Extracto
El cáncer de ovario es el más mortal de las enfermedades ginecológicas y la quinta causa de muerte por cáncer entre las mujeres estadounidenses. Esto es principalmente debido a la falta de herramientas de pronóstico capaces de detectar las primeras etapas de cáncer de ovario y a la alta tasa de resistencia a los regímenes quimioterapéuticos actuales. En este escenario la tasa de supervivencia global a 5 años para los pacientes con cáncer de ovario diagnosticados en etapa tardía es menor que 25%. Anormalidades asociadas con el fenotipo maligno y los mecanismos de progresión tumoral no se entienden claramente.
In vitro
son necesarios estudios, sin embargo, se han visto obstaculizados por las limitaciones acompañados con el uso de líneas celulares de cáncer de ovario y de la heterogeneidad de la población de células de cáncer de ovario derivado de los fluidos de ascitis. En este estudio se presenta un método simple, rápido y reproducible para el aislamiento y caracterización de células de cáncer de ovario a partir de tejido de tumor sólido y demostrar que la digestión enzimática durante 30 minutos con dispasa II da como resultado la recuperación más eficaz de cáncer de ovario epitelial viable (EOC) Células. Las preparaciones de células de cáncer resultante (EOC) demuestran un rendimiento significativo, altos niveles de viabilidad y son fibroblastos libre. Crecen hasta seis pasajes y conservan la capacidad de formar estructuras esferoides-como en agarosa. Además, pueden ser genéticamente manipulados y utilizados para la detección de drogas, haciendo así que sean muy adecuadas para aplicaciones posteriores. En particular, el aislamiento de las células de cáncer de ovario a partir de muestras sólidas utilizando este método tiene la ventaja de permitir para el aislamiento de células cancerosas a partir de las primeras etapas de cáncer de ovario, así como la obtención de las células de sitios de cáncer de ovario se define ya sea primarios y /o metastásicos. Por lo tanto, estas células son muy adecuados para las investigaciones dirigidas a la comprensión del cáncer de ovario
Visto:. Sueblinvong T, R Ghebra, Iizuka Y, Pambuccian SE, Isaksson Vogel R, Skubitz APN, et al. (2012) Creación, Caracterización y Aplicación Aguas abajo de las células del cáncer de ovario primarios derivados de tumores sólidos. PLoS ONE 7 (11): e50519. doi: 10.1371 /journal.pone.0050519
Editor: Elad Katz, de la Universidad de Edimburgo, Reino Unido
Recibido: Abril 23, 2012; Aceptado: 22 Octubre 2012; Publicado: noviembre 30, 2012
Derechos de Autor © 2012 Sueblinvong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Defensa OC093424 Programa de Investigación del cáncer de Ovario (OCRP) para MB y APN y por la Investigación del cáncer Randy máquina de afeitar y el Fondo de la Comunidad de MB. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las características morfológicas y estudios de genética molecular han establecido que el cáncer de ovario es una enfermedad heterogénea que abarca una serie de diferentes histotypes incluyendo carcinoma seroso de alto grado [1]. El régimen actual de la quimioterapia para el cáncer de ovario consiste en taxano y la terapia a base de platino. Mientras que & gt; 80% de los pacientes con enfermedad en estadio temprano muestran una supervivencia a 5 años, el tratamiento ha limitado la eficacia contra el cáncer de ovario epitelial en estadio avanzado (EOC). La falta de herramientas de diagnóstico y pronóstico eficaces para el cáncer de ovario hace que este tipo de cáncer particular, muy difícil de manejar y la mayoría de los pacientes desarrollan tumores resistentes a la quimioterapia y la recaída [2], [3], [4], [5], [6]. Mucho de nuestro conocimiento actual del cáncer de ovario humano ha sido descubierto a través de la utilización de células inmortalizadas establecidos epiteliales de ovario superficie (IOSes), líneas celulares de cáncer de ovario y las células de cáncer de ovario primarios derivados de los fluidos ascíticos [7], [8]. El uso de IOSes y líneas celulares de cáncer de ovario tiene ventajas obvias incluyendo su alta capacidad proliferativa y la vida útil extendida. Desafortunadamente, tanto los cambios genéticos y fenotípicos asociados con
in vitro
pasajes extendidos en la heterogeneidad y la resultante de las células del cáncer de ovario primario de los fluidos ascíticos ellos un modelo ideal para los estudios de menos de cáncer de ovario hace. Por lo tanto, la capacidad para aislar y cultivar células fresco EOC de especímenes sólidos cáncer de ovario proporciona un modelo único para estudios de nuevos enfoques terapéuticos para el tratamiento del cáncer de ovario.
