Extracto
Objetivo
LC-MS /MS fosfo-proteómica es una tecnología esencial para ayudar a desentrañar los complejos eventos moleculares que conducen al cáncer y propagar. Hemos desarrollado un flujo de trabajo fosfo-proteómico global para determinar la actividad de las vías de señalización y dianas de fármacos en el tejido de cáncer de páncreas para la aplicación clínica.
Métodos
Los péptidos resultantes de la digestión tríptica de proteínas extraídas de tejido congelado de adenocarcinoma ductal pancreático y el fondo de páncreas (n = 12), se marcaron con etiquetas de masa en tándem (TMT 8-plex), separados por cromatografía de intercambio catiónico fuerte, a continuación, se analizaron por LC-MS /MS enriquecido directamente o primero de fosfopéptidos utilizando IMAC y TiO
2, antes del análisis. Dentro de la casa, se utilizaron plataformas bioinformáticas comerciales y gratuitos para identificar los eventos biológicos relevantes del complejo conjunto de datos.
Resultados
de 2.101 proteínas identificadas, 152 demostraron diferencias significativas en la abundancia entre tumor y no tejido tumoral. Ellos incluyen proteínas que se sabe que están reguladas en el cáncer de páncreas (por ejemplo, mucina-1), pero la mayoría eran nuevos marcadores candidatos como HIPK1 & amp; MLCK. De los 6.543 fosfopéptidos únicos identificados (6,284 sitios de fosforilación únicas), 635 mostraron regulación significativa, en particular los de las proteínas implicadas en la migración celular (factores de intercambio de nucleótidos de guanina Rho & amp; MRCKα) y la formación de adherencias focales. No se encontraron sitios de fosforilación activador de Fionia, AKT1, ERK2, HDAC1 y otros objetivos de medicamentos para ser altamente modulada (≥2 veces) en diferentes casos destacando su capacidad de predicción.
Conclusión
A continuación proporcionamos información crítica que nos permite identificar los eventos moleculares comunes y únicas probable que contribuyen al cáncer en cada caso. Dicha información puede ser utilizada para ayudar a predecir la terapia más a medida adecuada para un caso individual
Visto:. Britton D, Zen Y, Quaglia A, S Selzer, Mitra V, Lößner C, et al. (2014) La cuantificación de cáncer de páncreas y Proteoma Phosphorylome: Indica eventos moleculares que probablemente contribuyeron al cáncer y la actividad de dianas de medicamentos. PLoS ONE 9 (3): e90948. doi: 10.1371 /journal.pone.0090948
Editor: Jon CD. Houtman, Universidad de Iowa, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Agosto, 2013; Aceptado: 5 Febrero 2014; Publicado: 26 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Britton et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Todas las obras llevado a cabo en este estudio fueron financiados conjuntamente por el Instituto de Estudios del hígado, del hospital Kings College y Proteoma Sciences plc. Los proveedores de fondos empleado los científicos y los médicos que jugaron un papel clave en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, y la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Tenemos los siguientes intereses. Este estudio fue financiado en parte por Proteoma Sciences plc, el empresario de David Britton, Stefan Selzer, Vikram Mitra, Christopher Lößner, Stephan Jung, Gitte Böhm, Peter Schmid, Petra Prefot, Claudia Hoehle, Sasa Končarević, Malcolm Ward, Hans Dieter Zucht y Ian Pike. Todos los empleados del Proteoma Sciences plc (excepto los recién contratados, Vikram Mitra) tienen opciones sobre acciones o valores en Proteoma Sciences plc. Proteoma Ciencias también producen los reactivos TMT utilizados en este estudio y estos reactivos se cuenta con licencia para su distribución por Thermo Fisher Scientific. No hay más patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera nuestra adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
