Extracto
mitocondrial-núcleo conversaciones cruzadas y la regulación retrógrada mitocondrial puede desempeñar un papel significativo en las propiedades celulares. sistemas cybrid Transmitochondrial (cíbridos) son una excelente herramienta para estudiar los efectos específicos de las mitocondrias alteradas en virtud de un fondo nuclear definida. La mayoría de los estudios que utilizan el modelo cibrido se centró en la importancia de las variaciones específicas de ADN mitocondrial en mitocondriales propiedades de la función o tumorales. Sin embargo, la mayoría de estas variantes son benignos polimorfismos sin importancia funcional conocido. De un objetivo de la rectificación de defectos mitocondriales en células de cáncer y establecer las mitocondrias como un objetivo potencial medicamento contra el cáncer, la comprensión del papel de las mitocondrias funcionales en la reversión de propiedades oncogénicas en virtud de un fondo nuclear cáncer es muy importante. A continuación analizamos el potencial de inversión de las propiedades oncogénicas de una línea celular altamente metastásica con la introducción de las mitocondrias no cancerosas. Cibridos se establecieron mediante la fusión de las mitocondrias ADN agota las células 143B TK- ρ0 partir de una línea celular de osteosarcoma agresivo con las mitocondrias de la línea de células epiteliales de mama benignos células MCF10A, línea celular de cáncer de mama metastásico moderadamente MDA-MB-468 y 143B. A pesar de los antecedentes nuclear canceroso uniforme, como se observa con las células del donante mitocondrias, cíbridos con mitocondrias benignos mostraron propiedades funcionales mitocondriales altas incluyendo el aumento de la síntesis de ATP, el consumo de oxígeno y las actividades de la cadena respiratoria en comparación con cíbridos con mitocondrias cancerosas. Curiosamente, las mitocondrias benignos podrían revertir diferentes características oncogénicas de 143B conocimientos tradicionales
- célula incluyendo la proliferación celular, la viabilidad bajo condiciones de hipoxia, las propiedades anti-apoptóticas, la resistencia a medicamento contra el cáncer, la invasión y la formación de colonias en agar blando, y
vivo
crecimiento tumoral en en ratones desnudos. Microarray análisis sugirió que varias vías oncogénicas observados en cíbridos con mitocondrias de cáncer son inhibidas en cíbridos con mitocondrias no cancerosas. Estos resultados sugieren que la regulación oncogénico crítico por la charla y pone de relieve la rectificación de las propiedades funcionales mitocondriales como un objetivo prometedor en la terapia del cáncer cruz mitocondrial nuclear
Visto:. Kaipparettu BA, Ma Y, Parque JH, Lee TL, Zhang Y, Yotnda P, et al. (2013) La diafonía de no canceroso Las mitocondrias pueden inhibir Propiedades tumorales de las células metastásicas mediante la supresión de Oncogénicos Caminos. PLoS ONE 8 (5): e61747. doi: 10.1371 /journal.pone.0061747
Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Octubre, 2012; Aceptado: 11 de marzo de 2013; Publicado: 9 Mayo 2013
Derechos de Autor © 2013 Kaipparettu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue parcialmente apoyado por el Departamento de Defensa (W81XWH-11-1-0292), Institutos nacionales de /Instituto Nacional del cáncer de la Salud (NIH /NCI) (U54-CA149196 proyecto piloto) y el sistema antibloqueo de frenos Cancer Center de proyecto piloto a B. Kaipparettu y NIH /NCI ( R01 CA-100023) conceder a L. Wong. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las células cancerosas se adaptan a condiciones de hipoxia durante el crecimiento progresivo de las células tumorales al transferir la carga del metabolismo energético de la fosforilación oxidativa de la glucólisis, conocido como el efecto Warburg [1]. La regulación de la expresión de genes nucleares por el genoma mitocondrial, a través de señalización retrógrada '' mitocondrias, los orgánulos permite que coordinen su función con el núcleo. Las células tumorales continúan utilizando la glucólisis como la fuente principal de energía incluso en cultivo bajo condiciones de normoxia [2], lo que sugiere que los posibles cambios genéticos o epigenéticos estables se han producido en las células cancerosas. Además, las mitocondrias cáncer sin cambios genéticos detectables pueden transmitir señales oncogénicas al núcleo e iniciar la regulación retrógrada mitocondrial que conduce a la comunicación bidireccional entre los dos genomas [3].