Varios métodos han sido descritos para el cultivo primario de ya sea epitelial humano superficie del ovario (OSE) células de ovarios normales o células EOC aislados del fluido de ascitis de pacientes con cáncer [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15] . Sin embargo, el crecimiento de células malignas de tumores sólidos ha sido problemática debido a las células del estroma o sobrecrecimiento de fibroblastos, poco o ningún crecimiento de células malignas, o la pérdida prematura de capacidad de proliferación en cultivo. Si bien hay varias opciones para crear una sola célula suspensiones de tumores sólidos a través de medios mecánicos o disociación enzimática, nadie se ha ocupado de la técnica que se obtiene el resultado más fiable [16], [17], [18]. En este estudio, se describe por primera vez una comparación sistemática entre la rotura mecánica y la digestión enzimática con cualquiera de colagenasa A, hialuronidasa o dispasa II para diversas cantidades de tiempo de 30 a 120 minutos para el aislamiento de células EOC de los tumores de cáncer de ovario sólidos. Nos informan de que la digestión enzimática durante 30 minutos con dispasa II da como resultado la recuperación más eficaz de células viables EOC y que la exposición prolongada a la digestión enzimática se acompaña con disminución significativa en la recuperación de células viables.
Los cultivos celulares de EOC fibroblastos son libres, como se evaluó mediante tinción EpCAM con el MOC-31 y Ber-EP4 mAb, y creció de manera exponencial durante un máximo de seis pasajes antes de que seniles y murieron. Es importante destacar que las culturas EOC conservan algunas de las características fenotípicas de los tumores de la cual se originaron, incluyendo la capacidad para formar estructuras esferoidal como sobre sustratos de agar. Por último, las culturas EOC eran adecuados para aplicaciones posteriores ya que eran muy susceptibles a la manipulación genética por medio de la infección lentiviral y útil en las pruebas de detección de drogas.
A. Media ± desviación estándar del número total de células viables por 500 mg de tejido derivadas de cada condición inmediatamente después del tratamiento (es decir, culturas pre-adhesión) y luego otra vez después de 7-10 días de adhesión en cultivo de tejidos (es decir, cultivos adherentes). B. Porcentaje de viabilidad celular para cada condición expresa como porcentaje de cultivos pre-adhesión para cultivos adherentes. medios mínimos cuadrados (ajustados por repeticiones dentro del paciente) de ocho experimentos independientes y se presentan los intervalos de confianza del 95%.
Materiales y Métodos
Materiales
La siguientes materiales se adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA) medios de cultivo celular: DMEM, suero bovino fetal (FBS), 100X penicilina-estreptomicina, 0,05% w /v de tripsina-EDTA. Enzimas:. Dispasa II y colagenasa A (Roche, Indianapolis, IN), hyalorunidase (EMD Chemicals, Gibbston, NJ): perfil
(a) Los ejemplos representativos de células EOC primarias aisladas de muestras de cáncer después de dos días de cultivo ( flecha indica eritrocitos); (B) Remolino-como grupos de células EOC después de 3-4 días de cultivo (flecha indica los racimos en crecimiento); (C) Una colonia de células de EOC se extienden en el plástico de cultivo de tejidos después de 7-8 días en cultivo; (D) Una monocapa confluente de células EOC que representan la morfología típica de adoquines epitelial después de 13-14 días de cultivo; y (e) Una monocapa confluente de fibroblastos aquí utilizó como control negativo.
