (p = 0,0040). Ni la presencia de alargamiento alternativo de los telómeros (ALT) (p = 0,4923) ni la presencia de estado de la mutación p53 en correlación con la longitud del telómero tumor (p = 0,5414). CIN + cáncer rectal tenía una mayor fracción de clones que mostraba las ganancias y pérdidas que los tumores Cin- (p = 0,0007). Los tumores con o sin activación de la telomerasa no tenían una fracción significativamente diferentes de las ganancias o pérdidas de los clones (p = 0,3168). Sin embargo, para los tumores que presentan ALT la fracción de ganancias y pérdidas de clones era menor que la de los tumores sin evidencia de ALT (p = 0,0091) .No diferencia se ve en la fracción de las ganancias o pérdidas clon entre los tumores con o sin mutaciones de p53 ( p = 0,7726). Descargar CSV CSV
Los tumores que eran ALT-exhibió significativamente más cromosómica ganancias /pérdidas que ALT + cáncer rectal (p = 0,0091).
Panel A. hematoxilina y eosina secciones de tejido de un SMS CIN- , ALT +, cáncer rectal Telomerase- (izquierda) y desde MSS CIN +, ALT-, telomerasa + cáncer de recto. Ambos son adenocarcinomas moderadamente diferenciados. La relación de la glándula a estroma es mayor en el ALT + /tele- caso, y tiene estroma desmoplásico menos
.
Panel B. Dot /blot que muestra la presencia de C-círculos. C círculos, teloméricas de ADN extracromosómico, están fuertemente asociados con ALT. Evaluada en el ADN tumoral con la amplificación isotérmica de C-círculo cadena complementaria e hibridación con
32P (CCCTAA)
3 sonda por Capital Biosciences (Capital Biosciences, Maryland, EE.UU.), una muestra fue llamado ALT + Si C-círculos fueron detectados. La ALT +, la telomerasa tumoral negativo en la izquierda tuvo & lt; 10% de los clones BAC que muestra la hibridación aberrante y se clasifica como un tumor CIN-. La ALT - ,, telomerasa tumor positivo a la derecha tenía el 40% de los clones con la hibridación aberrante y se clasifica como un tumor CIN +.