La fosforilación de proteínas es un proceso común modular la actividad de proteínas supresoras de tumores oncogénicos y [1] - [3]. En muchos casos, los resultados de fosforilación en los cambios del interruptor-como en función de las proteínas, debido a la modulación del plegamiento de proteínas, afinidad por el sustrato, estabilidad y actividad de sus sustratos, a su vez, afectan a las vías de señalización que controlan la proliferación celular, la migración, la diferenciación y la apoptosis, la desregulación lo cual contribuye al fenotipo del cáncer [4]. El cáncer de páncreas es una de las neoplasias malignas más agresivas con una supervivencia mediana de 6 meses. Una proporción significativa de los pacientes son diagnosticados en una etapa avanzada, donde las opciones de tratamiento son muy [5] limitados. Como es el caso de otros tipos de cáncer, la terapia de orientación molecular es prometedor para el tratamiento del cáncer de páncreas avanzado o recurrente [6]. Aunque una variedad de fármacos que se dirigen moleculares han estado disponibles en la última década y muchos otros también se espera que en los próximos años, un avance sigue siendo necesaria para la predicción de los efectos de la droga y la selección de medicamentos. Por ejemplo, sorafenib, un inhibidor de multi-quinasa que actúa sobre hiperactivo receptor del factor de crecimiento endotelial vascular, receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas y Raf, ha demostrado eficacia en algunos pacientes con carcinoma hepatocelular avanzado [7], pero no podemos Actualmente predecir su efecto sobre la un paciente individual antes de iniciar el tratamiento. Para superar estas dificultades, parece crucial establecer un enfoque analítico para ayudar a la selección de medicamentos, donde la expresión y la actividad de múltiples dianas de fármacos se evalúan exhaustivamente sobre una base caso por caso. La fosforilación es un evento clave modulación de la actividad de proteínas, por lo tanto, la medición de la fosforilación de proteínas es un indicador útil de la condición de activación.
Hay cientos de dianas de medicamentos contra el cáncer y las proteínas de señalización oncogénicas que son relevantes para la selección terapéutica, por tanto, medir la expresión y estado de activación de todo ello utilizando el análisis actual estándar de oro, inmunohistoquímica (IHC), no es factible. A este respecto, IHC mantiene un papel como una herramienta de validación. microarrays de proteínas de fase inversa (RPMA) tienen limitaciones debido a un repertorio de anticuerpos limitada y escasa especificidad /reactividad cruzada. Además, las tecnologías basadas en la genómica no permiten mediciones fosfo-señalización. cromatografía líquida - espectrometría de masas (LC-MS /MS) basa enfoques proteómicos se han desarrollado para identificar y cuantificar las miles de proteínas y sus sitios de fosforilación [8], [9]. En este estudio hemos desarrollado un LC-MS /MS basado flujo de trabajo fosfo-proteómico (SysQuant) para superar muchas de las dificultades técnicas y bioinformáticas que participan en la cuantificación efectiva expresión y actividad de las proteínas de señalización, muchos de los cuales son objetivos de medicamentos, por lo un nivel de ancho global o sistema en el tejido tumoral. Comparamos congelado tejido resecado (tumor frente de fondo no tumoral) a partir de doce casos de adenocarcinoma pancreático cabeza ductal y un mayor rendimiento de la utilización de isotopólogos reportero de iones de TMT, lo que resulta en reactivos de 8 complejos y por lo tanto la capacidad de ejecutar ocho muestras al mismo tiempo [10], [11]. eventos moleculares que podrían contribuir al cáncer se identificaron común a todos los casos, sin embargo, algunos eran únicos a un caso individual o subgrupo. También parece haber una relación entre el tiempo de recurrencia y la agrupación de los casos después análisis de componentes principales de las relaciones T /NT de fosfopéptidos. El análisis de fosfopéptidos utilizando SysQuant puede identificar nuevas dianas terapéuticas y también ayudar a estratificar los pacientes en diferentes regímenes de tratamiento basados en el estado de activación de vías de señalización y objetivos de medicamentos conocidos.
