Extracto
La vía de señalización /β-catenina vía es importante para la iniciación y progresión del tumor. La relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad de la proteína-6 (LRP6) es un Wnt co-receptor esencial para la señalización /β-catenina y representa una diana prometedora contra el cáncer. Recientemente, el fármaco antihelmíntico, niclosamida se encontró que inhibe la señalización de Wnt /β-catenina, aunque el mecanismo no estaba bien definida. Se encontró que la niclosamida fue capaz de suprimir la expresión y la fosforilación LRP6, bloquear la acumulación de β-catenina Wnt3A inducida, e inhibir la señalización /β-catenina Wnt en células HEK293. Además, los efectos inhibidores de la niclosamida en LRP6 expresión /fosforilación y señalización /β-catenina Wnt se conformaron en la próstata humana DU145 y células de cáncer de mama MDA-MB-231 y T-47D PC-3 y. Por otra parte, hemos demostrado que el mecanismo por el cual Niclosamida suprimida LRP6 se debió a una mayor degradación, como es evidente por una vida media más corta. Por último, hemos demostrado que la niclosamida fue capaz de inducir apoptosis de células de cáncer, y se muestran una excelente actividad contra el cáncer con IC
50 valores de menos de 1 mM para la próstata células cancerosas DU145 y de mama MDA-MB-231 y T-47D PC-3 y . El IC
50 valores son comparables a los mostrados para suprimir las actividades de señalización /β-catenina Wnt en células de la próstata y cáncer de mama. Nuestros datos indican que la niclosamida es una única molécula pequeña Wnt /β-catenina inhibidor de la señalización de la orientación de la LRP6 co-receptor Wnt en la superficie celular, y que la niclosamida tiene un potencial para ser desarrollado un nuevo quimiopreventivo o agente terapéutico para la próstata humano y cáncer de mama .
Visto: Lu W, Lin C, Roberts MJ, Waud WR, Piazza GA, Li y (2011) niclosamida Suprime el crecimiento del cáncer de células mediante la inducción de Wnt co-receptor LRP6 la degradación y la inhibición de la Wnt /β-catenina Camino. PLoS ONE 6 (12): e29290. doi: 10.1371 /journal.pone.0029290
Editor: Lin Mei, Colegio Médico de Georgia, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de septiembre de 2011; Aceptado: 24 Noviembre 2011; Publicado: 16 de diciembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Lu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos nacionales de Salud (RO1CA124531; a YL). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
señalización Wnt /β-catenina desempeña un papel importante en el desarrollo embrionario y puede conducir a la formación de tumores cuando se activa de forma aberrante. Una característica distintiva de la activación de señalización /β-catenina Wnt es la estabilización de citosólico β-catenina, que entra en el núcleo para activar Wnt genes diana por factores de transcripción del factor de células T /linfoide mejora de los factores (TCF /LEF) la familia [vinculante ,,,0],1], [2]. En ausencia de ligandos Wnt, los niveles de β-catenina se regulan de manera eficiente por un complejo supramolecular que contiene la poliposis adenomatosa coli (APC), axina, y 3β glucógeno sintetasa quinasa (GSK3). Este complejo promueve la fosforilación de β-catenina por la caseína quinasa 1 (CK1) y GSK3. Fosforilados β-catenina-ubiquitinated se convierte en múltiples (UB) y degradada por el proteasoma 26S. La acción de este complejo se inhibe tras la unión de Wnt a sus receptores en la superficie celular [1], [2]. Se han identificado una variedad de genes diana Wnt /β-catenina, incluyendo aquellos que regulan la proliferación celular y la apoptosis, mediando de este modo la iniciación y progresión del cáncer [3] - [5]. pruebas convincentes ha indicado que existe una regulación anormal de esta vía en la tumorigénesis de muchos tipos de cáncer, y que la alteración de la señalización de Wnt /β-catenina representa una gran oportunidad para desarrollar nuevos fármacos para la quimioprevención del cáncer y la terapia [6] - [8].