Con el fin de investigar la contribución mitocondrial específico de tumor propiedades, el efecto de los genes nucleares deben ser excluidos. sistema cíbrido Transmitochondrial es un excelente método para lograr este objetivo [4] - [9]. Varios estudios utilizaron esta emocionante tecnología principalmente para mostrar la importancia funcional y patógena de mutaciones o variantes específicas del ADN mitocondrial (ADNmt) [5], [10]. El ADNmt se conoce a mutar con frecuencia en una variedad de cánceres, pero la mayoría de estas alteraciones de ADNmt, excepto unos pocos, son sin ninguna relevancia funcional conocido y simplemente puede reflejar la inestabilidad genómica de las células tumorales. Incluso sin la presencia de mutaciones de ADNmt nocivo conocido, los estudios han demostrado que las mitocondrias metastásicos pueden mejorar la propiedad tumor de una célula de cáncer y hacerlos metastásico [9], [11]. Sin embargo, desde un punto de vista terapéutico, con el fin de orientar las mitocondrias enfermas, es importante saber si las mitocondrias funcionales no cancerosas pueden revertir la propiedad oncogénica de las células metastásicas. Si es así, la orientación mitocondrias enferma o rectificar el defecto funcional de las mitocondrias normales puede proporcionar un área de druggable crítico para la terapia del cáncer. En este estudio, hemos pedido una pregunta interesante si las mitocondrias no cancerosas pueden revertir las propiedades oncogénicas de una célula de cáncer agresivo. Bajo un fondo nuclear canceroso definido, se compararon las mitocondrias de las células mamarias, moderadamente metastásicas no cancerosas en un fondo nucleares altamente metastásico con las mitocondrias de las células de cáncer muy agresivo como control. Incluso en el mismo fondo nuclear, las mitocondrias de las células no cancerosas podrían inhibir varias vías oncogénicas, invertir las propiedades oncogénicas y mejorar la respuesta terapéutica de las células cancerosas. Esto pone de relieve la importancia de las mitocondrias como un regulador crítico de la propiedad de cáncer celular y un objetivo potencial para la terapia contra el cáncer.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética en Experimentación Animal
Todos los animales los procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de animales institucional y el empleo Comisión en el Baylor College of Medicine y realizan de acuerdo con las directrices del NIH para el tratamiento ético de los animales.
Cybrids
MCF10A células inmortalizadas no cancerosas epiteliales mamarias , cáncer de mama MDA-MB-468 células metastásicas y osteosarcoma derivados 143B conocimientos tradicionales
- células (143B) se obtuvieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA). Un protocolo detallado para la generación de
ρ
0
células y cibridos ha publicado recientemente [3], [6], [8]. En pocas palabras, el ADNmt agota 143B ρ
0 se utilizaron células como el donante del núcleo. Para la generación de cíbridos, las células del donante mitocondrial (MCF10A, MDA-MB-468 y 143B TK-) fueron enucleados mediante tratamiento durante la noche actinomicina-D y se fusionan con el 143B ρ
0 células utilizando 45% de polietilenglicol (MW 1450; Sigma cat P-5402) durante 60 segundos. Un día después de la fusión, las células se cultivaron en medio de selección con bromodesoxiuridina (BrdU), pero sin uridina [3], [12]. 143B de control no fusionada ρ
0 células no podrían sobrevivir sin células de uridina y donantes mitocondrias fueron asesinados por BrdU. Cibridos contienen mitocondrias derivadas de células MCF10A, MDA-MB-468 y 143B 143B con ρ
0 como células de fondo nuclear se nombran como 10A /143B, 468 /143B y 143B /143B cibridos, respectivamente.
