Extracto
La quimioterapia y terapias anti-hormonales son los tratamientos más comunes para el cáncer de próstata no limitado al órgano (CaP) . Sin embargo, la efectividad de estas terapias es limitada, lo que obliga al desarrollo de enfoques alternativos. El presente estudio se centró en analizar el papel de Pterostilbene (PTER) -isothiocyanate (ITC) conjugado - una nueva clase de compuesto híbrido sintetizada añadiendo un resto CCI sobre la columna vertebral PTER - en la regulación de las funciones del receptor de andrógenos (AR), lo que provoca la apoptosis de células de CaP. La molécula de conjugado provocó 50% de inhibición del crecimiento (IC
50) a 40 ± 1,12 y 45 ± 1,50 M en células positivas AR (LNCaP) y negativo (PC-3), respectivamente. La proliferación reducida de PC-3, así como las células LNCaP por el conjugado correlacionada con la acumulación de células en fase G2 /M y la inducción de apoptosis dependiente de caspasa. Tanto PI3K /Akt y vías /ERK MAPK juega un papel importante y diferenciado en la apoptosis inducida por el conjugado de estas células de CaP. Mientras que el inhibidor de Akt (A6730) o ARN pequeño de interferencia-Akt específico (siRNA) sensibilizada en gran medida las células PC-3 para conjugar inducida por apoptosis, por el contrario, la apoptosis se aceleró por la inhibición de ERK (por PD98059 o ERK siRNA) en el caso de las células LNCaP, tanto en última instancia, culminando en la expresión de la proteína escindida de caspasa-3. Por otra parte, la actividad anti-androgénica del conjugado fue mediada por disminución de la expresión de AR y sus co-activadores (SRC-1, GRIP-1), lo que interfiere en sus interacciones con AR. Todos estos datos sugieren que la inhibición inducida por el conjugado de la proliferación celular y la inducción de la apoptosis son, en parte mediada por la regulación a la baja de AR, Akt, y la señalización de ERK. Estas observaciones proporcionan un fundamento para la elaboración de nuevos enfoques terapéuticos para el tratamiento de CaP usando conjugado solo o en combinación con otros agentes terapéuticos
Visto:. Nikhil K, S Sharan, Chakraborty A, P Roy (2014) Pterostilbene-isotiocianato Conjugado suprime el crecimiento de células cancerosas de próstata Independientemente de Estado del receptor de andrógenos. PLoS ONE 9 (4): e93335. doi: 10.1371 /journal.pone.0093335
Editor: Chih-Pin Chuu, Institutos Nacionales de Investigación en Salud, Taiwán
Recibido: 30 de septiembre de 2013; Aceptó 3 de marzo de 2014; Publicado: 3 Abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Nikhil et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de Consejo de investigación Científica e Industrial y el Ministerio de Recursos Humanos y Desarrollo (MHRD), Gobierno de la India como becas de investigación para kN y ayudantía proyecto para PR, respectivamente. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Además PR también le gustaría tanque otros organismos de financiación, Departamento de Biotecnología (BT /PR14836 /AAQ /01/455/2010) y el Departamento de Ciencia y Tecnología (SR /SO /SA-39/2009) por su apoyo financiero. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de los importantes esfuerzos realizados para la ablación de los cánceres, el cáncer de próstata (CaP) es el cáncer más frecuentemente diagnosticado y la segunda causa principal de muerte por cáncer entre los hombres en los Estados Unidos, con un estimado de 217.730 nuevos casos y 32.050 muertes en 2010 [1]. Aunque la etiología de la PCa se mantiene niveles desconocidos, elevados de hormonas esteroides, tales como andrógenos y estrógenos, así como factores de crecimiento, tales como factor de crecimiento similar a la insulina 1, se considera que son factores de riesgo importantes [2] - [4]. la terapia de ablación de andrógenos tiene una respuesta inicial, pero la mayoría de los pacientes con CaP avanzado eventualmente desarrollan resistencia a esta terapia y progresa a cáncer de próstata refractario a hormonas (CPRH), para los que no existe una terapia curativa [5]. La falta de opciones de tratamiento eficaces para la gestión de CPRH reforzar la necesidad de desarrollar nuevos compuestos que actúan por separado o en combinación.