los experimentos realizados en Drosophila [9], Xenopus [10] y ratones [11] demostraron que la proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad 5 (LRP5) /LRP6 (flecha en Drosophila denomina) actúa como un co-receptor para ligandos Wnt, que interactúan tanto con el receptor de siete transmembrana de la familia Frizzled (Fz) y LRP5 /6 para activar la vía de señalización Wnt canónica. Las colas citoplasmáticas de LRP5 /6, tras la activación del receptor por el ligando Wnt, se fosforilan, y reclutan axin andamio de proteínas citosólicas a la membrana. LRP6 se expresa en líneas celulares de cáncer humano y hasta regulado en los tejidos malignos humanos [12] - [16]. Los estudios realizados en los últimos años han demostrado que LRP6 es un objetivo terapéutico prometedor para el desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer [6] -. [8], [15], [17], [18]
Niclosamida (comercio nombre Niclocide) es un teniacide en la familia antihelmíntico que es especialmente eficaz contra cestodos, que infecta a los seres humanos. Niclosamida ha sido aprobado por la FDA para este tipo de indicaciones y se ha utilizado en los seres humanos desde hace casi 50 años [19] - [21]. Se cree que la niclosamida inhibe la fosforilación oxidativa en la mitocondria de cestodos; un metabolismo aeróbico, en la que muchos dependen cestodos. Recientemente, se ha demostrado que la niclosamida puede regular a la baja la expresión de β-catenina citosólica para inhibir Wnt /β-catenina de señalización [22], [23], y suprimir el crecimiento de cáncer colorrectal y metástasis [23], [24]. Dado que el mecanismo no estaba bien definida, hemos realizado un estudio aún más este. Hemos demostrado por primera vez que la niclosamida puede inhibir la señalización de Wnt /β-catenina mediante la inducción de la degradación LRP6, y que esta actividad está estrechamente relacionada con su antiproliferativa y la apoptosis actividad inductora.
Resultados
Niclosamida la señalización de bloques de Wnt /β-catenina inducida por Wnt3A y LRP6 por la supresión de la expresión en células HEK293 LRP6
no complejado β-catenina citosólica (libre de β-catenina) es la forma activa de la β-catenina que se transloca a la célula núcleo para activar factores de transcripción de la familia TCF /LEF, que conduce a la transcripción de Wnt genes diana. Para determinar si la niclosamida puede inhibir la señalización de Wnt /β-catenina, las células HEK293 fueron tratadas para con Wnt3A medio acondicionado (CM) en presencia de niclosamida o vehículo (DMSO). Los niveles de libre citosólico β-catenina y la β-catenina celular total fueron examinados por Western Blot. Como se muestra en la Figura 1A, la niclosamida fue capaz de bloquear Wnt3A inducida libre citosólico β-catenina y la acumulación celular total β-catenina en células HEK293 en concentraciones tan bajas como 0,6 mM (Figura 1A).
(A) células HEK293 en placas de 6 pocillos se trataron con Wnt3A CM (20%) y la niclosamida a las concentraciones indicadas durante 24 h. Se examinaron los niveles de libre citosólico β-catenina, celulares β-catenina total LRP6 y fosfo-LRP6 (p-LRP6). Todas las muestras también se probaron con anticuerpo anti-actina para verificar la carga igual. (B) células HEK293 en placas de 24 pocillos se transfectaron transitoriamente con el plásmido LRP6 o el correspondiente vector de control, junto con TOPFLASH construir y β-galactosidasa que expresan vector en cada pocillo. Después de incubarse durante 24 h, las células se trataron con niclosamida o niclosamida más Wnt3A CM a las concentraciones indicadas durante 24 h. A continuación, la actividad de luciferasa se midió 24 h después con la normalización de la actividad de la β-galactosidasa. Los valores son promedios de tres determinaciones con las desviaciones estándar indicadas por barras de error. ** P & lt; 0,01 en comparación con las células de control sin tratamiento niclosamida
LRP6 es un Wnt co-receptor esencial para la vía de señalización Wnt /β-catenina, y la fosforilación LRP6 es crítica para Wnt /β. catenina activación inducida por las proteínas Wnt de señalización [25] - [28]. Para explorar el mecanismo molecular que subyace a la inhibición de la señalización de Wnt /β-catenina por la niclosamida, se analizó la expresión y la fosforilación LRP6 después del tratamiento niclosamida. Como se muestra en la Figura 1A, el tratamiento de Wnt3A CM notablemente la fosforilación inducida LRP6 endógeno en células HEK293, que fue suprimida por el tratamiento niclosamida. Es importante destacar que, también encontramos que el nivel celular total de LRP6 endógena se redujo en gran medida después del tratamiento niclosamida en las células HEK293 (Figura 1A).