Materiales y Métodos
Aspectos éticos y la investigación protocolo fue aprobado por el Comité BioBanco del Instituto de Estudios del hígado, del hospital Kings College (Referencia Nº 08 /H0704 /117). Todos los participantes proporcionaron su consentimiento informado por escrito para utilizar sus muestras de tejido para la investigación. Se seleccionaron doce casos de adenocarcinoma pancreático ductal cabeza (Tabla S1 en las Tablas S1). información clínica no confidencial adicional, como el estadio del tumor, el género y la recurrencia se puede ver en cada caso en los cuadros S2 & amp; S3 en las Tablas S1. muestras de tejido tumoral (T) fueron tomadas de las masas tumorales pancreáticas, mientras que las muestras no tumorales (NT) eran de los páncreas de distancia de la masa tumoral. Todas las muestras de tejido fueron congelados dentro de los 30 minutos de la resección quirúrgica y se almacenan [a -80 ° C] hasta que el análisis por SysQuant (mediana del tiempo de almacenamiento [18,5 meses] rango [4-28 meses]. T frente NT se compararon mediante SysQuant y experimental detalles se describen en el documento Métodos S1. en resumen, esto implicaba la extracción de proteínas a partir de muestras de tejido (cantidades mg utilizados para cada muestra se muestran en la Tabla S4 en las Tablas S1), la digestión con tripsina de las proteínas en péptidos, etiquetado TMT 8-plex de péptidos (tumor y no tumor de tejido de 4 casos por TMT 8-plex), seguido de la mezcla para formar una única mezcla de muestra 8-plex (véase la Tabla S5, en las Tablas S1). Cada muestra TMT 8-plex se divide entonces en tres independientes alícuotas, cada una de las cuales se dividen además en 12 fracciones de intercambio catiónico fuerte (SCX) cromatografía (Tabla S6, en las Tablas S1). a continuación se analizaron El primer grupo de 12 fracciones de SCX directamente por LC-MS /MS utilizando datos duplicados adquisición dependiente carreras seguido de un tercio de ejecución mediante el rechazo dependiente del tiempo de todas las características identificadas en los Experimentos 1 & amp; 2. Los dos juegos restantes de 12 fracciones fueron enriquecidos por primera vez para fosfopéptidos que utilicen cualquiera de cromatografía de afinidad con metal inmovilizado (IMAC) o TiO
2 (Tabla S6, en las Tablas S1). Las fracciones enriquecidas 24 fosfopéptidos resultantes también se analizaron por LC-MS /MS. En total se realizaron 108 carreras LC-MS /MS para cada muestra 8-plex TMT. datos de espectrometría de masas en bruto se realizaron búsquedas en la base de datos /Swiss-Prot UniProtKB humano utilizando la mascota y Sequest (a través del Proteoma descubridor). partidos del espectro péptido (PSM) fueron rechazadas si se identifica solamente con bajo nivel de confianza (≥5% FDR), mostró ≤75% puntuación de fosfo-RS probabilidad, y tuvo que faltan canales de cuantificación (por ejemplo, no todos los picos para las etiquetas isobáricas visibles en los espectros). valores de intensidad en bruto de etiquetas isobáricas de las MEP que pasan los filtros se utilizan para la cuantificación, pero primero normalizaron mediante suma de escala (como se muestra en la Figura S1) para reducir el potencial de sesgo experimental /sistemática. Entrar
2 ratios se calcula a partir de las intensidades de etiquetas isobáricas, mostrando la regulación entre T más de NT para cada caso. Un fosfopéptido T /NT de registro
2 relación es la mediana de registro T /NT relación
2 de todas las MEP únicas para esa secuencia de péptido específico. Una proteína T /NT de registro
2 relación es la mediana de registro T /NT relación
2 a partir de todos los péptidos no fosforilados únicas exclusivas de esa proteína específica. Una prueba t de dos caras (de una sola muestra de ensayo de ubicación) se utilizó para calcular los valores de p. P-valores se representaron frente a log
2 ratios de T /NT en parcelas Volcán para identificar péptidos regulados significativamente. A nivel de proteínas, se añadieron anotación utilizando GO-términos, KEGG-vías e información DrugBank y proteínas también fueron asignadas a las vías utilizando recursos tales como David y cadena. En la anotación nivel de fosforilación sitio usando PhosphoSitePlus se añadieron, incluyendo papel funcional y biológica /patológica conocida del sitio de fosforilación. Partial Least Squares análisis discriminante (PLS-DA) se utilizan para modelar e investigar el conjunto de datos multivariante para identificar los valores atípicos y grupos de todas las intensidades de etiquetas isobáricas de péptidos de cada filtro de paso PSM, así como log 2 ratios
T /NT (fosfopéptidos ) de todos los brazos del flujo de trabajo (IMAC, TiO
2 y no enriquecida). El flujo de trabajo SysQuant, combinando la preparación de muestras fosfo-proteómica, análisis LC-MS /MS, y la bioinformática análisis, se utilizó para identificar los eventos moleculares importantes que creemos que contribuyen al cáncer de páncreas en los casos aquí analizados.