funciones de andrógenos y AR desempeñan un papel fundamental en la carcinogénesis y la progresión del CaP, así como en condiciones normales próstata desarrollo [6], [7]. Las acciones de los andrógenos, como la testosterona y la dihidrotestosterona (DHT) están mediadas por AR, que es un miembro de la superfamilia de receptor nuclear de factores de transcripción dependientes de ligando [8]. Además de andrógenos, la actividad de AR también puede ser modificada por moléculas en otras vías de señalización celular. Hasta la regulación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y posteriores aumentos de la quinasa extracelular regulada (ERK) y la señalización de Akt, están implicados en la progresión del CaP [9]. Akt regula la vía de señalización AR por la fosforilación y /o regulación transcripcional del AR. Akt fosforila AR en las serinas 210/213 y 790/791 y finalmente transactivates su actividad. Un estudio anterior demostró que la inhibición de la vía de Akt abroga la actividad de HER-2 /neu inducida por la señalización de AR [10]. Estos resultados sugieren que Akt es un activador de AR necesaria para la supervivencia y el crecimiento de células de CaP independiente de andrógenos. La investigación ha demostrado que la inhibición de una o ambas de estas vías tiene un efecto más profundo en el desarrollo de células tumorales y la muerte, lo que los objetivos combinacionales atractivos en la terapia de CaP. Por lo tanto, AR, Akt y ERK podría ser objetivos potenciales para el tratamiento del CaP.
componentes bioactivos de los alimentos, en particular, se están evaluando cada vez más como potenciales agentes quimiopreventivos CaP debido a su presunta seguridad [11]. Uno de tales compuestos es pterostilbeno (PTER), un análogo de origen natural dimetil éter de resveratrol (RESV), que tiene una mayor biodisponibilidad oral y la potencia mejorada en comparación con RESV [12]. Varios estudios han demostrado que PTER puede inhibir el crecimiento de diversos cánceres sensibles a hormonas, como el de mama [13] - [15] y CaP [14], [16] - [18], tanto
in vitro
y
in vivo
. Aunque las propiedades anti-metastática, anti-tumorales y anti-leucémicas de PTER han sido bien establecidos en el cáncer de mama, hay informes limitados sobre la acción de PTER en la proliferación de células de CaP inducidas por hormonas esteroides [16]. Del mismo modo, los isotiocianatos (ITC) son de origen natural, compuestos orgánicos de bajo peso molecular con la fórmula general R-NCS [19]. Estos agentes quimioprotector se encuentran en una amplia variedad de verduras crucíferas como el brócoli, la coliflor, la col, col de Bruselas, col rizada y [20]. Los estudios epidemiológicos han sugerido que el aumento del consumo de verduras crucíferas puede servir de protección contra el riesgo de CaP [21] - [24]. Sin embargo, a pesar de la correlación epidemiológica convincente, la actividad de las TIC en contra células de CaP aún no se ha evaluado sistemáticamente. Dado que las funciones individuales de PTER y el CCI ya han sido implicados en el CaP, la intención de desarrollar un conjugado de PTER-ITC en busca de moléculas contra el cáncer potentes. El conjugado se preparó añadiendo ITC que contiene tiosemicarbazida farmacóforo con columna vertebral PTER como se describió anteriormente [25]. Sorprendentemente, la molécula de conjugado cuando se prueba in vitro, mostró citotoxicidad eficaz en una amplia gama de líneas celulares de cáncer a una dosis relativamente baja en comparación con su compuesto original es decir, PTER [25]. Además, nuestro estudio indicó que la actividad anti-proliferativa de conjugado contra líneas celulares de cáncer de mama humano se debe a su capacidad de detener las células en G2 /M fase y la activación de la caspasa, y también se correlacionó con el bloqueo de Akt y ERK vías de señalización [ ,,,0],25].
En el presente estudio se examinó la eficacia detallada y los mecanismos moleculares de la acción conjugada de PTER-ITC usando dependiente de andrógenos (LNCaP) y células (PC-3) CaP independiente de los andrógenos. Además, también compararon la eficacia de conjugado PTER-ITC con el compuesto de origen de PTER es decir, RESV. Así, nuestro estudio identificó el conjugado recién desarrollado para ser un AR-inhibidor potente que atenúa fuertemente el crecimiento de células de CaP in vitro mediante la modulación de la expresión de AR, así como la regulación de la progresión del ciclo celular y la apoptosis.