Para confirmar el efecto inhibidor de la niclosamida en la expresión y la fosforilación LRP6, se realizó un Wnt /señalización reportero de ensayo para probar si la niclosamida es capaz de inhibir la activación de la señal Wnt /β-catenina por LRP6 y Wnt3A β-catenina. células HEK293 se transfectaron transitoriamente con LRP6 junto con Wnt /β-catenina TOPFLASH reportero de señalización, y se trataron con Wnt3A CM y niclosamida. Como se muestra en la Figura 1B, la expresión LRP6 aumentó la actividad TOPFLASH en las células HEK293, que se mejora aún más cuando las células fueron transfectadas con LRP6 y se trataron con Wnt3A CM (Figura 1B). Por otra parte, el aumento de la actividad inducida por TOPflash LRP6 o LRP6 más Wnt3A CM fue bloqueado por la niclosamida (Figura 1B).
niclosamida suprime la expresión y la fosforilación LRP6 y Bloques señalización Wnt /β-catenina en células de cáncer de mama y de próstata
Para determinar si la niclosamida puede bloquear la señalización /β-catenina en las células cancerosas, se analizó el nivel de libre citosólico β-catenina después del tratamiento niclosamida. Se encontró que los niveles de β-catenina citosólicas libres en las células cancerosas MDA-MB-231 de PC-3 y de la mama de próstata humano se redujeron significativamente después del tratamiento niclosamida (Figura 2A). Además, cuando las células PC-3 y MDA-MB-231 fueron transfectadas transitoriamente con el /β-catenina TOPFLASH reportero de señalización Wnt, se encontró que el tratamiento niclosamida reduce en gran medida la actividad de TOPFLASH en PC-3 y las células MDA-MB-231 ( MDA-MB-231 células Figura. 2B).
(a) el cáncer de próstata cáncer de mama PC-3 y en placas de 6 pocillos fueron tratados con niclosamida a las concentraciones indicadas durante 24 h. Los niveles de libre citosólico β-catenina se examinaron después por ensayo de unión de GST-E-cadherina. (B) El cáncer de próstata PC-3 y el cáncer de mama MDA-MB-231 células en placas de 24 pocillos se transfectaron transitoriamente con el constructo de luciferasa TOPFLASH y β-galactosidasa que expresan vector en cada pocillo. Después de 24 h de incubación, las células se trataron con 2,4 mM niclosamida. A continuación, la actividad de luciferasa se midió 24 h después con la normalización de la actividad de la β-galactosidasa. Los valores son la media de determinaciones triples con el s.d. indicada por barras de error. ** P & lt;. 0.01 en comparación con las células de control
Es bien reconocido que AXIN2 es un objetivo transcripcional específico de la vía de señalización /β-catenina Wnt, y que el nivel de expresión de AXIN2 es la firma de la activación de Wnt /β-catenina de señalización [29] - [32]. Ciclina D1 es un objetivo transcripcional de la señalización de Wnt /β-catenina, y es crítica para la proliferación de células de cáncer [33], [34]. Para determinar los efectos inhibidores de la niclosamida en la señalización Wnt /β-catenina en células de cáncer humano, se examinaron AXIN2 y ciclina D1 expresión en células de cáncer de próstata DU145 y de mama MDA-MB-231 y T-47D PC-3 humana y. Como se muestra en la Figura 3, la niclosamida suprimió de forma significativa AXIN2 y la expresión de ciclina D1 en todas las cuatro líneas celulares de cáncer.