Los anticuerpos.
Los dos anticuerpos monoclonales que reconocen EpCAM, Ber-EP4 y MOC-31, se compraron de Dako (Carpinteria, CA) y se usó a la concentración recomendada por el fabricante para el análisis inmunohistoquímico. La decisión de utilizar estos dos en particular anti-EpCAM mAb se realizó debido a que han mostrado una mayor especificidad para las células epiteliales en comparación con otros marcadores epiteliales [19], [20], [21], [22] La CPI de las culturas COE primarios fue realizado por los técnicos certificados en el Laboratorio de Histopatología la inmunocitoquímica y del Centro Médico de la Universidad de Fairview en la Universidad de Minnesota, donde estos marcadores se utilizan habitualmente para la tinción de muestras quirúrgicas para confirmar su naturaleza epitelial, incluyendo muestras clínicas de cáncer de ovario. La PARP, β-actina y los anticuerpos de inmunoglobulina G anti-ratón y anti-conejo con peroxidasa vinculada se compraron de BD Pharmingen (San Diego, California) y Sigma (St. Louis, MO), respectivamente, y se utilizan a la concentración recomendada por el fabricante para el análisis de inmunoblot
las líneas celulares
las líneas celulares de cáncer de ovario humanos ES-2 y NIH:... OVCAR5 se fue adquirido de la American Type Culture Collection (Manassas, VA)
Un bloque de FFPE de ovario normal, que representa tinción positiva para EpCAM tanto con los anticuerpos monoclonales Ber-EP4 y MOC-31 de las células epiteliales de ovario normales superficie. Un bloque de FFPE de adenocarcinoma de ovario seroso que representa tinción positiva para EpCAM tanto con los anticuerpos monoclonales Ber-EP4 y MOC-31 de las células EOC dentro del tumor. La tinción inmunocitoquímica de las culturas EOC incluidos en parafina con los anticuerpos monoclonales Ber-EP4 y MOC-31 que representan la tinción positiva para EpCAM. La tinción inmunocitoquímica de cultivos de fibroblastos embebidos en parafina con los anticuerpos monoclonales Ber-EP4 y MOC-31, aquí utilizaron como controles negativos.
Configuración Reactivo
Completo medio DMEM.
DMEM fue suplementado con 10% FBS, y 100 unidades de penicilina-estreptomicina. El medio fue almacenado a 4 ° C y se calentó a 37 ° C antes de su uso.
enzimas.
dispasa II (2,4 U /ml), hialuronidasa (0,0369 U /ml) y la colagenasa se diluyeron a (0,15 U /ml) en PBS, se dividió en alícuotas y se almacenó a -20 ° C en un congelador no-frost.
a. Se evaluaron los cultivos de células de EOC (donantes 8) derivados de 30 minutos de digestión enzimática con dispasa II o hialuronidasa para su proliferación durante un período de 5 días (D1, D3, D5). Los experimentos se realizaron por triplicado. B. Tiempo de duplicación de las células tratadas con dispasa II durante 30 minutos (
Top of) o hialuronidasa 30 minutos (
inferior) calculado por análisis de regresión no lineal.
colección de tejidos
Ocho muestras de tejido (~ 5 g) en el tamaño de los tumores de EOC se obtuvieron de la Universidad de Minnesota Servicio de Adquisiciones de tejidos (TPF) después Comité Institutional Review Board: Junta de Sujetos Humanos (IRB) la aprobación. En concreto, el consentimiento fue cortado por el IRB de la Universidad de Minnesota.