Materiales y Métodos
reactivos
Todos los reactivos de cultivo celular se obtuvieron de GIBCO (Invitrogen, CA, EE.UU.), a menos que se indique lo contrario. Penicilina, estreptomicina, MTT (3- (4, 5-dimetil-2-tiazolil) 2,5diphenyl-2H-tetrazoliumbromide), cultivo de células de dimetil sulfóxido grado (DMSO), agarosa y todos los productos químicos de grado analítico eran de HiMedia (Mumbai, India ). Reacción en cadena de la polimerasa transcription- (RT-PCR) kits inversa procedían Genei (Bangalore, India). RESV, PTER, DHT, Akt1 /2 inhibidor de quinasa, PD98059 (inhibidor de ERK), Z-VAD-FMK (inhibidor de caspasa pan), Z-LEHD-FMK (caspasa-9 inhibidor específico), Z-IETD-FMK (caspasa 8 inhibidor específico) y kits de estimación de proteína BCA fueron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). reactivo de transfección Polyfect fue adquirido de Qiagen (Valencia, CA, EE.UU.). Pifithrin-α (inhibidor de p53), los anticuerpos de la caspasa-3, Bax, Akt, p-Akt, ERK, p-ERK, SRC-1, GRIP-1, N-CDR, β-actina y pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) contra Akt (SC-43609), ERK (SC-35335) y el control (SC-37007; control negativo para los experimentos usando transfección siRNA dirigidos; cada una consta de una secuencia codificada que no dé lugar a la degradación específica de cualquier ARNm celular conocido) fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.). PTER-ITC conjugado se sintetiza en el laboratorio de síntesis asimétrica del Departamento de Química, Instituto Indio de Tecnología de Roorkee, India, de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente [25] y en lo sucesivo designado como conjugado en el manuscrito (fig. 1A).
(A) Estructura del resveratrol, Pterostilbene y el conjugado Pterostilbene-isotiocianato. (B) El efecto de conjugado en la apoptosis de las células PC-3 y LNCaP como se demuestra por un análisis FACS representativa utilizando anexina V como marcador. (C) El histograma que muestra los datos para el análisis FACS, donde los resultados son la media ± SEM de tres experimentos independientes.#Y * representa una diferencia estadísticamente significativa con respecto a sus controles específicos (vehículo) para tratar las células en apoptosis temprana y tardía, respectivamente, a p
. & Lt; 0,05
Líneas celulares y cultivo
las líneas de células de carcinoma de próstata (AR-positivo LNCaP y PC-3 AR-negativos) y las líneas de células no cancerosas (CHO y COS-1) se obtuvieron del Centro Nacional para la Ciencia de la célula (NCCS), Pune, India. PC-3, las células CHO y COS-1 se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) mientras que las células LNCaP se mantuvieron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (inactivado por calor) bajo 5% de CO
2 a 37 ° C. Todos los experimentos se realizaron con LNCaP, PC-3, CHO y células COS-1 de paso por debajo de 29, 34, 20 y 30 respectivamente. Las células fueron lavadas adecuadamente antes de cambiar los medios de comunicación de medio completo libre de esteroides antes de cada tratamiento con los compuestos, a menos que se indique lo contrario.
Ensayos de citotoxicidad
MTT ensayo se llevó a cabo como se describe anteriormente [ ,,,0],25]. En resumen, 5 x 103 células en 200 l de medio se sembraron en placas de 96 pocillos (Griener, Alemania
).
Después de 24 h, las células se trataron con diversas concentraciones (0,1, 1, 10, 100 y 1.000 M) de RESV, PTER y conjugado. Las células de control se trataron con DMSO (control vehículo) 0,1%. Las células cultivadas se sometieron a ensayo después de 24 h mediante la adición de 20 l de 5 mg /ml de MTT, seguido de incubación a 37 ° C durante 4 h. a continuación, los medios de comunicación que contiene MTT se aspiró y 200 l de DMSO (Himedia, Mumbai, India) se añadió para disolver los cristales formazone. La densidad óptica (DO) se midió a 570 nm utilizando un lector de placas ELISA (Fluostar Optima, BMG Labtech, Alemania). El porcentaje de inhibición se calculó como:
La curva de respuesta a la dosis e IC
50 valores fueron obtenidos por análisis de regresión no lineal [regresión no lineal (dosis-respuesta sigmoidea con pendiente variable)] utilizando Graph Pad Prism, versión software 5.02 (GraphPad software Inc., CA, EE.UU.).