DU145 y células cáncer de próstata PC3 y MDA-MB-231 y T-47D células de cáncer de mama (A) en placas de 6 pocillos fueron tratados con niclosamida a las concentraciones indicadas durante 24 h. Los niveles totales de celulares LRP6, p-LRP6, Dvl2, AXIN2 y ciclina D1were examinaron a continuación. Todas las muestras también se probaron con anticuerpo anti-actina para verificar la carga igual. (B) células de cáncer de próstata PC-3 y DU145 y células de cáncer de mama MDA-MB-231 y T-47D en placas de 6 pocillos se trataron con niclosamida a las concentraciones indicadas durante 24 h. A continuación se examinaron los niveles citosólicos de Dvl2. Todas las muestras también se probaron con anticuerpo anti-actina para verificar la carga igual.
expresión LRP6 Para determinar si el efecto inhibidor de la niclosamida en la señalización /β-catenina Wnt está relacionada con la expresión LRP6, examinamos y la fosforilación después del tratamiento niclosamida. Como se muestra en la Figura 3A, la niclosamida fue capaz de suprimir la expresión LRP6 y la fosforilación en las cuatro líneas celulares de cáncer, lo que indica que la niclosamida puede reprimir la señalización de Wnt /β-catenina en células de mama y cáncer de próstata mediante la supresión de la expresión LRP6.
induce niclosamida LRP6 degradación
Para definir el mecanismo molecular que subyace a los efectos de la niclosamida el nivel de proteína LRP6, se estudió el volumen de negocios LRP6. las células PC-3 fueron tratados con niclosamida en 1,2 M durante 0, 3, 6, 10 y 24 h en presencia de cicloheximida, un inhibidor de la síntesis de proteínas. Como se muestra en la Figura 4, en ausencia de tratamiento niclosamida, LRP6 se degradó con una vida media de aproximadamente 6,9 h. El tratamiento con niclosamida mejora de forma significativa el volumen de negocios LRP6 con una vida media de alrededor de 2,3 h (Figura 4A). Este acortamiento de la vida media LRP6 sugiere que la niclosamida pueden estimular la degradación LRP6. Para probar si la niclosamida regula la expresión LRP6 a nivel de transcripción también, se examinaron los niveles de ARNm de LRP6 en tiempo real de RT-PCR. Como se muestra en la figura 4B, los niveles de ARNm de LRP6 no cambiaron significativamente después del tratamiento niclosamida en PC-3 y las células MDA-MB-231. Por lo tanto, la supresión LRP6 niclosamida inducida es principalmente debido a la degradación LRP6 mejorada.
PC 3-células (A) se incubaron con 10 mg /ml de cicloheximida en presencia de niclosamida (1,2 M) o vehículo para 0, 3, 6, 10 o 24 h. Las células se recogieron a continuación, y el nivel de LRP6 endógeno se examinó por transferencia de Western. Las muestras también se probaron con anticuerpo anti-actina para verificar la carga igual. Se midieron los píxeles para cada banda, normalizado y se representaron. Los datos son valores medios de tres experimentos independientes con los valores de DE indicadas por barras de error. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01 en comparación con el valor de control correspondiente. las células PC-3 y MDA-MB-231 en placas de 6 pocillos (B) fueron tratados con niclosamida durante 24 h. Las células se recogieron a continuación y los niveles de ARNm se determinaron LRP6 por tiempo real de RT-PCR y se normalizaron a los niveles de mensaje de GAPDH ARNm. Todos los valores son la media de determinaciones triples con el s.d. indicado por las barras de error.
Niclosamida no tiene ningún efecto sobre la expresión Dishevelled-2 (Dvl2) en células de la próstata y cáncer de mama
Se ha informado de que la niclosamida regula a la baja los componentes de la vía Wnt , expresión Dvl2 específicamente citosólico, lo que resulta en la disminución de la señalización de Wnt /β-catenina aguas abajo en el cáncer colorrectal [23]. Para probar si Dvl2 también está implicado en la inhibición de la señalización de Wnt /β-catenina niclosamida-inducida en células de la próstata y cáncer de mama, se examinaron dos niveles celulares y citosólicas totales de expresión Dvl2. Inesperadamente, se encontró que la niclosamida no tuvo efecto en tanto la expresión celular total y citosólica Dvl2 en células de cáncer de PC-3 y DU145 y de mama MDA-MB-231 y T-47D de próstata humano (Figura 3), mientras que la expresión LRP6 se suprimió en gran medida en el mismo tratamiento (Figura 3A). Estos resultados indican que la regulación negativa LRP6 es el mecanismo clave subyacente niclosamida inducida por Wnt /inhibición en las células cancerosas MDA-MB-231 y T-47D de PC-3 y DU145 y de la mama de próstata humano de señalización β-catenina.