La edad de los pacientes osciló entre 47 y 68 años de edad. La edad promedio de los pacientes era de 60. Las muestras de tejido se obtuvieron de áreas macroscópicamente identificados como el cáncer por los patólogos. Las muestras fueron desprovistos de identificación y registradas siguiendo el protocolo del Fondo para Adquisición de tejido BioNet. muestras de tejidos seleccionados fueron colocados en tubos cónicos de 50 ml estériles que contienen DMEM enfriado con hielo, que luego fueron entregadas a un laboratorio de cultivo celular en un cubo de hielo dentro de 30 minutos desde la recogida de la muestra fresca.
Las áreas adyacentes de todos Los tumores fueron sometidos a procesamiento de tejidos ulterior de rutina (fijación en formol y la inclusión en parafina). El análisis histopatológico de secciones para evaluar la sub-tipo, grado de cáncer de ovario y puesta en escena basada en los datos patológicos y de imagen realizadas por los patólogos quirúrgicos en la Universidad de Minnesota Medical Center, Fairview.
(a) células de donante EOC 8 estructuras que forman esferoides que se extienden sobre agarosa; (B) NIH: OVCAR5 línea celular de cáncer de ovario humano esferoides también formados (control positivo); (C) células de donante EOC 8 transfectadas con el que expresan GFP lentivirus PEF-GFP-SIN; y (d) de contraste de fase del mismo campo.
cáncer ovárico epitelial (EOC) protocolo de aislamiento.
especímenes tumorales (~ 5 g) se dividieron con un bisturí en diez piezas de igual peso (~ 500 mg) que se colocaron en 60 mm placas de Petri que contenían 5 ml de DMEM y más corte en trozos más pequeños de aproximadamente 2 mm. Para la rotura mecánica, la suspensión muestra se presiona a través de una malla de 70 micras con un émbolo de la jeringa y el filtrado celular se centrifugó a 1200 rpm durante 7 minutos a 4 ° C. Las nueve muestras restantes fueron procesados a través de la digestión enzimática mediante la adición de cualquiera de colagenasa A, hialuronidasa o dispasa II, a continuación, se incubaron durante 30 a 120 minutos, en cuyo momento se pasaron las suspensiones celulares a través de la malla 70 micras y se centrifugó como se ha descrito anteriormente. Después de la resuspensión en DMEM que contenía FBS al 10%, se evaluaron las muestras para cada condición para la viabilidad celular por exclusión de tripan colorante azul. El medio se cambió 24 horas después de la siembra inicial y cada tres días durante las dos semanas siguientes.
Inmuno análisis.
El análisis inmunocitoquímico para la expresión de EpCAM con los anticuerpos monoclonales MOC-31 y Ber-EP4 fue realizado en células de cáncer de ovario que estaban en cultivo durante 14 días. Específicamente, las células de cáncer de ovario primarios se cosecharon por tripsinización, se lavaron con PBS y se centrifugaron. El sedimento celular se deriva posteriormente fijado en formol y embebidos en parafina (FFPE EOC) para generar bloques de celdas. Las secciones fueron sometidas a tinción inmunocitoquímica utilizando la Ventana XT automatizado de Ventana Medical System (Tucson, Arizona). Brevemente, los portaobjetos se desparafinaron y después de la recuperación de antígenos, se incubaron con los anticuerpos monoclonales contra EpCAM (MOC-31 y Ber-EP4) para 32 y 16 minutos, respectivamente, antes de la tinción con el kit de detección iVIEW DAB de Dako (Carpinteria, CA). La inmunocitoquímica se llevó a cabo en el Laboratorio de Histopatología de la Universidad de Fairview Centro Médico de la Universidad de Minnesota.
Medición de la viabilidad celular.
El número de células y la viabilidad de los cultivos de EOC se determinó mediante la exclusión de azul de tripano ensayo.