Resultados y Discusión
Todos los péptidos identificados por Sequest y la mascota en este estudio fueron exportados a partir del Proteoma Descubridora y se puede ver en la postal archivos S1, S2 y S3. Archivo S1 contiene todos los péptidos (fosforilados y no fosforilados) identificados a partir de las muestras en TMT 8-plex-1, archivo S2 contiene todos los péptidos identificados a partir de especímenes en TMT 8-plex-2, y File S3 contiene todos los péptidos identificados a partir de muestras de TMT 8-plex-3. Estos archivos zip Suplementarios muestran información detallada, incluyendo Sequest Xcorr, la mascota de iones puntajes, Delta M [ppm], valores de q percolador, y otra información importante. Los datos de estos documentos eran sobresalen de entrada en herramientas bioinformáticas en la empresa para identificar eventos biológicamente relevantes.
En total se identificaron 6.543 secuencias de fosfopéptidos únicos (6,284 sitios de fosforilación únicas), a partir de 2.101 proteínas (Tabla 1). péptido figura 1 muestra identificada de distribución (fosforilada y no fosforilada) a través de los tres brazos (no enriquecido, TiO
2, IMAC) del flujo de trabajo para cada SysQuant TMT 8-plex. La Figura 1 también ilustra el número de péptidos detectados en total para las tres repeticiones de análisis (después de combinar los números de diferentes fracciones) en cada uno y todos los TMT muestras de 8 complejos. Cuando los resultados de cada uno de los componentes paralelos (TiO
2, IMAC, no enriquecido) se comparan los beneficios de un enfoque combinado de enriquecimiento y repite analíticos múltiples (incluyendo la utilización de la lista de rechazo dependiente del tiempo), son evidentes. El número total más grande de fosfo-péptidos fue visto usando IMAC enriquecimiento que representó el 79% de todos los fosfopéptidos únicos identificados. Sin embargo, el TiO
2 fracciones identificada casi el 19% del total que se perdió el uso de una única estrategia de enriquecimiento de fosfo-péptido (Figura 1: 8 TMT-Plex-ALL: A). Lo mismo es cierto para las tres carreras analíticos realizados sobre cada muestra. Si se realizó una carrera dependiente de los datos solo se ven sólo 20.318 péptidos únicos (Figura 1: 8 TMT-Plex-ALL: D). Una segunda serie de datos dependiente añade 5.868 péptidos, mientras que el uso de la lista de rechazo dependiente del tiempo en la carrera de 3 permitidos otros péptidos 3257 a identificarse en general. Colectivamente (ejecutar 2 & amp; 3) lo que representa un 45% adicional sobre la serie 1 solo y el 31% del número total de péptidos únicos. Es importante destacar que los péptidos identificados en la tercera carrera son generalmente de menor abundancia. También ilustramos (Figura S2) el número de fosfopéptidos únicos y no fosfopéptidos identificados en cada archivo en bruto, de cada fracción SCX, en cada brazo del flujo de trabajo (no Enrich, TiO
2, y IMAC), de cada uno TMT muestra de 8 plex (TMT 8-plex-1, 2, & amp; 3)
los diagramas de Venn demuestran el número de.; R: secuencias únicas de fosfopéptidos, B: secuencias no fosfopéptidos únicos, y C: número total de secuencias de péptidos únicos identificados en el TiO
2, IMAC, y /o el brazo no enriquecimiento del flujo de trabajo SysQuant, a través de los tres TMT muestras de 8 complejos en total (TMT 8-plex-ALL) y de forma individual por TMT 8-plex (TMT 8-plex 1, TMT 8-plex 2, TMT 8-plex 3). D: demuestra el nivel de solapamiento que observamos para péptido identificaciones de serie de análisis 1, serie de análisis 2 y 3 serie de análisis (incluido el tiempo de lista de rechazo depende compilado a partir de identificaciones de ejecución 1 y 2)
.