la cuantificación y análisis de secuencias de ADNmt y Validación de Nuclear ADN
ADN genómico total se extrajo mediante el método de fenol /cloroformo y el genoma mitocondrial 16,6 kb se amplificó por 24 pares de cebadores se solapan tal como se publicó antes de [13] - [ ,,,0],15]. qPCR se utiliza para cuantificar el número de copias de ADNmt de control de la
ρ
0
condición y para cuantificar el contenido de ADNmt en las cibridos de acuerdo con los procedimientos publicados [16], [17]. Solamente los clones que contienen ADN mitocondrial cybrid comparables copia se utilizaron número de experimentos. ADNmt genoma completo y análisis de secuencias de ADN nuclear de referencia se realizó mediante BigDye Terminator (versión 3.1) kit de reactivos de secuenciación cíclica en un ABI 3730XL DNA Analyzer (Foster City, CA). Los resultados de las secuencias de ADN se compararon con la secuencia de referencia publicado Cambridge de http://www.mitomap.org. fuente nuclear de cibridos fue confirmada por genotipo.
especies reactivas del oxígeno (ROS) Producción
Las células fueron sembradas y cultivadas en glucosa o galactosa medio durante 24 horas en placas de 24 pocillos (2 x 10
4 por pocillo). la producción de ROS se midió 30 minutos después de cargar con 5 mol /L 2 ', 7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA) [18]. Después de lavar con tampón de PBS, se tripsinizaron las células y se suspendieron en el tampón de PBS. medidas de fluorescencia en longitudes de onda de excitación y emisión de 485 y 535 nm, respectivamente, se llevaron a cabo con el lector de microplacas Infinito M200® de un Tecan (Männedorf, Suiza).
Síntesis de ATP
La síntesis de ATP era medido por el ensayo de luciferina /luciferasa [3]. Las células se incubaron con 5 mmol /L malato plus 5 mmol /L glutamato (complejo sustratos I impulsada), o con 10 mmol /L succinato (complejo II impulsada sustrato) más 2 mg /ml de rotenona (I complejo inhibidor), y 0,2 mmol /L ADP durante 3 minutos en presencia o ausencia de 10 mg /ml oligomicina. La tasa de síntesis de ATP oligomicina sensibles se analizó utilizando de Tecan Infinito M200® y se expresa como nmol ATP producido /min /mg de proteína.
Análisis Western Blot
Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE en un gel 12%. Los anticuerpos específicos utilizados para el análisis Western Blot y la quimioluminiscencia se detectaron utilizando peroxidasa de rábano picante etiquetado como anticuerpo secundario (Bio-Rad, CA). Las proteínas mitocondriales: ATP sintasa subunidad alfa (F1α), Core 2, FeS subunidad (Ip), COXII, ND6, y porina (todos de Mitoscience, O). proteínas apoptóticas: exfoliados caspasa 3 y poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) (Cell Signaling, MA). β-actina y Porin se utilizaron como controles de carga para nuclear y proteínas mitocondriales codificadas respectivamente [3].
Ensayo de proliferación celular
La proliferación celular se midió en normoxia (21% O
2 ) o la condición de hipoxia (1% o
2) usando un ensayo colorimétrico basado en la medición de la incorporación de BrdU (4 horas) durante la síntesis de ADN, de acuerdo con el protocolo del fabricante (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania).
TUNEL ensayo
la apoptosis se analizó mediante el ensayo de TUNEL utilizando el sistema DeadEnd ™ fluorométrico TUNEL (Promega, WI, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante [19], [20].
Anticancer Drug tratamiento y Ensayo MTT
Después del cultivo durante la noche de 5 × 10
3 cibridos en una placa de 96 pocillos, los híbridos citoplasmáticos fueron tratados con vehículo, doxorrubicina (0,1 M) en condiciones de normoxia (21% O
2) y la hipoxia (1% O
2) las condiciones de otras 24 h. La viabilidad celular se analizó mediante el ensayo MTT utilizando Tecan Infinito M200 según el protocolo publicado [21], [22].
formación de colonias en agar blando
placa de seis pocillos con agar al 0,5% en DMEM medio como la capa inferior se utilizó para el ensayo de formación de colonias en agar blando. Para cada pocillo, 5 × 10
3 cíbridos en suspensión en medio DMEM con 0,35% de agarosa se sembraron como capa superior y se incubaron a 37 ° C durante 3-4 semanas. Las colonias se tiñeron con 0,005% violeta cristal y se cuentan. El número de colonias por cada cibrido se representó como la media ± desviación estándar.