Anchorage ensayo independiente.
el método utilizado para el ensayo independiente del anclaje se basa en la técnica de superposición de líquido como se describe anteriormente [23]. En pocas palabras, para prohibir la adhesión celular a un sustrato, las placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) fueron recubiertas con 200 l de 0,5% SeaKem LE agarosa (Aplicaciones Biowittaker moleculares, Rockland, ME) en medio libre de suero , y se dejó solidificar durante 30 minutos a 20 ° C. NIH: OVCAR5 o EOC suspensiones de células (5.000 células) se dispusieron en capas sobre la parte superior de las placas de sólidos de agarosa recubiertas de a un volumen de 1 ml /pocillo en DMEM suplementado con 10% de FBS y luego se incubaron durante 48 horas a 37 ° C
morfología de las células y esferoides.
a microscopio invertido Nikon Eclipse TE 2000E se utilizó para la formación de imágenes de la morfología celular con contraste de fase. Las imágenes fueron capturadas con Spot 3.5.8 software de adquisición (instrumentos de diagnóstico, Sterling Heights, MI).
La infección de EOC con lentivirus.
El lentivirus vector pEF-GFP-SIN, el sobre VSVG y el delta-8,9 plásmidos se co-transfectaron en las células 293T para la producción de virus como se describe anteriormente [24]. El sobrenadante de virus se infectó spin-en presencia de 10 g /ml de polibreno a 1 × 10
5 de las células EOC a 2500 rpm durante 2 horas a 33 ° C. expresión de GFP se monitorizó 48 horas después de la infección.
análisis de transferencia de Western.
proteína celular total (10-20 g) de cada muestra se separó por SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF y se sometió a análisis de Western blot utilizando anticuerpos PARP y ß-actina.
a. Los cambios morfológicos en las células EOC ya sea simulada tratados o tratados con Bortezomib (2 nM) y vorinostat (6 M) solo y en combinación durante 18 horas. B. Ejemplos representativos de lisado de células EOC de donantes 1 y 8 (
superior y el panel medio
) o la línea ES-2 humano de ovario de células cancerosas (
panel inferior
) ya sea modelo de tratamiento o tratados con Bortezomib (2 nM) y vorinostat (6 M) o Bortezomib (6 nM) y vorinostat (3 M), respectivamente, solo y en combinación durante 18 horas y a inmunotransferencia con un anticuerpo que reconoce de longitud completa y las formas escindidos de PARP. La igualdad de carga de proteína se verificó mediante el uso de un anticuerpo dirigido contra β-actina. * = Una banda específica. C. Aumento de la especie-PARP escindida en el simulacro frente a las células tratadas con COE expresadas como proporción de la PARP escindida plena longitud /troceados.
El análisis estadístico
Todos los resultados se analizaron mediante efectos mixtos modelos de regresión lineal con efectos fijos para el tratamiento o la duración del tratamiento según el caso y un efecto aleatorio para la fuente del tumor. A pesar de la falta de normalidad de algunos de los datos, modelos de regresión lineal son bastante robustos y permiten la inclusión de efectos aleatorios. se informó de mínimos cuadrados medios y los errores estándar y los valores de p se ajustaron para comparaciones múltiples utilizando una corrección de Bonferroni. Todos los niveles de significación se fijó en 0,05. Cálculo del tiempo de duplicación de las células (DT) se obtuvo mediante análisis de regresión no lineal usando Prism (GraphPad V.5, San Diego, CA).