De los 6543 fosfopéptidos identificados, 5409 eran cuantificables. Debido al gran número de fosfopéptidos cuantificables estos deben ser vistos en un archivo Excel separado (S4 de archivos), y no como parte del documento principal. File S4 muestra las secuencias de fosfopéptidos, los residuos fosforilados y el nombre de la proteína y el número de acceso Uniprot a la que pertenece el péptido. Archivo S4 también muestra toda la información cuantitativa y estadística relativa a los fosfopéptidos en el tumor frente a no tumor desde todos los casos, y también da la anotación de información, incluidos los efectos funcionales conocidas del evento de fosforilación. Esta información se extrae de la base de datos PhosphositePlus y se puede observar en las columnas BM-CP. Archivo S4 también proporciona información funcional en relación con la proteína, la información extraída de los términos de GO (columnas CQ-DC) y blancos de la droga si se sabe que tales proteínas (columnas DD-DG) extraídos de la base de datos del Banco de Drogas. Para obtener información adicional con respecto a la abundancia relativa de proteínas y niveles de fosfopéptidos normalizados (fosfopéptidos normalizado a nivel de proteína) se refieren a Archivo S5. La abundancia relativa de fosfopéptidos en el tumor en comparación con tejido no tumoral cambiará de un caso a otro, debido principalmente a los cambios en el nivel de expresión de la proteína fosforilada o debido a la actividad modulada de las quinasas y fosfatasas que inducen o de marcha atrás de la fosforilación del sustrato de proteína, respectivamente. En S5 archivo que normalizar la abundancia relativa de un fosfopéptido a la abundancia relativa de la proteína respectiva. la abundancia relativa de proteínas se calcula utilizando sólo los péptidos no fosforilados, por tanto, hay casos en los que no son capaces de llevar a cabo la normalización debido a la ausencia de péptidos no fosforilados a algunas de las proteínas.
PLS-DA
el primer componente principal (CP1) muestra la variabilidad introducida por las tres ramas diferentes del flujo de trabajo. Estos tres brazos IMAC, TiO
2 y la proteína total (es decir, no enriquecido), como se muestra en la Figura 2A y la Figura S3, se han separado las variables en 3 grupos separados. El círculo negro sólido en la figura 2A representa el espacio T2 de Hotelling sobre la base de confianza del 95%. PC1 explica el 13,6% de la varianza total en el conjunto de datos. El segundo componente principal (PC2) ilustra la variabilidad introducida por los diferentes canales de 8-plex TMT. Esta variabilidad se destacan principalmente al paciente a paciente varianza, que es 10,56% de la varianza total en el conjunto de datos. La variación entre la clase, es decir tumoral (T) vs no tumorales (NT), se muestra por el tercer componente principal (PC3) que explica 14.36% de la varianza total en el conjunto de datos. La Figura 2B y la Figura S4 muestra la agrupación de las variables en dos grupos separados, es decir, T y NT. Las diferencias entre los diferentes brazos del flujo de trabajo también ha afectado PC3, que se ilustra la agrupación de TotalProtein péptidos (no enriquecida) en un solo grupo en la Figura 2B. Sólo paciente 12 no muestra diferencias en T en comparación con NT de acuerdo con la figura 2B. Los PLS bi-parcelas demuestran que no hubo valores atípicos en este conjunto de datos, como se muestra en la parcela Hoteling T2-Rango (Figura S3). PLS confirmó que el experimento fue un éxito, y que no existen diferencias significativas entre T y NT. Las diferencias entre los tres grupos diferentes de existe el flujo de trabajo, pero TiO
2 y IMAC tienen una correlación casi iguales. Junto PC1, PC2 y PC3 explicar 38,52% de la varianza total en el conjunto de datos. La variación que queda en el conjunto de datos se puede atribuir a efectos mixtos de la variabilidad analítica y biológica
A:. PC1 y PC2 parcela puntuación de los dos primeros componentes principales que describen 13,6% (PC1) y 10,6% (PC2) de la variación total en los datos (intensidades de etiquetas isobáricas primas de cada PSM filtros de ajuste de paso). El círculo representa el espacio T2 de Hotelling sobre la base de confianza del 95%. B: PC2 y PC3 gráfico de las puntuaciones de los siguientes componentes principales que describen el 10,6% (PC2) y 14,4% (PC3) de la variación total en los datos. C: PC1 y gráfica de las puntuaciones PC2 de los dos primeros componentes principales que describen el 25,8% (PC1) y el 19,3% (PC2) de la variación total en los datos (registro de mediana
2 relaciones T /NT de todos los fosfopéptidos cuantificables en cada caso ). Aquí también mostrar el tiempo de recurrencia en meses para cada caso, después de la cirugía
Además de investigar las intensidades de etiquetas isobáricas primas en T & amp.; NT muestras para detectar los valores atípicos y grupos, PLS-DA también se utilizó para investigar el registro
2 relaciones T /NT de todos los fosfo-péptidos (mediana del IMAC, TiO
2, no enriquecido), en cada caso, como se muestra en la Figura 2C. Una relación sutil entre la agrupación de casos y el tiempo de recurrencia parece salir, sin embargo, tendría que ser incrementado antes de llegar a conclusiones definitivas el número de repeticiones biológicos. Dicho esto, es interesante observar los casos 14 y 9 agrupan cerca y ambos casos experimentaron recurrencia muy temprano a los 2 y 5 meses después de la cirugía, respectivamente. Casos 10 y 8 también agrupan, pero lejos de todos los demás casos. Caso 10 mostró recurrencia a los 31 meses y 8 caso no tenía signos de recurrencia incluso 23 meses después de la cirugía. Casos 4, 12, 1, 7, 5, y 13 agrupan y éstos mostraron recurrencia entre 10 a 21 meses después de la cirugía. Curiosamente caso 6, que aún está por demostrar la recurrencia, también se agrupa con los casos que mostraron recurrencia a los 10 a 21 meses. Caso 11 no lo hizo grupo con cualquier otro caso.