Matrigel Invasión ™ Ensayo
La capacidad de crecimiento invasivo de cibridos se cuantificó usando BD BioCoat Matrigel ™ Cámara Invasión ™ (6- así) (Becton Dickinson Biosciences, MA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante [23]. Después de tripsinización, 5 × 10
se añadieron 4 células en 0,5 ml de medio a cada pocillo por triplicado. Después de 24 horas, las células invadidas a la cámara inferior se fijaron y se tiñeron con 100% de metanol y 1% de azul de toluidina. El número de células invadidas se contó usando un microscopio y los porcentajes de células de la matriz-invasión de Matrigel se calcularon en comparación con la membrana de control sin revestir.
Microarray génica Análisis de Expresión y validación por qPCR
La expresión génica perfil de 10A /143B y 468 cibridos /143B se compararon mediante Affymetrix U133 Plus 2,0 arrays humana, por triplicado, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, el ARN de 10A /143B y 468 cibridos /143B se extrajeron por triplicado y 5 g de ARN total se utiliza para la síntesis de ADNc de primera y de la segunda cadena. La hibridación de microarrays se realizó en Affymetrix U133 Plus 2.0 chips de microarrays de Affymetrix en estación fluídica F450 usando el protocolo EukGE-WS2v5_450 y escaneado con un escáner Affymetrix GeneChip 7 G (Affymetrix, Santa Clara, CA). Los datos fueron analizados por la facilidad de la base estadística a Dan L. Duncan Centro de Cáncer en el Baylor College of Medicine. Los genes fueron alterados significativamente definido entre los dos cibridos con la prueba t de P & lt; 0,01, doble cambio & gt; 2 o & lt; 0,5; diferencias globales superaron con creces la oportunidad esperada. El conjunto de datos de expresión génica se sometió adicionalmente a la vía de análisis de firmas para encontrar eventos activación de la vía diferenciales putativo. Se definieron las firmas gen de la ruta asociada, a partir de datos pública: la firma p53 consistió en objetivos de genes p53 consolidados y hasta reguladas canónicos, como catalogado en la base de datos IARC p53 (http://www-p53.iarc.fr/TargetGenes.html ), y las otras firmas de genes examinados fueron catalogados anteriormente y descrito [24]. Utilizando el conjunto de genes únicos representados en el conjunto de datos (donde múltiples sondas a que se refiere el mismo gen, se utilizó la sonda con la mayor variabilidad para representar el gen), y con valores de expresión centradas en la media a través de muestras, la expresión media de la genes "arriba" en la firma se restará de la media de los genes "hacia abajo", con el fin de calcular una puntuación ruta de resumen para una firma y muestra el perfil dado. Para los genes seleccionados al azar, las diferencias de expresión de ARNm observadas en el análisis de microarrays fueron validados por Q-RT-PCR utilizando cebadores descritos en la Tabla S1.
En vivo
tumor Análisis Crecimiento
El crecimiento del tumor fue ensayada para cibridos se realizaron con nu /nu ratones desnudos hembra (Charles River Laboratories, MA, USA). Cuatro ratones fueron usados para cada grupo cíbrido. Alrededor de 1,5 millones de células de cada uno de los mismos cíbridos se mezclaron con Matrigel (suspensión de células 300 ul en PBS con 300 ul reducida del factor de crecimiento Matrigel), y se inyectaron en ambos flancos de la derecha de los animales utilizando una aguja de calibre 26 e izquierdo. El tamaño del tumor se midió dos veces a la semana con el calibrador y el tumor de volumen se calculó usando la fórmula LW
2/2 (L y W representa la longitud y anchura de los tumores) [25]. El experimento se terminó cuando la media del volumen del tumor en ninguno de los ratones de control (143B /143B) superó 1,0 cm
3. Al final del experimento, los ratones fueron sacrificados por la exposición al CO
2 y los tumores primarios se extirparon y se pesaron.