niclosamida induce la próstata y mama proliferación de células apoptosis de las células e inhibe el cáncer
La vía /β-catenina vía es importante para la apoptosis de las células del cáncer [35], [36]. Habiendo establecido que la niclosamida es un potente inhibidor de la señalización /β-catenina Wnt en células de la próstata y cáncer de mama, entonces, si la prueba niclosamida es capaz de inducir apoptosis. Como se muestra en la Figura 5A, la exposición a la niclosamida en 1,2 y 2,4 M durante 24 h inducidos de manera significativa la fragmentación del ADN de apoptosis en las células cancerosas MDA-MB-231 y T-47D de PC-3 y DU145 y de la mama de la próstata.
( a) las células de cáncer se trataron con niclosamida a las concentraciones indicadas durante 24 h. Flotante y las células unidas se combinaron para la detección de la apoptosis por la muerte celular ELISA kit de Roche Diagnostics Corporation para fragmentos de ADN de las histonas asociadas como se describe en Materiales y Métodos. las células (B) de cáncer en placas de 96 pocillos se trataron con niclosamida para 72 h. La viabilidad celular se midió por el Cell Titer Glo sistema de ensayo. Todos los valores son la media de determinaciones por triplicado con el s.d. indicada por barras de error. ** P & lt;. 0,01 frente valor de control correspondiente
Dado que la niclosamida puede bloquear la señalización /β-catenina en las células cancerosas y puede inducir la apoptosis, se examinó el efecto de la niclosamida sobre la proliferación de células cancerosas. Como se muestra en la Figura 5B, la niclosamida proliferación de células cancerosas inhibido con IC
50 valores de menos de 1 mM para las cuatro líneas celulares sometidas a prueba. El IC
50 valores son comparables a los mostrados para suprimir las actividades de señalización /β-catenina Wnt en células de la próstata y cáncer de mama.
Discusión
pruebas convincentes indica que hay una anormal regulación de la vía /β-catenina Wnt en la tumorigénesis de muchos tipos de cáncer. Mientras que las mutaciones genéticas de ciertos componentes de la vía /β-catenina vía, como
APC
y
CTNNB1
, son factores que contribuyen importantes para el cáncer colorrectal, por lo general no son el mecanismo predominante asociado con muchos otros tipos de cáncer, como los cánceres de mama y de próstata. En cambio, parece que la desregulación de la señalización de Wnt /β-catenina en la superficie celular conduce a la activación aberrante de esta vía en estos tipos de cáncer [3] - [5], [37]. Por lo tanto, la inhibición específica de la señalización /β-catenina Wnt en la superficie celular es un nuevo enfoque racional y prometedor para el tratamiento del cáncer.
señalización Wnt /β-catenina desempeña un papel importante en el desarrollo de la glándula mamaria y la carcinogénesis [ ,,,0],4]. el cáncer de mama triple negativo (forma de cáncer; ER, PR, y el cáncer de mama HER2-negativo) es uno de los subtipos más difíciles de cáncer de mama de tratar debido a la falta de una terapia dirigida. Los estudios han demostrado que la activación de la señalización de Wnt /β-catenina se encuentra preferentemente en forma de cáncer y se asocia con un pobre resultado clínico [38]. cáncer de mama (BLBC) acciones de tipo basal muchas características superpuestas con BLBC. Varios estudios han demostrado que LRP6 es regulado en esta forma de cáncer humano o BLBC [14] - [16]. En ratones, el desarrollo de la glándula mamaria y la tumorigénesis mamaria inducida por MMTV-Wnt1 se retrasaron en LRP6
+/- ratones [14], mientras que los ratones transgénicos MMTV-LRP6 desarrolló hiperplasia en sus glándulas mamarias debido a LRP6 mediada por Wnt /β- catenina de señalización [39]. knockdown transcripcional de LRP6 en células TNBC MDA-MB-231 disminuyó significativamente la señalización Wnt /β-catenina, la proliferación celular, y el crecimiento tumoral
in vivo
[15]. Además, se ha demostrado que los anticuerpos específicos LRP6 fueron capaces de bloquear MMTV-Wnt1 o MMTV-Wnt3 xenoinjertos
in vivo
[17], [18], y que la proteína MESD recombinante, un antagonista LRP6, notablemente crecimiento suprimida tumor en modelos de xenoinjerto MMTV-Wnt1 [15]. Por otra parte, salinomicina, un asesino de células madre de cáncer de mama [40], se ha demostrado recientemente ser un inhibidor de la señalización /β-catenina Wnt mediante la inducción de la degradación LRP6 [41]. En el presente estudio, hemos demostrado que la niclosamida suprimió la expresión LRP6 en CMTN MDA-MB-231 células y células de cáncer de mama ER-positivo T-47D, y la proliferación de células de cáncer de mama inhibido con IC
50 valores de menos de 1 micra. Nuestros resultados apoyan el concepto de que LRP6 es un objetivo terapéutico prometedor para el cáncer de mama incluyendo TNBC.