expresión de la proteína significativamente regulada
Se determinó la abundancia relativa de las proteínas en el tumor en comparación con el tejido no tumoral, usando log mediana
2 T /relaciones de NT de los péptidos no fosforilados únicos para cada proteína como sustitutos para calcular la abundancia relativa de las respectivas proteínas. Se utilizó una prueba t de una cara para calcular los valores de p y estos se representaron frente al log
2 relaciones T /NT en un volcán parcela para detectar significativa (Log
2 T /NT≥0.3 o ≤-0,3 y p = 0.05) regulaciones sobre todos los casos (Figura 3A). En total había 152 proteínas significativamente regula en base a Log
2 T /NT≥0.3 o ≤-0,3 y p = 0.05 (Archivo S6_Sheet 'Pro_TvNT & gt; o & lt; 0.3_p & lt; 0,05). El cuadro 2 muestra las 12 proteínas upregulated significativamente mayor en el tumor en comparación con el tejido no tumoral, y también proporciona una descripción de cualquier función conocida de cada proteína o asociación con el cáncer [13] - [31]. La sobreexpresión de mucina-1 se asocia a menudo con el cáncer y también nos pareció mucina-1 a ser significativamente hasta reguladas en el tejido tumoral pancreática. Curiosamente, encontramos más proteínas regulados hasta significativos de mucina-1, algunos de los cuales pueden llegar a ser más marcadores específicos de cáncer de páncreas, tal vez incluso nuevas dianas terapéuticas, por ejemplo, proteína quinasa homeodominio de interacción 1 (HIPK1). HIPK1, que fue elevada en el tumor en comparación con no tumoral en todos los casos (log mediana
2 T /NT = 1,00; p = 1,59 E -04), es una de las cuatro quinasas de serina /treonina HIPK sabe que interactúan con y regular la actividad de numerosas proteínas celulares incluyendo varios factores de transcripción y cofactores [32], [33], [34]. HIPKs han sido implicados en el control de una amplia gama de vías celulares para regular varios procesos incluyendo la respuesta al daño de ADN, la especificación de tejidos, y la proliferación [34].