Estadísticas
Los resultados se presentan como la media ± SD o SEM . El análisis estadístico se realizó utilizando
t
prueba y ANOVA. P-valor. & Lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados y Discusión
La tecnología cibrido aquí descrito permite la investigación de las mitocondrias de efectos derivados de las células cancerosas o no cancerosas en la función mitocondrial y propiedades oncogénicas en un fondo común nuclear. No todas las células pueden sobrevivir en condiciones mitocondrias empobrecido. Aquí hemos utilizado los conocimientos tradicionales 143B
-. Células como donante del núcleo, que es una de la línea celular más bien caracterizado para estudios cybrid y la primera línea celular humana establecida ρ0
células no cancerosas y sus exposiciones Cybrids mejores propiedades funcionales mitocondriales En comparación con cáncer mitocondrias
Se analizó en primer lugar la función mitocondrial de líneas de células de donantes mitocondriales de los padres y sus híbridos citoplasmáticos. Desde la fuga de ROS es una indicación de la función mitocondrial defectuosa, la producción de ROS se analizó en todas las líneas celulares parentales utilizando sonda permeable a las células, DCFH-DA. En situaciones de estrés metabólico, tal como en ausencia de glucosa, las células se ven obligados a depender únicamente de la fosforilación oxidativa mitocondrial para el suministro de energía [22]. Por lo tanto, si hay un defecto en la respiración mitocondrial, se espera que las células para producir una mayor cantidad de ROS en el medio de galactosa [25]. Como era de esperar las dos líneas celulares de cáncer (143B y MDA-MB-468) produce significativamente mayor (p & lt; 0,05) ROS en un medio de galactosa en comparación con medio de glucosa. Sin embargo, no hubo un aumento significativo en la producción de ROS por células MCF10A en el medio galactosa (Fig. 1A). A continuación, analizó los cibridos y obtuvimos una respuesta similar a la observada con las células parentales. Para cíbridos con las mitocondrias de las células MCF10A benignos, no hubo un aumento significativo en el nivel de ROS en medio galactosa. Sin embargo, las mitocondrias cibridos con cáncer mostraron significativamente mayor nivel de ROS en medio de galactosa (fig. 1B). Para investigar más el sitio de fallo en la cadena respiratoria responsable de la alteración de la fosforilación oxidativa, las tasas de la síntesis de ATP se midieron en presencia de sustratos complejos I (glutamato más malato), o complejo II sustrato (succinato). Como se muestra en la Fig. 1C, las tasas de la síntesis de ATP fueron significativamente mayores en células benignas en comparación con las células cancerosas en la presencia de complejo I (p & lt; 0,01) o complejos sustratos II (p & lt; 0,01). Como era de esperar, las células cybrid también mostraron resultados similares para la síntesis de ATP como se ha observado con las células parentales. En presencia de cualquiera de los sustratos I complejos o complejos sustratos II, la tasa de síntesis de ATP se incrementó notablemente en cíbridos 10A /143B en comparación con 143B /143B y 468 cíbridos /143B (P & lt; 0,01) (Fig 1D.). Estos resultados sugieren que las mitocondrias de cáncer probablemente han función alterada que afecta a múltiples complejos de la cadena respiratoria. El análisis de transferencia Western mostró que en comparación con cíbridos con mitocondrias cáncer, la mitocondrial del complejo I ND6 subunidad ADNmt codificada de la proteína NADH deshidrogenasa mitocondrial fue significativamente mayor en MCF10A /143 cíbridos pero ninguna diferencia en las proteínas codificadas nucleares como F1α, Core2 y Ip (Fig. 1E). Por lo tanto, la introducción de las mitocondrias de MCF10A no canceroso podría aumentar al menos en parte la expresión de ADNmt codifican proteínas de la cadena respiratoria, así, rectificar la función mitocondrial reducida en células de cáncer de 143B.
(A) la producción de ROS en células parentales . Después de células se cultivaron en DMEM-glucosa o medio DMEM-galactosa durante 24 h y ROS se midió utilizando colorante fluorescente DCFH-DA. Los datos se expresan como fluorescencia DCF /mg de proteína. (B) la producción de ROS en las células cybrid. tasa de síntesis (C) mitocondrial de ATP en las células parentales. la síntesis de ATP fue impulsado por sustratos complejos I (glutamato más malato) o sustrato complejo II (succinato) en presencia del complejo I inhibidor (rotenona). Las tasas de síntesis de ATP se expresan como nmoles /min ATP de proteína /mg. (D) mitocondrial ATP tasa de síntesis en cibridos. (E) Western blot de subunidades de proteínas representativas de las mitocondrias complejos respiratorios en cibridos. β-actina y porin se utilizaron como controles de carga para nuclear y proteínas mitocondrias, respectivamente. (* = P & lt; 0,05).