Resultados y Discusión
Comparación de las técnicas de disociación
Si bien la rotura mecánica y digestión enzimática representan dos opciones obvias para el aislamiento de células EOC de muestras de tumores sólidos, no se ha hecho una comparación directa para determinar qué procedimiento da como resultado un mayor rendimiento celular y la viabilidad. Para abordar esta cuestión, ocho muestras clínicas de cáncer de ovario sólidos, incluyendo cinco adenocarcinomas serosos de alto grado, dos seroso borderline y uno carcinomas de alto grado no diferenciadas (Tabla 1) se recogieron en el momento de la cirugía y sometidos únicamente a la rotura mecánica o para la digestión enzimática seguida de disrupción mecánica. En concreto, cada muestra se cortó en muestras de igual peso (500 mg) y después se somete únicamente a la rotura mecánica mediante el uso de un tamiz celular 70 um o se digirieron enzimáticamente para 30, 60 o 120 minutos con dispasa II, hialuronidasa o colagenasa A y luego perturbado mecánicamente por el paso a través de un tamiz de 70 micras. Para cada condición, el número de células y la viabilidad se evaluó por trypan exclusión del colorante azul en dos momentos: inmediatamente después del procesamiento de las muestras (las culturas pre-adhesión) y después de un período de siete a diez días (cultivos adherentes) guía
. El número inicial de células recuperadas (es decir, cultivos de pre-adhesión) era más alto cuando los tumores fueron únicamente interrumpidas mecánicamente sin tratamientos enzimáticos. No es sorprendente que el número total de células inicialmente se recuperó tras el tratamiento enzimático con el aumento de la longitud de tiempo que el tejido se expuso a los diversos tratamientos enzimáticos. El mayor porcentaje de recuperación de células, basado en el número de partida de células, se produjo cuando las células se expusieron durante 30 minutos a dispasa II (Figura 1A). Aunque no es estadísticamente significativa después del ajuste para comparaciones múltiples, la recuperación de células media por ciento cuando las células fueron expuestas a dispasa II durante 30 minutos (58,0%) es superior a los demás, sobre todo mecánicos (19,9%; Figura 1B). Curiosamente, una semana después de la siembra (cultivos adherentes) aquellos tejidos que habían sido expuestos para los períodos más largos de tiempo para el tratamiento enzimático mostraron una disminución estadísticamente significativa en la recuperación de células viables (p = 0,02).
Tomados conjunto, esto sugiere que la alteración mecánica y tratamiento enzimático prolongada fueron particularmente duras en las células EOC y que una exposición de 30 minutos a dispasa II representa la mejor opción para la obtención de cultivos viables EOC.
características de crecimiento de EOC culturas y Caracterización de su naturaleza epitelial por EpCAM Inmunoticción
A continuación, hemos documentado los cambios morfológicos y propiedades de crecimiento de las células EOC recién aisladas derivadas de tumores sólidos. Dos días después de la siembra en DMEM suplementado con 10% FBS, las células EOC comenzaron a adherirse a la placa como se indica por la presencia de pequeños racimos adherentes (Figura 2A). En el día 2, los eritrocitos (flecha) todavía parecía ser viable en la cultura. Durante el día 4 (Figura 2b), las colonias de células adherentes EOC forman formas de remolino similar (flecha) y comenzaron a difundirse en la placa de cultivo de tejidos, mientras que los eritrocitos restantes desaparecieron progresivamente a partir del cultivo. Grandes agregados multicelulares también se observaron en esta etapa; estos más tarde desagregan en monocapas celulares. El día 7, los grupos iniciales de células EOC comenzaron a proliferar (Figura 2c). Por día 14, las células de EOC se convirtió en una monocapa confluente y se muestran la morfología típica epitelial de adoquines (Figura 2d), que parecía ser diferente de la de un cultivo de fibroblastos 14-días aquí utilizado como un control negativo (Figura 2e).