parcelas Volcán muestran -log
10 P-valores en relación con log
2 relaciones T /NT para; A: la abundancia relativa de proteínas (determinada a partir de la mediana de registro no fosfopéptido
2 relaciones T /NT), B: fosfopéptidos mide en el IMAC, C: TiO
2, D: y el brazo del flujo de trabajo SysQuant no enriquecido . Los círculos rojos señalan las proteínas moduladas de manera significativa (log
2 relaciones T /NT o ≥ 0,3 ≤-0,3 y valores de p ≤ 0,05) y fosfopéptidos (log
2 relaciones T /NT ≥ 0,75 o 0,75 ≤-y p -valores ≤0.05). E: es un diagrama de Venn que ilustra la distribución de los 635 fosfopéptidos en los tres brazos del flujo de trabajo que fueron significativamente modulada
Para comprender mejor los procesos biológicos y las vías de señalización diferentes KEGG entre el tumor. y no tumoral se seleccionaron los números de acceso de todas las proteínas moduladas de manera significativa y se cargan éstos al recurso DAVID Bio-informática. La vía de señalización de adhesión focal KEGG se vio afectada significativamente más dando una puntuación de Benjamini 1.0E-3. proteínas de adhesión focal significativamente moduladas incluidos; Talin-1, Filamina-A, Filamina-B, Filamina-C, Vinculina, fibronectina, Zyxin, y la quinasa de cadena ligera de la miosina, músculo liso (Figura 4 & amp; File S6_Sheet; FA & amp; lamellipodium). Talin-2, Focal quinasa de adhesión 1 (FAK1), proteína fosfatasa 1 regulador 12A subunidad eran también proteínas de adhesión focal y modula significativamente, pero sólo puede ser visto en File S6, ya que estas proteínas no eran cuantificables en algunos casos y la figura 4 sólo muestra las proteínas cuantificable en todos los casos (por ejemplo, no N /a). Todas estas proteínas de adhesión focal, excepto FAK1, fueron significativamente hasta reguladas en el tumor frente a no tumoral que sugiere un aumento de tamaño y /o la frecuencia de las adhesiones focales en las células dentro del tumor. adhesiones focales se sabe que juegan un papel en la migración de muchos tipos de células [35], [36], [37]. Durante la migración de las adhesiones focales pueden anclar las células a la matriz extracelular tras la formación de proyecciones celulares o salientes; tales como pseudopodium, filopodium, y lamellipodium [37]. También se conocen las proteínas de adhesión focal vinculina y miosina de cadena Light Quinasa estar involucrado en la formación de lamelipodios y promover la motilidad celular. En la Figura 4 se lista proteínas que se sabe están involucrados en la formación de las proyecciones de crecimiento y adhesiones focales, vistos a ser modulada de manera significativa y medible en todos los casos. La membrana plasmática que abarca los receptores de la matriz extracelular (Integrinas) son componentes esenciales de las adhesiones focales sin embargo no se observó la modulación estadísticamente significativa de cualquier expresión de la integrina, pero se observan importantes modulación de la fosforilación de la integrina, como se discute más adelante. El montaje de las adhesiones focales también implica la activación de la señalización Rho, así como la miosina inducida por la contractilidad [37]. La figura 4 muestra también la miosina 9, 10, 11, y 14 fueron significativamente elevados en el tumor en comparación con el tejido no tumoral
Todas las proteínas de esta figura, se mostró a ser asociados con los términos de GO 'lamellipodium' & amp.; 'Adhesión focal' y también demostrado ser significativamente (p = 0.05) hacia arriba o hacia abajo regulada en el tumor en comparación con el tejido no tumoral y cuantificable en cada caso (por ejemplo, todas las proteínas que contienen NA para cualquier caso fueron excluidos de la tabla). Log
2 relaciones de T /NT de los péptidos no fosforilados de cada proteína se utilizaron como sustitutos para calcular la abundancia relativa de las respectivas proteínas. Entrar
2 relaciones T /NT de los péptidos no fosforilados se promediaron durante tres brazos del flujo de trabajo (IMAC, TiO
2, no Enrich).
papel funcional de cuatro proteínas en la Figura 4 (proteína de dominio LIM y SH3 1, Moesin, Palladin, y PDZ y LIM proteína de dominio 7) ya se han discutido en la tabla 2, pero alfa-actinina-4 (ACTN4) es una proteína de unión a actina con múltiples funciones en diferentes tipos de células. En las células no musculares, se encuentra a lo largo de haces de microfilamentos y de tipo las uniones adherentes, en la que participa en la unión de la actina a la membrana. Se cree que está involucrado en los procesos metastásicos como Li Fu et al [38] demostraron que la sobreexpresión de ACTN4 en combinación con 67 LR se asocia con la progresión de esófago carcinoma de células escamosas (CECA). Ellos demostraron que ACTN4 se expresó diferencialmente en el tejido ESCC en comparación con los tejidos normales y que los niveles de expresión de ACTN4 se incrementaron progresivamente desde la etapa I a III. la correlación clínico usando TMA reveló que la sobreexpresión de ACTN4 se asoció significativamente con la etapa avanzada del tumor (p = 2.6E-2) y metástasis en los ganglios linfáticos (P = 4.9E-02) [38]. Plectina También se ha propuesto como un biomarcador de cáncer, especialmente del cáncer de páncreas [39]. Aunque normalmente una proteína citoplasmática, plectina se expresa en la membrana celular en el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) y por lo tanto se puede utilizar para dirigirse a las células PDAC [39]. Nuestro estudio confirma que ambos biomarcadores de cáncer son significativamente sobreexpresado en el tumor en comparación con el tejido no tumoral en pacientes con cáncer pancreático (log mediana