distribución del ciclo celular y la apoptosis por citometría de flujo Ensayo
células positivas
La distribución del ciclo celular y yoduro de Anexina V /propidio (PI) fueron analizaron mediante citometría de flujo. En resumen, primero se sembraron las células y se trataron con 0, 10, 20 y 40 conjugado mu M en medio completo durante 24 h. Esto fue seguido por tripsinización y se fijan en 70% de etanol, y finalmente un lavado con PBS. Posteriormente, las células se trataron con RNasa A (50 mg /ml), se tiñeron con PI (50 mg /ml) y se incubaron en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente y se analizaron por citometría de flujo para la distribución del ciclo celular. Para la apoptosis, las células tratadas con conjugados fueron teñidas con Alexa-Fluor 488 conjugado con Anexina-V utilizando el kit de ensayo Vybrant-Apoptosis de Invitrogen (EE.UU.) según el protocolo del fabricante. Las células teñidas se analizaron entonces mediante células activadas por fluorescencia (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) y los datos fueron normalizados utilizando el software de la célula de Quest 3.3.
caspasa ensayo
se determinó la actividad caspasa usando ApoTarget caspasa kit colorimétrico proteasa ensayo de muestras (KHZ1001; Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. En resumen, tanto las células de CaP se trataron con dosis crecientes de conjugado y RESV para 24 h. a continuación, las células se recogieron, se lavaron en PBS, y se lisaron en 50 l de tampón de lisis en hielo durante 10 min. Después de la centrifugación, el sobrenadante que contiene 150 g de proteínas se incubaron con 200 mM de la caspasa-3 (Ac-DEVD-pNA), caspasa-8 (Ac-IETD-pNA) y la caspasa-9 (Ac-LEHD-pNA) sustratos, respectivamente, en tampón de reacción a 37 ° C durante 1 h en placa de fondo plano de 96 pocillos. Los niveles de pNA liberada se midieron a 405 nm de longitud de onda con lector de placas de ELISA (Optima Fluostar, BMG Labtech, Alemania). El pliegue-aumento de la caspasa-3, -8, -9 y actividades se determinaron por comparación directa con el nivel de control de la ONU inducida. Para el ensayo de inhibidor de caspasa, las células se trataron previamente con un inhibidor de pan-caspasa sintético (Z-VAD-FMK), caspasa-8 inhibidor (Z-IETD-FMK) y la caspasa-9 inhibidor (Z-LEHD-FMK) durante 1 h antes de la adición de conjugado y la muerte de las células se analizaron mediante el ensayo MTT como se discutió anteriormente.
Análisis RT-PCR
ARN total fue extraído de las células tratadas utilizando el kit de aislamiento de ARN obtenido a partir de Genei ( Bangalore, India). Las muestras de ARN extraídos fueron cuantificados y la misma cantidad de los tratamientos individuales se transcribe con la ayuda de una RT - PCR kit de Genei (Bangalore, India) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PCR se realizó por desnaturalización a 94 ° C durante 60 s, hibridación a varias temperaturas (en función de los pares de cebadores usados) durante 45 s y extensión a 72 ° C durante 2 min seguido por el número de ciclos para la amplificación. Los cebadores para la Bcl-2, Bcl-xL, Bax, AR y β-actina fueron diseñados con la ayuda de software Primer 3 y estandarizadas en el laboratorio. Los productos de PCR se separaron a continuación sobre gel de agarosa al 2% y se visualizaron en un sistema de documentación de gel (Bio Rad, EE.UU.). La intensidad de las bandas en geles de agarosa se analizaron utilizando el software ImageJ 1.43 (NIH, EE.UU.) y se normalizaron con respecto a ß-actina productos de PCR. Cada uno de los RT-PCR se llevó a cabo tres veces. Tabla S1 presenta la secuencia del cebador, el tamaño del producto, la temperatura de recocido, y el número de ciclos utilizados para todos los cebadores.
La tinción de inmunofluorescencia
Para la tinción de inmunofluorescencia, las células LNCaP se lavaron con PBS, se fija en 3 % de paraformaldehído, permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 y finalmente bloqueada con 1% de BSA durante 30 min a temperatura ambiente. Las células fueron incubadas con anticuerpo policlonal de conejo diluido AR 1:200 en tampón de bloqueo durante 1 h a TA. Finalmente, las células se lavaron con PBS y se incubaron con marcado con FITC anti-conejo anticuerpo secundario diluido en tampón de bloqueo 1:1000 durante 30 min a temperatura ambiente. Después, las células se observaron bajo un microscopio de fluorescencia (Zeiss, Axiovert 25, Alemania).
