Extracto
La telomerasa juega un papel importante en el desarrollo y progresión de los tumores malignos, y su actividad está determinada principalmente por la regulación de la transcripción de la telomerasa transcriptasa humana (hTERT) revertir. Varios de ARNm de variantes de corte y empalme alternativos (ASV) para hTERT se han identificado, pero no queda claro si la actividad de la telomerasa se asocia directamente con transcripciones hTERT de empalme. En este estudio, hemos desarrollado nuevos protocolos en tiempo real de PCR usando balizas moleculares y se aplica a las líneas de células de carcinoma de pulmón y tejidos cancerosos para la cuantificación de la actividad de la telomerasa y tres transcritos esenciales hTERT deleción respectivamente. Los resultados mostraron que las líneas celulares de carcinoma de pulmón demostraron consistentemente actividad de la telomerasa (14.22-31.43 unidades TPG por 100 células) y varias transcripciones de splicing alternativo de hTERT. Para 165 casos de cáncer de pulmón, la actividad de la telomerasa mostró correlación significativa con la diferenciación del tumor (poorly- & gt; moderada- & gt; bien diferenciado, P & lt; 0,01) y con histotypes (de células pequeñas combinado y carcinoma & gt de células escamosas; carcinoma & gt de células escamosas; carcinoma adenoescamoso & gt; adenocarcinoma, P & lt; 0,05). Aunque las transcripciones generales de hTERT se detectaron en todas las muestras, no se asociaron con la actividad de telomerasa (r = 0,092, P = 0,24). Actividad de la telomerasa se correlacionó significativamente con la proporción de constituyentes de la transcripción de α-deleción (r = -0,267, P = 0,026), β-deleción (r = -0,693, P = 0,0001) y γ-deleción (r = -0,614, P = 0,001). La tasa de positivo y proporción de constituyentes promedio de transcripciones β-deleción (92,12%, 0,23) fueron más altos que los de α-supresión (41,82%, 0,12) o γ-deleción (16,36%, 0,18) transcripciones. El combinado de células pequeñas y carcinomas de células escamosas expresaron menos transcripciones de deleción, especialmente β-eliminación, que otros histotypes, lo que podría explicar su mayor actividad de la telomerasa. En conclusión, los protocolos moleculares de PCR basados en la baliza en tiempo real son métodos rápidos, sensibles y específicos para cuantificar la actividad de la telomerasa y ASV hTERT. Actividad de la telomerasa puede servir como un marcador molecular fiable y eficaz para ayudar a la evaluación de subtipo histológico y la diferenciación de los carcinomas de pulmón. Otros estudios sobre las transcripciones de empalme de TITEh deleción, en lugar de las transcripciones hTERT generales, pueden mejorar nuestra comprensión de la regulación de la telomerasa
Visto:. Liu Y, Wu Bq, Zhong Hh, Tian Xx, Fang GT (2012) Cuantificación de Las variantes de empalme alternativo de Human tert y correlaciones con la telomerasa actividad en el cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (6): e38868. doi: 10.1371 /journal.pone.0038868
Editor: Zhang Chi, Universidad de Texas Southwestern Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Febrero, 2012; Aceptado: 15-may de 2012; Publicado: 18 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas a WG colmillo del Programa 973 (2010CB529402) del Ministerio de Ciencia y Tecnología de China. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
células somáticas normales se someten al proceso de senescencia celular debido a la reducción de telómero progresiva después de cada división celular. La activación de la telomerasa se cree que es responsable del mantenimiento de suficiente longitud telomérica en las células tumorales o madre. Estas células han superado este bloque proliferativa mediante la expresión de la enzima telomerasa, que proporciona las células con la capacidad de dividirse continuamente. Por lo tanto, la regulación de la actividad telomerasa tiene implicaciones importantes para muchos procesos de desarrollo que incluyen la proliferación celular, la diferenciación y el envejecimiento, así como la tumorigénesis. La actividad telomerasa se ha detectado en casi el 90% de todos los tumores malignos humanos, por lo que es un objetivo obvio para el cáncer de diagnóstico y estrategias terapéuticas.
La telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT) es un componente esencial del complejo de holoenzima que añade telomérica repite a los extremos de los cromosomas. La expresión de hTERT normales de longitud completa se correlaciona bien con la actividad de telomerasa y parece ser el factor limitante de la velocidad para la actividad de la telomerasa en las células humanas. El gen hTERT consta de 16 exones y se extiende ~37 kb de ADN genómico, de los cuales ~ 33 kb es secuencias intrónicas y ~ 4 kb restante corresponde a la transcripción de hTERT mRNA. Recientemente, se encontraron tres principales variantes de corte y empalme alternativos (ASV) en los motivos de la transcriptasa inversa de hTERT estar involucrado en el control de la actividad telomerasa: i) α-supresión: carece de 36 pb desde el exón 6 incluyendo motivo A; ii) β-eliminación: carece de 182 pb de los exones 7 y 8, dando lugar a una mutación sin sentido y el truncamiento de la proteína antes de que los motivos de RT conservadas; iii) γ-eliminación: carece de 189 pb del exón 11 dentro de motivos D y E [1]. Hay varias combinaciones posibles de estos sitios de corte y empalme alternativos, que resultan en un gran número de posibles transcritos de corte y empalme, pero los que tienen más de dos sitios de corte y empalme son inestables y degradan demasiado rápido para ser detectado. Debido a, ß y supresión γ transcripciones resultan en truncamientos o mutaciones en el dominio de la transcriptasa inversa esenciales para la actividad catalítica, son ya sea no funcional (β-eliminación o γ-supresión) o incluso tienen efectos dominantes negativos (α-supresión) [1 ] - [4]. Por lo tanto, la correlación entre la expresión del gen hTERT y de la actividad telomerasa es complicado.
Actividad de la telomerasa y la expresión de hTERT se encontraron en 67-85% y 48-95% de los tumores de pulmón, respectivamente, [5], [6], y ambos se asociaron significativamente con una mala supervivencia global y la supervivencia libre de enfermedad en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) [6], [7]. Sin embargo, las relaciones entre la actividad de la telomerasa hTERT y variables clínico fueron controversiales. Lantuejoul S y colaboradores informaron de que la expresión de hTERT fue significativamente menor en el adenocarcinoma (ADC) que en carcinoma de células escamosas (SCC), carcinoma basaloide y cáncer de pulmón de células pequeñas, y la actividad de telomerasa fue menor en los carcinomas de pulmón en estadio I que en otras etapas (II- IV) [5]. Wu TC y compañeros de trabajo demostraron que ni la actividad de la telomerasa ni la expresión de hTERT en NSCLC se correlacionó con características clinicopatológicas tales como grado, las etapas de tumores, los tipos de tumores o los valores TNM [8]. Cabe destacar que la mayoría de los estudios anteriores sólo se probó la telomerasa actividad o transcripciones hTERT generales, y no distingue las diferentes variantes de empalme transcripciones. En el presente estudio, un protocolo de amplificación de los telómeros de repetición en tiempo real (TRAP) con una sonda de cebador ligada inversa (RPP), una especie de sonda de baliza molecular que peina el cebador inverso y la sonda marcada con fluorescencia en una molécula, fue desarrollado para la telomerasa actividad cuantificación en líneas celulares tumorales de pulmón y tejidos. Otro ensayo de PCR en tiempo real con balizas moleculares se desarrolló para analizar los niveles de expresión de los ASV hTERT en las mismas muestras. De este modo se determinó la caracterización de la actividad de la telomerasa y la transcripción de hTERT eliminación de empalme en el carcinoma de pulmón, que puede proporcionar información importante para la comprensión de la regulación de la telomerasa en la tumorigénesis.
Métodos
material tumoral y líneas celulares
Las muestras tumorales fueron obtenidas de 165 pacientes con cáncer de pulmón (115 hombres y 50 mujeres; edad media, 60 años; rango, 31-79 años). Dentro de los 10 minutos después de la cirugía, los tejidos sin necrosis y hemorragia se diseccionaron del tumor, seguido por el flash-congelado en nitrógeno líquido y se almacenan a -70 ° C. Una parte de cada muestra se sometió a examen histológico convencional para asegurar que las muestras contenían al menos 80% de células tumorales. Diagnóstico, clasificación y estadificación patológica TNM (tumor, nódulo, metástasis) se determinaron de forma independiente por dos patólogos experimentados acuerdo con la OMS y la UICC clasificación.