La evidencia acumulada ha demostrado un papel significativo para la señalización de Wnt /β-catenina en el desarrollo y progresión del cáncer de próstata humano [3] . Aunque no está claro si LRP6 está regulado en el cáncer de próstata, hemos demostrado recientemente que el antagonista LRP6 MEDOS marcadamente inhibida de señalización /β-catenina Wnt en las células PC-3 con cáncer de próstata, y suprimió PC-3 proliferación celular
In
vitro y el crecimiento tumoral
in vivo
[42], [43]. En el presente estudio, encontramos niclosamida inhibe la proliferación de células PC-3 y DU145 de cáncer de próstata con IC
50 valores de menos de 1 micra, que son comparables a los que se muestran para suprimir la expresión LRP6 y las actividades de Wnt /β- señalización catenina en células de cáncer de próstata. En conjunto, estos hallazgos sugieren que LRP6 es una posible diana terapéutica para el cáncer de próstata.
Las mutaciones en
APC
y
CTNNB1 ¿Cuáles son dos factores importantes para la señalización /β-catenina vía la activación en el cáncer colorrectal, sin embargo los estudios recientes indican que los niveles de señalización Wnt /β-catenina en células de cáncer colorrectal podrían ser modulados en la superficie celular [44] - [48]. En particular, Ueno
et al.
Demostró que el receptor de Wnt frizzled-7 activa la vía /β-catenina en las células de cáncer colorrectal a pesar de la presencia de
APC
o
CTNNB1
mutación y que frizzled-7-siRNA se pueden usar como un reactivo terapéutico para el cáncer de colon [48]. Shi
et al
. informó de que siRNA silenciamiento de Wnt-2, que es bien conocido por su sobreexpresión en el cáncer colorrectal, inhibe la señalización de Wnt /β-catenina e indujo apoptosis en células de cáncer colorrectal humano que contienen mutaciones aguas abajo [47]. La familia de proteínas relacionada con frizzled secretada (SFRP) y Wnt Factor Inhibidor-1 (WIF-1) se secretan antagonistas que se unen a ligandos Wnt de señalización Wnt /β-catenina, e interfieren con la interacción Wnt-receptor. Se ha informado de que la pérdida de expresión de la familia SFRP se asoció con la hipermetilación del promotor en el cáncer colorrectal [44], y que la restauración de la función SFRP en células de cáncer colorrectal atenúa Wnt /β-catenina señalización incluso en la presencia de mutaciones aguas abajo [45]. Del mismo modo, Él
et al.
Informó que la pérdida de WIF-1 de expresión se asocia con el promotor de hipermetilación en el cáncer colorrectal, y que la restauración de la función WIF-1, Wnt-1 siRNA, o un anticuerpo monoclonal anti-Wnt 1 anticuerpo induce la apoptosis significativa en células de cáncer colorrectal que contienen mutaciones aguas abajo y que expresan Wnt-1 [46]. Muy recientemente, se ha informado de que la niclosamida fue capaz de inhibir la señalización /β-catenina Wnt en células de cáncer colorrectal, inhibió el crecimiento del cáncer colorrectal y el cáncer colorrectal metastásico mediada por S100A4 [23], [24]. La proteína de unión a calcio S100A4 es un gen diana de la vía Wnt /β-catenina [49]. Futuros estudios son necesarios para hacer frente a la importancia de LRP6 en el desarrollo del cáncer colorrectal y la progresión.