Co-inmunoprecipitación y análisis de transferencia Western
Las células LNCaP se sembraron en placas de cultivo de 100 mm y se trataron con conjugado o DHT durante 24 h. Los lisados de células enteras se prepararon como tampón anteriormente [26] en la inmunoprecipitación (IP) que contiene 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, y 1% de Triton X-100 descrito. alícuotas de proteína de 500 g fueron incubadas durante la noche a 4 ° C utilizando 2 g de anticuerpo dirigido contra AR. A continuación se añadieron la agarosa cuentas de Proteína A-Cl y se incubaron adicionalmente durante 6 horas a 4 ° C. Los inmunoprecipitados se lavaron cuatro veces con el tampón de IP y los inmunocomplejos se recuperaron mediante ebullición en tampón de muestra SDS. Finalmente la transferencia de Western se llevó a cabo utilizando anti-AR, anti-SRC-1 y anticuerpos anti-GRIP-1 (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Para el análisis de transferencia Western, los lisados celulares se prepararon después de la cosecha en tampón de lisis. Alrededor del 40 g de proteína total se sometieron a electroforesis en un 12% SDS-PAGE, y el Western Blot se llevó a cabo utilizando el protocolo estándar. En resumen, las proteínas analizadas se transfirieron a membranas de nylon. Las transferencias se bloquearon entonces con tampón de TBST (20 mM Tris-Cl, pH 7,5, cloruro de sodio 150 mM, 0,05% de Tween-20) que contiene 5% de leche desnatada en polvo. Posteriormente fueron lavadas con tampón de TBST y se incubaron durante la noche a 4 ° C con el mismo tampón que contiene cantidades apropiadas de anticuerpos primarios: caspasa-3, Bax, Bcl-2, Akt, p-Akt, ERK, p-ERK, AR, SRC -1, GRIP-1 (1:500) y β-actina (1:1000). A continuación, las transferencias se lavaron y se incubaron con anti-anticuerpo secundario de conejo (1:20,000) conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP). El desarrollo de color se llevó a cabo en la oscuridad utilizando un kit ECL (Amersham, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Las transferencias desarrolladas fueron sometidos a análisis densitométrico por ImageJ software 1.43 (NIH, EE.UU.) utilizando β-actina como control interno.
La transfección
Se cultivaron las células LNCaP y transfectadas transitoriamente con pMMTV-neomicina plásmido -luciferase (/105 células 300 ng) en medio RPMI suplementado con 10% FBS usando reactivo de transfección Polyfect (Qiagen, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. A continuación, las 24 h después de la transfección, los medios de cultivo celular se han cambiado con medios que contenían 5% tratado con carbón vegetal FBS para reducir los esteroides contaminantes a partir del suero y se incubaron durante un día adicional antes de iniciar los tratamientos. En el caso de las células PC-3, que se transfectaron de manera similar, pero además de constructo pMMTV-neomicina-luciferasa, también se transfectaron con el plásmido pSG5-hAR-puro (de longitud completa hAR en el vector de expresión pSG5) en la proporción de 5: 1 como se indicó anteriormente. Para los experimentos que implican co-reguladores, 50 ng de plásmidos co-activador (25 ng cada uno de GRIP-1 y SRC-1) junto con pMMTV-neo-luc (250 ng) se transfectaron a las células LNCaP. Para evaluar la eficacia de la transfección, 500 ng /105 células del SV40 promotor-Renilla luciferasa (pRL-SV40) vector (Promega Madison, EE.UU.) fueron co-transfectadas como control interno. Las células se trataron entonces o bien con vehículo o con diferentes concentraciones (1-40 mM) de conjugado y /o 10 nM de DHT durante 24 h, y se midió la actividad de luciferasa de acuerdo con las instrucciones proporcionadas en el kit (Promega, Madison, EE.UU. ). Cada punto experimental se realizó por triplicado y varió en menos del 10%. Los valores de luciferasa para cada lisados se normalizaron a la actividad de la luciferasa de Renilla.