para confirmar la naturaleza epitelial de las culturas EOC de 14 días, el próximo realizó inmunocitoquímica (CPI) para el EpCAM marcadores epiteliales utilizando dos anticuerpos monoclonales diferentes, Ber-EP4 y MOC-31. Es importante destacar que, a diferencia de los fabricantes utilizan habitualmente, que no puede distinguir entre células epiteliales, células mesoteliales o fibroblastos, la Ber-EP4 y los anticuerpos MOC-31 exclusivamente tiñen para el marcador de EpCAM en las células epiteliales [19], [20], [21], [22]. La tinción con estos dos anticuerpos nos permitió evaluar la pureza de las células aisladas de EOC. Como se muestra en la Figura 3, las células EOC muestran la EpCAM tinción citoplasmática característica con ambos, Ber-EP4 y MOC-31 anticuerpos monoclonales. Las células EOC que aislados se componen de una población homogénea de células epiteliales. No se observaron diferencias en términos de pureza entre disrupción mecánica o técnicas de digestión enzimática (no mostrado). Como controles positivos, células epiteliales de ovario normales de superficie (nariz) y adenocarcinoma seroso también se tiñeron para el marcador epitelial EpCAM con ambos, Ber-EP4 y MOC-31 mAb Figura 3). Un cultivo de fibroblastos dos semanas de duración también se sometió a la CPI por el EpCAM marcadores epiteliales con Ber-EP4 y MOC-31 mAb como control negativo (Figura 3).
características de crecimiento de EOC culturas y sus Down- las aplicaciones de transmisión en
con el fin de evaluar las propiedades de crecimiento de los cultivos primarios obtenidos COE, que mide la tasa de proliferación de las células COE que se derivaron de 30 minutos de la digestión con dispasa II y hialuronidasa aproximadamente a los 14 días de aislamiento ( después de que se convirtió en una monocapa confluente, se muestra típica morfología de adoquines epitelial y la tinción positiva para el marcador epitelial EpCAM). Las células fueron controlados por la tasa de proliferación de tripano de exclusión de colorante azul de contar en el transcurso de siete días. Como se muestra en la Figura 4A, las células EOC de ambos tratamientos dispasa II y hialuronidasa crecieron con un tiempo de duplicación (DT) de 3,1 y 5,4 días, respectivamente, calculado por análisis de regresión no lineal (4B
top
y
inferior
). Además, las células obtenidas por estos dos métodos de digestión enzimática pueden ser pasados hasta seis veces en un período de 4 semanas antes de que seniles y murieron (no mostrado).
Un modelo único para el estudio de la progresión del cáncer de ovario, así como se prueba la sensibilidad de las células de cáncer de ovario a los nuevos agentes quimioterapéuticos
in vitro
depende de su capacidad para formar esferoides [23], [25]. En la cavidad peritoneal de pacientes con cáncer de ovario, esferoides, naturalmente, se forman en el líquido ascítico y, cuando se forman
in vitro
, que imitan la estructura tridimensional del cáncer en el propio tumor. Por lo tanto hemos probado las culturas COE primarios por su capacidad para formar estructuras de esferoide-como en un ensayo de crecimiento independiente de anclaje cultivándolas sobre el sustrato no adhesivo de agarosa. La línea celular de cáncer de ovario NIH: OVCAR5, que se conoce para formar esferoides, se utilizó como control positivo [26]. células EOC y NIH: células OVCAR5 eran igualmente capaces de formar estructuras esferoides similar durante siete días (Figura 5a y 5b, respectivamente). Los esferoides de agregados multicelulares eran de diferentes tamaños y estaban compuestos de decenas hasta casi un centenar de células por agregado.
La manipulación genética de células de cáncer de ovario primario es a menudo necesario para la comprensión de la función de los oncogenes y genes supresores de tumores durante la iniciación del cáncer de ovario y la progresión. Por lo tanto, hemos probado las culturas primarias COE por su capacidad para ser manipulado genéticamente a través de la infección con partículas de lentivirus que expresan GFP-pEF-SIN. La eficacia de la infección era & gt; 80% cuando se midió la relación entre las células que expresan GFP (Figura 5c, el canal azul) frente al número total de células (Figura 5d, de campo claro). Estos experimentos proporcionan pruebas de que las culturas COE primaria aisladas células conservan algunas de sus características fenotípicas /atributos.