Las mitocondrias no cancerosas pueden revertir las propiedades oncogénicas de la célula metastásica
Para entender el significado funcional de la regulación retrógrada mitocondrial de las mitocondrias no cancerosos en las propiedades tumorigénicas de un núcleo metastásico, se compararon los cíbridos para diferentes propiedades oncogénicas.
proliferación celular y la viabilidad bajo condiciones hipóxicas Condición
En tumores sólidos, las células de cáncer tienen la capacidad de proliferar y mantener la viabilidad en condiciones de hipoxia debido a la vascularización reducida y disminución del suministro de sangre en los tejidos tumorales. Se comparó la proliferación celular en cibridos en condiciones de hipoxia. Curiosamente, incluso bajo el fondo nuclear uniforme, cíbridos con mitocondrias no cancerosas mostraron disminuyó significativamente la proliferación celular en condiciones de hipoxia (Fig. 2A).
(A) Porcentaje de la proliferación celular en cíbridos bajo condiciones hipóxicas (1% O
2 durante 4 horas) en comparación con la condición de normoxia (21% O
2). la replicación del ADN se evaluó usando un ensayo de incorporación de BrdU a base de ELISA. (B) El porcentaje de cibridos invadido en un ensayo de invasión de Matrigel. la imagen de contraste (C) Fase del crecimiento independiente del anclaje de cíbridos con ensayo de formación de colonias en agar blando. (D) La media (± DE) número de colonias con cada cibridos. Resistencia (E) contra el cáncer de drogas de cibridos: Porcentaje de células viables cybrid detectado ensayo MTT después del tratamiento con doxorubicina en normoxia (barra cruzada) y la hipoxia (barra adoraba) las condiciones de 24 horas. (B) Análisis de transferencia Western de los marcadores apoptóticos escinde la caspasa 3 y PARP-1 después del tratamiento con vehículo o doxorrubicina (DOX) durante 24 horas. ß-actina se utilizó como control de carga. (* = P & lt; 0,05, 10A /143B vs 143B /143B y 468 /143B;
† = P & lt; 0,05, 468 /143B vs 143B /143B y
#= P & lt; 0,05, 10A /143B doxorrubicina después normoxia frente a condiciones hipóxicas).
in vitro
Tumorígeno Propiedades
La capacidad de invadir la matriz celular y para crecer en condiciones independientes de anclaje son algunos de los rasgos de cáncer . La línea celular de osteosarcoma 143B donante nuclear es altamente tumorigénico y metastásico en la naturaleza. Primero analiza el potencial invasión de cibridos utilizando cámara de invasión de Matrigel. Como se muestra en la Fig. 2B, ensayo de invasión de Matrigel sugirió significativamente menor índice de invasión de cibridos 10A /143B en comparación con las mitocondrias cibridos con cáncer derivada. A continuación, analizó el potencial de crecimiento de anclaje independiente utilizando
in vitro
ensayo de formación de colonias en agar blando en. Incluso en el fondo nuclear metastásico uniforme, cibridos contienen mitocondrias no cancerosas forman un número significativamente menor en comparación con las colonias cibridos con mitocondrias de cáncer. El número de colonias en cibridos con células metastásicas moderadamente MDA-MB-468 estaba en entre el 10A /143B y 143B cibridos /143B (Fig. 2C y D).
La resistencia a la terapia contra el cáncer Drogas
Resistencia a la muerte celular de medicamento contra el cáncer es una de las causas principales de fracaso del tratamiento del cáncer. La mayoría de los agentes quimioterapéuticos convencionales matan a través de la ruta mitocondrial de la apoptosis. Desde la doxorrubicina se utiliza a menudo en el tratamiento de tumores sólidos, incluyendo cáncer de mama, el hígado y los tumores óseos, la viabilidad de las células después de los tratamientos contra el cáncer de drogas se analizó en cíbridos en condiciones de normoxia e hipóxicas. análisis de la viabilidad celular sugiere que en comparación con 143B /143B y 468 cibridos /143B con mitocondrias cáncer, cibridos contienen mitocondrias MCF10A no canceroso habían aumentado significativamente la muerte celular después del tratamiento con medicamento contra el cáncer, tanto en condiciones de normoxia e hipoxia (Fig. 2E). El aumento de la muerte celular después de la terapia contra el cáncer se confirmó además por el aumento de la expresión de marcadores de apoptosis caspasa 3 y PARP escindida en doxorrubicina tratados cíbridos 10A /143B (Fig. 2F). Estos resultados sugieren que las características mitocondriales desempeñan contribución significativa a la respuesta a la terapia con medicamentos contra el cáncer.