Para los estudios de localización, el plásmido pEGFP-AR se transfectó a LNCaP y PC-3 células (105 células /300 ng). Las células fueron incubadas con 10 nM de DHT con /sin conjugado 10 y 20 mM y un seguimiento periódico hasta 12 h bajo microscopio de fluorescencia (Zeiss, Axiovert 25, Alemania).
siRNA transfección
La siRNAs contra Akt humana y siRNA ERK y de control fueron adquiridos comercialmente de Santa Cruz Biotechnology (EE.UU.). Las células LNCaP y PC-3 CaP fueron transfectadas con siRNAs (a una concentración final de 100 nM) usando el reactivo de transfección Polyfect (Qiagen, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Después de 24 h de transfección, las células se lavaron apropiadamente y se reemplaza con medio fresco. Las células se trataron a continuación con 20 conjugado mu M durante 24 h y, finalmente, los lisados de proteínas se prepararon en la finalización del tratamiento. Los niveles de P-Akt, p-ERK y exfoliados caspasa-3 expresiones fueron detectados por Western blot.
Análisis estadístico
Los datos se expresan como media ± SEM y estadísticamente evaluó usando uno ANOVA de un factor seguido de Bonferroni
post hoc
prueba utilizando el software Graph Pad Prism 5.04 (GraphPad software, San Diego, CA, EE.UU.). Un
p-valor
de menos de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
La inhibición de la proliferación celular por el conjugado
LNCaP (AR positivo ) y PC-3 (AR células negativas) se cultivaron con diferentes concentraciones de RESV, PTER y conjugado durante 24 h en medio RPMI completo y DMEM, respectivamente. Nuestros datos muestran que el tratamiento de LNCaP y células de CaP PC-3 con RESV, PTER y el conjugado resultó en una inhibición dependiente de la dosis de la proliferación celular. Como se muestra en la Tabla 1, en el caso de las células LNCaP, el conjugado resultó en la reducción de casi 50% en el número de células vivas a 40 ± 1,12 M mientras que fue alrededor de 66,4 ± 1,39 y 82,2 ± 2,19 M en el caso de PTER y RESV tratados células, respectivamente, después de 24 h de tratamiento. Del mismo modo, en el caso de las células PC-3 El IC
valor 50 de conjugado, PTER y RESV se encontró que era 45 ± 1,50, 75 ± 2,55 y 95,0 ± 1,13 mM, respectivamente, después de 24 h de tratamiento (Tabla 1). Por otra parte, cuando se prueba en líneas celulares no cancerígenos como CHO y COS-1, se encontró que todos los compuestos de tener IC
50 valores por encima de 100 mM de concentración. Por lo tanto se encontraron tanto las líneas celulares de cáncer a ser más sensibles al tratamiento con el conjugado, en comparación con PTER y RESV como se representa por el IC inferior
50 valores en todos ellos. Además, nuestros resultados mostraron que PTER-ITC conjugado es un potente agente citotóxico, tanto en AR y AR positivo líneas celulares negativas aunque en un nivel ligeramente más alto en la primera como en comparación con este último.
Sensibilidad diferencial de las células PC-3 y LNCaP conjugar la apoptosis inducida por
En medio de los resultados del ensayo MTT, hemos ampliado nuestro estudio para examinar si las células de CaP sufren apoptosis después del tratamiento conjugado mediante el uso de Anexina-V de ensayo /PI tinción doble y el flujo de El análisis de citometría. Después de células de CaP se incubaron con diferentes concentraciones de conjugado, las células fueron teñidas con Alexa Fluor 488 conjugado con Anexina-V y PI, que puede evaluar las poblaciones de células apoptóticas tempranas y tardías. Como se muestra en la Fig. 1B, el conjugado produjo un aumento dependiente de la dosis en la población celular apoptótica en tanto las células de CaP estudiados. El tratamiento de células PC-3 con el aumento de dosis de conjugado durante 24 h dio como resultado un aumento de células apoptóticas tempranas de aproximadamente 44% a 68% y las células apoptóticas tardías de 12% a 16% a los 20 y 40 mM concentraciones, en comparación con vehículo grupos tratados, respectivamente (Fig. 1B panel superior). Dado que las células PC-3 carecen de una proteína p53 funcional, era de interés para determinar si la presencia de p53 de tipo salvaje afecta a la sensibilidad celular a la muerte celular causada por el conjugado porque p53 es conocido para regular la apoptosis en diferentes estímulos. Hemos tratado esta cuestión mediante la determinación de la sensibilidad de las células LNCaP (p53 de tipo salvaje) en dirección a la apoptosis inducida por conjugado por análisis de FACS. El tratamiento de células LNCaP durante 24 h con dosis crecientes de conjugado resultó en un aumento gradual de células apoptóticas tempranas (Anexina V único positivo) de 52% a 72% a 20 y 40 mM, respectivamente (Fig. 1B, panel inferior). Las células apoptóticas tardías (anexina V y PI positivas) también aumentaron significativamente del 8% al 18,5% (fig. 1B, panel inferior), en comparación con sólo el 0,23% de las células apoptóticas tempranas y número casi insignificante de células apoptóticas finales de los años en el control negativo grupo tratado con 0,1% de DMSO. El histograma en el panel de la derecha (Fig. 1C) indica el análisis estadístico de tres experimentos independientes similares tanto para las líneas celulares. Curiosamente, el número total de células apoptóticas fue estadísticamente no significativa (
p Hotel & lt; 0,05) entre las células LNCaP y PC-3 cuando se probó con diferentes concentraciones de conjugado, lo que sugiere que la proteína p53 no estuvo involucrado en la regulación de la apoptosis inducida por el conjugado de células de CaP.