El desarrollo de la FDA aprobó las drogas que se utilizan para otras indicaciones es una estrategia atractiva para el desarrollo de nuevos fármacos para la quimioprevención del cáncer o terapia dada su historial de seguridad comprobada. La interrupción de la señalización /β-catenina vía representa una gran oportunidad para determinar si los medicamentos aprobados por la FDA podrían tener potencial eficacia anticancerosa [6] - [8]. La niclosamida es un derivado salicyclamide y el fármaco de elección para el tratamiento de la infección por tenia más. La niclosamida ejerce su actividad antiparasitaria en el lumen intestinal y no se absorbe bien en el tracto gastrointestinal [19] - [21]. los niveles en plasma y tumorales Sin embargo, en los ratones implantados con xenoinjertos de cáncer colorrectal humano, niclosamida administrado por vía oral fue bien tolerado, logra asociados con la actividad biológica y condujeron a control del tumor [23]. Por otra parte, la niclosamida tiene ninguna toxicidad significativa contra el cáncer de células no-
in vitro Opiniones y no muestra efectos secundarios obvios en los ratones tratados con niclosamida [23]. Se demuestra en este documento que la niclosamida es un potente Wnt /β-catenina inhibidor de la señalización mediante la inducción de la degradación LRP6 en células de cáncer, y muestra una excelente actividad contra el cáncer
in vitro
. Por lo tanto, como un FDA aprobó fármaco antihelmíntico, niclosamida será una comoound interesante para ser optimizado para aumentar su biodisponibilidad y ser probado para sus
in vivo
cáncer funciones preventivas y terapéuticas en el futuro.
Materiales y Métodos
Materiales
niclosamida se adquirió de Sigma. Policlonales anti-fosfo-LRP6 (Ser1490) y anti-Dvl2 y monoclonal anti-AXIN2 se adquirieron de Cell Signaling Technology. Monoclonal anti-LRP6 era de Santa Cruz Biotechnology. policlonal de conejo anti-ciclina D1 fue de Chemicon International. Monoclonal anti-β-catenina fue de BD Biosciences. Monoclonal anti-actina fue de Sigma. Marcado con peroxidasa anticuerpo anti-ratón y el sistema ECL se adquirieron de Amersham Life Science. Plásmido PCS-Myc-hLRP6 que contiene el humano de longitud completa LRP6 ADNc fue del Dr. Christof Niehrs (Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Alemania). Plásmido glutatión S-transferasa (GST) -S-cadherina fue proporcionado amablemente por el Dr. Gail Johnson (Universidad de Rochester, Nueva York). El constructo de luciferasa TOPFLASH fue de Upstate Biotechnology. El vector de β-galactosidasa que expresan, el sistema de ensayo de luciferasa y el sistema de ensayo de β-galactosidasa se adquirieron de Promega. medios de cultivo de tejidos, suero fetal bovino (FBS), y plástico-ware se obtuvieron de Life Technologies, Inc. cóctel inhibidor de proteinasa Complete ™ se obtuvo de Boehringer Mannheim. Todas las líneas celulares se obtuvieron de ATCC y se cultivaron en medio RPMI-1640 que contiene 10% de suero fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades /ml de penicilina, y 100 g /ml de estreptomicina. Las células fueron cultivadas en medio libre de antibiótico para ensayos de proliferación celular. Cell sistemas de ensayo Titer Glo eran de Promega. detección de muerte celular kit de ELISA fue adquirido de Roche Diagnostics Corporation.
Western Blot
Las células en placas de 6 pocillos se lisaron en 0,5 ml de tampón de lisis (solución salina tamponada con fosfato que contiene 1% de Triton X -100 y 1 mM PMSF) a 4 ° C durante 10 min. Las cantidades iguales de proteína se sometieron a SDS-PAGE en condiciones reductoras. Después de la transferencia a membrana de transferencia Immobilon-P, incubaciones sucesivas con un anticuerpo primario, y un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante se llevaron a cabo para 60 a 120 min a temperatura ambiente. Las proteínas inmunorreactivas se detectaron entonces usando el sistema ECL. Programación de películas bandas inmunorreactivas fueron escaneados por HP Scanjet 5590.