2 T /NT = 0,29 y p-valor = 3.33ey-02 para ACTN4, y el registro de la mediana
2 T /NT = 0,32 y p-valor = 1.63E-03 para plectina).
catenina es necesaria para la formación de adhesión célula-célula delta-1 (uniones adherentes) a través de su interacción con la cola citoplasmática de clásicos y tipo II cadherinas. Catenina delta-1 también modula las actividades de la familia Rho de GTPasas (RhoA, Rac y Cdc42), lo que sugiere que junto con otros sustratos Src, catenina delta-1 regula la dinámica de la actina. Por lo tanto, catenina delta-1 es un regulador maestro de la formación de unión adherente, y es probable que participa en la regulación del equilibrio entre el adhesivo y fenotipos celulares móviles [40]. Aquí se observa disminuyó significativamente los niveles de la catenina delta-1 en el tumor en comparación con el tejido no tumoral (mediana de registro
2 T /NT = -0.29 y p-valor = 1.34E-02). Al considerar el importante papel catenina delta-1 desempeña en la formación /mantenimiento de las uniones adherentes entre las células epiteliales, y teniendo en cuenta nuestra disminución observada en la expresión y la fosforilación de esta proteína que sugiere que estos eventos pueden contribuir a la disociación de las células epiteliales, por lo tanto transición epitelial a mesenquimal . en el cáncer pancreático
de interés particular es el descubrimiento de que la cadena ligera de la miosina quinasa (MLCK) se sobreexpresa significativamente en el tumor en comparación con el tejido no tumoral (mediana de registro
2 T /NT = 0,5 & amp; p- valor = 2.95E -02). MLCK es un Ca
2 de la proteína quinasa + /calmodulina dependiente que regula una variedad de funciones celulares, tales como, la contracción muscular y la migración celular, a través de la fosforilación de las proteínas de cadena ligera de la miosina. Dado que la migración de las células tumorales es un paso clave en la propagación del tumor, quinasa de cadena ligera de la miosina (MLCK) puede ser considerado como una diana terapéutica para la prevención de la diseminación tumoral. De hecho, se ha encontrado activación y expresión MLCK a una relación positiva con la propensión metastásica. Por otra parte, los inhibidores de MLCK han demostrado disminuir la invasividad de las diversas células del cáncer [41]. Es interesante que los casos de 14, 9, 4, y 13 tienen niveles más altos de MLCK y tres de los cuatro de estos casos demuestran también la recurrencia muy temprano (2 meses, 5 meses, 10 meses, & amp; la más larga con 21 meses recurrencia, respectivamente) . Tal vez estos cuatro casos se beneficiarían de la terapia con inhibidores MLCK si estratificación de los pacientes se basa en la alta expresión de la diana del fármaco en el tumor frente a no tumoral. Caso 10 mostraron los niveles más bajos de MLCK en el tumor en comparación no tumoral se correlaciona con este caso que muestra el tiempo más largo antes de recurrencia de 31 meses. MLCK también juega un papel en la señalización de MAPK p38 de una vía que demuestra una mayor actividad en varios de los tumores en este estudio, como se discute más adelante.
Observación de aumento de la expresión de la miosina en el tejido tumoral también es de particular interés como MYH9 (log mediana
2 T /NT = 0,29 y p-valor = 5.93E-03), MYH10 (registro de mediana
2 T /NT = 0,23 y p-valor = 2.18E-02), & amp; MYH14 (registro de mediana
2 T /NT = 0,35 y p-valor = 2.03E-02) son todos los myosins celulares que son críticos para la citocinesis, la forma celular y funciones especializadas tales como la secreción y tapado. Durante la propagación de células de estos tres, jugar un papel importante en la reorganización del citoesqueleto, formación de contactos focal (en la parte central, pero no las márgenes de las células de propagación), y MYH10 induce extensión lamellipodial mientras esta función se antagoniza mecánicamente por MYH9, que se cree que causa lamellipodial retracción. MYH11 (registro de mediana
2 T /NT = 0,34 y p-valor = 2.75E-02) es un miosina célula muscular requerida para la contracción muscular
En la Figura 5 & amp.; [48].