conjugado inducida por la etapa de detención específica de las células del cáncer de próstata
Con base en el crecimiento y la síntesis de ADN respuestas inhibitorias de conjugado en células de CaP, el próximo examinado su efecto en la progresión del ciclo celular. Como se muestra en la Fig. 2A y 2B, el tratamiento de las células LNCaP con el aumento de dosis de conjugado durante 24 h PC-3 y dieron como resultado un aumento dependiente de la dosis en la acumulación de células en fase G2 /M con disminución concomitante de células en fase G1. En el caso de las células PC-3, el efecto observado en 40 conjugado mu M fue el más grande con aproximadamente 50% de las células de ser arrestado en fase G2 /M, en comparación con sólo 22% en el grupo control (Fig. 2A). Una tendencia similar en el arresto de fase G2 /M también se demostró en células LNCaP (35% en las células tratadas contra 11% en las células de control), aunque la población total de células no pudo alcanzar un alto nivel de 50% como se observa en PC-3 Células. Como se muestra en la Fig. 2B, el tratamiento conjugado resultó en una acumulación de 16 a 35% de las células en fase G2 /M con el aumento de dosis de conjugado. Por lo tanto, la inhibición del crecimiento mediada por conjugado de ambas células PC-3 y LNCaP correlacionada con G2 detención del ciclo celular /M fase.
distribución del ciclo celular de las células PC-3 y LNCaP (B) (A) tras el tratamiento con dosis variables de conjugado. Los resultados se presentan como media ± SEM de tres experimentos independientes. * Representa una diferencia estadísticamente significativa con respecto a las células PC-3 y LNCaP tratadas con vehículo que corresponden respectivamente a cada etapa del ciclo celular en
p
& lt; 0,05. (C) Los efectos de diferentes dosis de conjugado (panel izquierdo) y resveratrol (panel derecho) en -9 y -3 actividades en células LNCaP (D) PC-3 y caspasa-8,. Los resultados son la media ± SEM de tres experimentos independientes. * Representa una diferencia estadísticamente significativa con respecto a las células control para las caspasas respectivos ensayados a
p
& lt; 0,05. (E) El efecto de los inhibidores de caspasa sobre la muerte celular inducida por el conjugado en las células LNCaP (F) PC-3 y. Las células se pre-trataron con 20 mM de inhibidores de caspasa respectivos: Z-LEHDFMK (caspasa-9 inhibidor); Z-IETDFMK (caspasa-8 inhibidor); y Z-VAD-FMK (inhibidor general de caspasa) durante 1 h antes de la adición de 20 conjugado M. La muerte celular se midió 24 h después del tratamiento conjugado utilizando el ensayo MTT. Los datos son la media ± SEM de tres experimentos independientes. * Y#representa una diferencia estadísticamente significativa con respecto al control (vehículo) y las células tratadas con conjugados, respectivamente, para cada uno de las líneas celulares a
p
& lt; 0,05. ns, no significativa.