En vivo
crecimiento tumoral
El
in vitro
analiza fuertemente sugerido la inhibición de las propiedades oncogénicas de las células 143B agresivos por la introducción de las mitocondrias no cancerosas. Estos resultados fueron confirmados mediante un
in vivo
modelo de ratones desnudos. Como era de esperar, todos los cibridos formaron tumores en el fondo nucleares altamente tumorigénico y metastásico 143B. Sin embargo, como se observa con
in vitro
ensayo de formación de colonias en el crecimiento tumoral fue inhibido significativamente en cibridos 10A /143B contienen mitocondrias no cancerosos en comparación con cibridos 143B /143B con mitocondrias cancerosas (Fig. 3A). peso y tamaño del tumor fue significativamente menor en cíbridos con mitocondrias derivadas de células MCF10A benignas (Fig. 3B y C). Como se observa en la
in vitro
ensayo de formación de colonias, el tamaño del tumor y el crecimiento en cibridos con mitocondrias derivadas de 468-MDA-MB células de cáncer de mama moderadamente cancerosas estaban entre los cibridos 143B /143B y cibridos 10A /143B . En conjunto, nuestros
in vitro
y
in vivo
estudios sugieren fuertemente que la diafonía mitocondrias poseedores de las mitocondrias no cancerosas puede inhibir las propiedades de tumores de una célula altamente metastásico.
(a) Fotografía de los tumores formados con diferentes cibridos después de su implantación a ratones desnudos. (B) La media (SEM) de peso de los tumores después de su extracción quirúrgica. (C) La media (± SEM) de volumen
el crecimiento del tumor in vivo
en diferentes días después del transplante los cíbridos. (* = P & lt; 0,05 t-test contra 143B /143B y#= P & lt; 0,01 en ANOVA).
mitocondrial retrógrado de señalización de Benigna Las mitocondrias reprimir Varios Oncogénicos Rutas
mitocondrial señalización retrógrada es una vía de comunicación desde la mitocondria al núcleo en condiciones normales y patofisiológicos. Para comprender la regulación retrógrada mitocondrial de los genes nucleares por las mitocondrias cancerosas y no cancerosas, se utilizó el análisis de microarrays. Perfiles de expresión génica se compararon y analizaron bioinformatically las vías oncogénicas para cibridos con mitocondrias del epitelio benigna de mama (10A /143B) y células de cáncer de mama (468 /143B). Curiosamente, incluso en el mismo fondo nuclear, 6478 sonda fija en representación 4071 genes únicos se alteró significativamente en cibridos 10A /143B en comparación con los 468 cibridos /143B (Fig. 4A). Entre los genes alterados significativamente, 4794 sonda fija en representación 2816 genes únicos se levantó regulados y 1684 sonda fija en representación 1255 genes únicos abajo reguladas en cibridos con mitocondrias MCF10A. Un análisis más detallado de las vías oncogénicas sugieren que muchas de las vías oncogénicas incluyendo RAS, HER2, SRC y P53 vías están regulados en cibridos MCF10A /143B con mitocondrias no cancerosas (Fig. 4A). Algunos de los genes supresores de tumores, incluyendo RB1, PTEN y VHL aumentó significativamente en cíbridos MCF10A /143B con mitocondrias benignas. los datos de microarrays de genes seleccionados al azar fueron validados por análisis Q-RT-PCR (Figura S1). Por lo tanto, el análisis de microarrays sugiere fuertemente que incluso en un fondo nuclear de cáncer muy agresivo, las mitocondrias nuclear diafonía de las mitocondrias no cancerosas puede suprimir varias vías oncogénicas y hacer que las células cancerosas menos
.
(A) Comparación de las 10A /143B vs 468 cibridos /143B con genes definidos significativas con la prueba t de P & lt; 0,01, doble cambio & gt; 2 o & lt; 0,5. Amarillo, mayor expresión. Genes validados por RT-PCR se indican. (B) Análisis de la firma Camino de la expresión de datos que muestra los niveles de activación de la vía diferenciales putativos (nombres de firma en cursiva indican diferencias entre los grupos de la muestra con P & lt; 0,01, t-test). , La actividad de la firma vía superior inferido rojo. firmas de la vía se definieron a partir de estudios anteriores, indicadas entre paréntesis [24].