Los estudios de toxicidad tuvo como objetivo determinar el perfil de actividad de nuevos agentes quimioterápicos y su combinación en las células cancerosas es de suma importancia para dirigidos terapias para el cáncer de ovario. Hemos demostrado previamente que la combinación de inhibidores del proteasoma y Pan-HDAC inducir la muerte sinérgica de líneas celulares de cáncer de ovario sin dañar su contraparte inmortalizado [27]. Por lo tanto, se comparó la sensibilidad a esta combinación de fármacos en particular en los cultivos primarios COE, así como en la línea celular de cáncer de ovario disponible comercialmente ES-2. Específicamente, las células COE se expusieron a concentraciones sub-óptimas del inhibidor de proteasoma bortezomib (2 nM) y el pan-HDACs inhibidor vorinostat (6 M) ya sea solo o en combinación y el inicio de apoptosis se midió mediante el control de los cambios morfológicos y niveles de expresión de PARP escindida en cultivos primarios COE y línea celular de cáncer de ovario ES-2 (de los donantes 1 y 8) después de 18 horas de exposición al fármaco.
Como se muestra en la Figura 6A, el tratamiento de combinación dio lugar a mayores cambios morfológicos de la apoptosis asociada en cultivos primarios COE en comparación con la exposición al agente único. El tratamiento de combinación también resultó en un aumento de los niveles de PARP escindida en comparación con la exposición al agente único tanto en cultivos primarios COE (Figura 6B
Panel superior y media
) y 2-ES líneas celulares de cáncer de ovario (Figura 6B,
panel inferior). La cuantificación de la relación entre la longitud total escindido y PARP escindida es COE cultivos primarios se muestra en la Figura 6C.
Conclusiones
Una mejor comprensión de la iniciación, desarrollo y progresión del cáncer de ovario es de suma importancia para mejorar el pronóstico de los pacientes con cáncer de ovario. Uno de los problemas más difíciles asociados con estos estudios es la falta de fiabilidad en el uso de líneas celulares de cáncer de ovario establecidos, que a menudo se han sometido a cientos de pasajes
in vitro
. Las líneas de células ya no pueden parecerse a la del cáncer de la que se derivaron originalmente. En este estudio describimos el método más eficiente y rápida para el aislamiento de células EOC de tumores sólidos. Las preparaciones de células EOC están desprovistos de los fibroblastos y crecen de manera exponencial durante un máximo de 6 pasajes antes de que envejecen y mueren. Es importante destacar que estas células EOC recién aisladas conservan la capacidad de formar estructuras esferoides similar, puede ser fácilmente transfectadas por medio de un sistema lentiviral, y son una herramienta viable para la detección de drogas. Por lo tanto, estas células se vuelven adecuados para aplicaciones de investigación de aguas abajo.
Por último, la capacidad para aislar y manipular las células de cáncer de ovario derivados de tumores sólidos frente a fluido de ascitis tiene la ventaja potencial de aislamiento de células EOC de las primeras etapas de la enfermedad antes del momento cuando se produce la formación de fluido de ascitis. En particular, líneas celulares derivadas de fluido de ascitis se obtienen de una etapa relativamente tardía de la enfermedad y no es posible determinar si las células se obtuvieron a partir del sitio del tumor primario o de un sitio metastásico.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a los Dres. Linda Carson, Levi Downs, Melissa Geller, Pedro Argenta, Patricia Judson y Amy Jonson, División de Oncología Ginecológica, Universidad de Minnesota para asistir en la selección de las muestras tumorales. Nos gustaría dar las gracias a Karin Daniels del Centro Médico Fairview y Sarah Bowell del Fondo para Adquisición de Tejidos de la Universidad de Minnesota para obtener ayuda con inmuno análisis y obtención de muestras de tejido de pacientes, respectivamente. También nos gustaría agradecer al Dr. Charles Landen, División de Oncología Ginecológica, Universidad de Alabama para ayudar con la configuración de protocolo.