Conjugado activa la caspasa-3 a través de la caspasa-9
La activación de caspasas ambas vías intrínsecas y extrínsecas ya ha sido conocido por ser los principales mecanismos de las células apoptóticas la muerte en la mayoría de los sistemas celulares. Para comprender mejor las vías celulares subyacentes de la muerte inducida por el conjugado de células de CaP, un posible papel de la caspasa en este proceso se investigó mediante la medición de las actividades de la caspasa-8, -9, y -3 en estas células tumorales. Mientras que la caspasa-8 y la caspasa-9 son proteasas esenciales de las vías de apoptosis intrínsecos y extrínsecos respectivamente, caspasa-3 actúa como efectores aguas abajo de estos dos vías. Tratamiento de PC 3-células con dosis crecientes (10, 20 y 40 mM) de conjugado y RESV durante 24 h causó un aumento dependiente de la dosis en la caspasa-3 actividades enzimáticas de caspasa-9 y. Este incremento fue comparativamente mayor en el caso de las células tratadas con conjugados en comparación con las células tratadas con la misma dosis de RESV (Fig. 2C). Para la caspasa-8, aunque no había aumento marginal de su actividad a dosis alta de tratamiento RESV, no se observó dicha inducción en caso de tratamiento conjugado (Fig. 2C). Por el contrario, los resultados obtenidos en el caso de las células LNCaP mostraron un aumento significativo en los tres caspasa es decir, caspasa-8, -9 y -3 en el tratamiento de conjugado indicativo de participación tanto intrínseco (a través de la caspasa-9) y extrínseca (a través caspasa-8) en las vías de proceso de apoptosis por el conjugado en esta línea celular (Fig. 2D, panel izquierdo). Además, nuestros resultados indicaron que la activación de la caspasa-9 se produce antes de que la caspasa-8 (en dosis más baja), lo que sugiere que la vía mitocondrial podría ser esencial para la apoptosis inducida por el conjugado. Por otro lado, el tratamiento RESV también mostró aumento significativo de la caspasa -9 y -3 actividades, pero en menor medida en comparación con el conjugado (Fig 2D, panel derecho). (
p
& lt; 0,05). Así, los datos anteriores claramente sugiere que el conjugado inducida por la apoptosis en células PC-3 es mediado a través de la vía intrínseca, mientras que tanto las vías intrínseca y extrínseca contribuye a la apoptosis en las células LNCaP. También el conjugado se encontró que era más eficaz que el RESV en la inducción de apoptosis en ambas líneas celulares de CaP probadas.
Además, para dilucidar la vía, que era predominante para la apoptosis inducida por el conjugado, se emplearon los inhibidores farmacológicos de caspasas específicas para sondear si podían proteger a las células de la apoptosis. Como se muestra en la Fig. 2E y 2F, Z-VAD-FMK, un inhibidor general de caspasa, mostraron una inhibición significativa de la muerte celular tanto en PC-3 y las células LNCaP que sugieren que la apoptosis es la forma predominante de muerte celular inducida por el conjugado. En el caso de las células PC-3, Z-LEHD-FMK, un inhibidor específico de la caspasa-9 también inhibieron conjugado muerte celular inducida por 73%, mientras que Z-IETD-FMK, un inhibidor específico de la caspasa-8, era completamente ineficaz en el bloqueo de conjugado de la muerte celular inducida (
p Hotel & lt; 0,05) (Fig. 2E). Además, en caso de las células LNCaP, el inhibidor de la caspasa-9 bloqueó casi completamente la apoptosis inducida por el conjugado mientras inhibidor de la caspasa-8 sólo parcialmente inhibido (Fig. 2F). La muerte celular inducida por el conjugado se inhibió más prominente cuando las células se pre-trataron con ambos inhibidores de la caspasa-8 y la caspasa-9. En conjunto, estos datos refuerza aún más nuestra conclusión de que la apoptosis inducida por el conjugado consiste en caspasa -9 /-8 /-3 y /-3 vías en LNCaP y células PC-3, respectivamente.
9 caspasa-Bcl-2 y Bax están implicados en la apoptosis por el conjugado
Bcl-2 forma un complejo con heterodimeric proteína Bax de apoptosis, neutralizando así su efecto apoptótico. Por lo tanto, la relación de Bax /Bcl2 es a menudo considerado como un factor decisivo en la determinación de la muerte celular o la supervivencia. En el presente estudio, el tratamiento de las células con el conjugado resultó en una disminución en la expresión de
Bcl-2
y
Bcl-xL
con un aumento concomitante en
Bax
gen tanto en LNCaP y células PC-3 (Fig. 3). Esto dio lugar a un aumento sustancial en la relación de Bax /Bcl2, que generalmente favorece la apoptosis. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig. [dieciséis].