A pesar de que desde hace más de 3 décadas, los tumores son considerados como enfermedades de los oncogenes mutados, los modelos alternativos "metabólicas" también se han propuesto para desempeñar un papel en el desarrollo y progresión del cáncer. La disfunción mitocondrial se considera como uno de los fenotipos más comunes y consistentes de las células cancerosas. En los últimos años, un flujo creciente de documentos es la vinculación de los genes del cáncer con el metabolismo energético [26]. También se han reportado numerosas diferencias en la composición molecular de la membrana mitocondrial interna entre las células normales y cancerosas. Análisis de la composición lipídica de la membrana interna de las mitocondrias varias tumorales ha indicado niveles elevados de colesterol, un contenido variable de fosfolípidos totales, y /o cambios en la cantidad de fosfolípidos individuales en relación con los controles normales [27]. Nuestros resultados demuestran que a pesar de que los genes que codifican proteínas mitocondriales más se encuentran en el núcleo, la introducción de las mitocondrias derivadas de células no cancerosas a un entorno nuclear cáncer resultó en la supresión de las vías oncogénicas y propiedades alteradas de cáncer. Varios informes ROS postularon que podría ser el mediador de las mitocondrias defectuosas en el cáncer [11], [25]. Sin embargo, otros factores distintos de ROS de la mitocondria de cáncer también pueden desempeñar un papel en las características del tumor. También es posible que a medida que la observada con la reprogramación celular, las mitocondrias de diferente entorno celular pueden haber sido programado en cierta manera y que la posibilidad de trasladar algunos de sus efectos a la siguiente generación, independientemente de los antecedentes nucleares. Estudios recientes han sugerido que las mitocondrias alteradas pueden afectar a las modificaciones epigenéticas en los genes nucleares, incluyendo la metilación del ADN [28], [29]. Tales alteraciones epigenéticas incluyendo ADN y modificaciones de la cromatina y la señalización a través de pequeños ARN puede contribuir al mantenimiento de las mitocondrias mediada por la transformación oncogénica de las generaciones.
La mayoría de los estudios se centraron en cybrid mutaciones somáticas en el genoma mitocondrial y su significado funcional. Muchos experimentos se han realizado para investigar el papel de las mutaciones de ADNmt específicos en el cáncer [3], [30] - [36]. Aunque los cambios somáticas del ADNmt son características comunes de los cánceres y algunas evidencias sugieren que ciertas mutaciones en el ADNmt de hecho desempeñan una función en el desarrollo del cáncer, el efecto de las mitocondrias de cáncer en la tumorigénesis sigue siendo en gran medida poco clara [5], [25]. No se observó ninguna diferencia mutacional patógena conocida entre las células 143B y MCF10A. Sin embargo, aunque la mayoría de las mutaciones mitocondriales individualmente no son perjudiciales, existe una posibilidad de que la combinación de diferentes niveles de mutaciones en conjunto puede contribuir a la estabilidad de la proteína y /o de señalización retrógrada.
Resistencia a la muerte celular de medicamento contra el cáncer es una de las causas principales de fracaso del tratamiento del cáncer. La mayoría de los agentes quimioterapéuticos convencionales matan a través de la ruta mitocondrial de la apoptosis. vía mitocondrial de la apoptosis se comporta como un fenómeno crítico, en el que hay una transición rápida y binario a partir de una célula que funciona normalmente a la rápida ejecución de un programa de muerte celular [37]. Un estudio emocionante reciente sugiere que las diferencias en la respuesta al tratamiento quimioterapéutico podría ser debido a las diferencias de tratamiento previo en la disposición de las células tumorales para sufrir apoptosis, una propiedad medible que ellos llaman "cebado mitocondrial" [38]. De acuerdo con su hallazgo, diferencial 'cebado mitocondrial' es un importante mecanismo que subyace en el índice terapéutico de la quimioterapia convencional [38]. Los agentes anti-cáncer específicamente dirigidas a las mitocondrias de las células del cáncer son nombrados como '' mitocans [39] - [42].