Análisis de β-catenina citosólica libre con la unión de GST-E-cadherina ensayo
El ensayo de unión de GST-E-cadherina se llevó a cabo exactamente como se descrito anteriormente [50]. No acomplejada libre citosólico β-catenina presente en 100 g de lisado celular total se sometieron a SDS-PAGE y se detectó utilizando el anticuerpo monoclonal para ß-catenina.
Real-time RT-PCR
Total se aisló ARN a partir de cultivos de células utilizando ARN-Bee (Tel-test), y la síntesis de ADNc de primera cadena se realizó usando el kit ProSTARTM Ultro HF RT-PCR (Stratagene) cebado con oligo (dT) en una mezcla de reacción de 20 l que contiene 1 g ARN total. Para el análisis de los niveles de ARNm de LRP6, en tiempo real RT-PCR se realizó con los cebadores específicos LRP6 y GAPDH comprados a SABioscience /Qiagene. El nivel de ARNm LRP6 se normalizó al nivel de ARNm de GAPDH.
Analysisof expresión citosólica Dvl2
expresión citosólica Dvl2 se examinó con el método como se describe en otro lugar [23]. Brevemente, las células se lisaron con tampón de lisis hipotónico (que consta de 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 y MgCl2 0,2 mM, suplementado con inhibidores de la proteasa, se incubaron en hielo durante 10 min, y se homogeneizaron utilizando un Dounce de vidrio hermética. La sacarosa y EDTA se añadieron a concentraciones finales de 0,25 M y 1 mM, respectivamente. Los lisados se centrifugaron a 20.000 xg durante 1 hora a 4 ° C. El sobrenadante que representa la fracción de células citosólica a continuación se diluyó en tampón de muestra de SDS, y luego la expresión Dvl2 fue examinado por Western Blot.
reportero de luciferasa ensayo
las células cancerosas se sembraron en placas de 24 pocillos. Después de cultivo durante la noche, las células fueron transfectadas transitoriamente con 0,1 g de la construcción TOPflash luciferasa (Upstate Biotechnology) y 0,1 g de vector β-galactosidasa que expresan (Promega, Madison, WI). Después de 24 h de incubación, las células se trataron con niclosamida. Las células se lisaron entonces 24 h más tarde y se determinaron ambas actividades de luciferasa y β-galactosidasa. La actividad de la luciferasa fue normalizó a la actividad β-galactosidasa.
evaluación apoptosis
la apoptosis se evaluó con detección de muerte celular ELISA kit adquirido de Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis. Este ensayo detecta oligonucleosomas liberados después de la lisis suave de la célula. Las células se cultivaron en matraces T25 para la duración deseada. El medio gastado que contiene células flotantes se salvó y se mantuvo en hielo. Las células adherentes se recogieron mediante tripsinización suave y se combinaron con los flotadores para la granulación por centrifugación. Después de la lisis suave de las células con el tampón suministrado con el kit de detección, se utilizó el lisado de células para el ensayo de ELISA. Los resultados se normalizaron por el contenido de proteína obtenida a partir de matraces paralelos con las células se lisaron utilizando el tampón tal como se describe anteriormente para la transferencia Western.
proliferación de las células de ensayo
Las células se sembraron en 96 pocillos de tejido cultivo tratado placas de microtitulación a una densidad de 5000 células /pocillo en un volumen total de 50 l. Después de la incubación durante la noche, las células se trataron con niclosamida durante 72 h mediante la adición de 50 l de soluciones madre 2X a los pocillos apropiados que ya contienen 50 l de células y el medio para exponer las células a las concentraciones finales de niclosamida requeridos. La viabilidad celular se midió por el celular Titulación Glo ensayo (Promega).
Estadísticas
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba t de Student para datos independientes. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Las diferencias en P & lt; 0,05. Se consideraron estadísticamente significativos
Reconocimientos
Agradecemos a Meredith S. Plaxco y Tommie A. Gamble para la ejecución de ensayos de proliferación celular y el Dr. Gail Johnson (Universidad de Rochester) para proporcionando GST-cadherina E ADNc.