El cáncer no microcítico de pulmón humano A549 líneas celulares, H1299, SPC-A1 y PAA se utilizaron como controles positivos para la actividad de la telomerasa y la expresión del gen hTERT. PAA se estableció a partir de un paciente con adenocarcinoma de pulmón chino y se mantiene en nuestro laboratorio, mientras que otras líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor 100 mL /L (Gibco BRL, Grand Island, NY, EE.UU.), a 37 ° C bajo 5% de CO
2. Las células en el 80-90% de confluencia se recogieron por 0,25% de tripsina-EDTA y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo (PBS, pH 7,4). Después de recuento de células, aproximadamente 10
6 células se lavaron dos veces con PBS y se sedimentaron por centrifugación a 2000 g durante 5 min a 4 ° C. Los sedimentos celulares se almacenaron a -70 ° C para el ensayo de telomerasa plazo de seis meses.
Declaración de Ética
Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Pekín con la aprobación Nº IRB00001052- 10004. Todos los participantes en este estudio han dado su consentimiento por escrito, que ha sido el procedimiento de revisión del comité de ética.
cebadores y la sonda diseño em
La trampa tradicional es un ensayo de dos etapas en el que la telomerasa añade repeticiones teloméricas en el extremo 3 'del oligonucleótido sustrato, y entonces los productos prolongados son amplificados mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando TS y un cebador inverso complementario a las repeticiones teloméricas. En este estudio, un ensayo TRAP en tiempo real se desarrolló mediante el uso de una sonda de cebador inverso ligada (RPP), que combina el cebador inverso y la sonda marcada con fluorescencia en una molécula. El principio de este ensayo TRAP en tiempo real basada en RPP se esquematiza en la figura. 1. La sonda de cebador inverso ligada fue sintetizado por Biosearch Technologies (Novato, CA, USA). La cuantificación de la actividad de la telomerasa se llevó a cabo mediante el control de las señales fluorescentes emitidas por la PPR que había sido incorporado en los productos TRAP (Figura S1). Las balizas moleculares para la cuantificación de hTERT en general o de deleción transcripciones atravesó los exones no de empalme o de los sitios de deleción, respectivamente, de acuerdo con GenBank NM_198253 adhesión (Figura S2). Los cebadores y sondas fueron diseñados utilizando el software Primer Premier 5.0 y 6.0, respectivamente OLIGO. Sus secuencias se presentan en la Tabla S1. La entropía delta de la segunda estructura en cada sonda se calcula software Mfold (http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/mFold/) para comprobar la estabilidad de tallo-bucle. sondas de faro para hTERT y Taqman sonda para el gen GAPDH de control (glyceraldehydes-3-fosfato deshidrogenasa gen) fueron sintetizados por Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, EE.UU.). Todos los conjuntos de cebadores fueron sintetizados y purificados por AuGCT Biotecnología (Pekín, China). La especificidad de amplificaciones de PCR se evaluó por 10% no desnaturalizante electroforesis en gel de poliacrilamida.
Los extractos celulares equivalentes a los números indicados de células A549 Se analizó la actividad de la telomerasa. Los resultados en la electroforesis en gel (izquierda), gráfico de amplificación (arriba) y las curvas de calibración (abajo) indican de forma contundente la relación lineal entre la actividad de la telomerasa y el número de células A549, mientras que el 5 representa un control negativo.
Propiedades -Tiempo cuantificación del ensayo de la telomerasa Actividad
El tampón de lisis CHAPS se preparó como se describe anteriormente [9]. Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de lisis enfriado con hielo (5000 células /l) y se incubaron durante 30 min en hielo. Después de la centrifugación (12 000 g, 30 min, 4 ° C), se recogieron cuidadosamente los sobrenadantes y se congelaron rápidamente a -70 ° C. Las muestras de tejido almacenadas se descongelaron parcialmente y aproximadamente 30 mg de tejido se picó en condiciones estériles hasta que se obtuvo una consistencia suave. La muestra se transfirió a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml, y se mezcla con 200 de tampón de lisis CHAPS mu l. Se añadió inhibidor de RNasa (Takara Biotecnología, Dalian, China, 100 unidades /ml) al tampón de lisis CHAPS antes de la extracción. La concentración de proteínas se midió por el método de Bradford [10]. Los extractos finales se diluyeron a una concentración de proteína /l 2 g con tampón de lisis y se almacenan inmediatamente en alícuotas a -70 ° C.
El volumen total de la mezcla de reacción fue de 20 l y contenía 1 x tampón de flexi GoTaq , MgCl 1,8 mM
2, 50 mM de cada uno de dNTP, 160 nM modificado sustrato oligonucleótido cebador (MTS), 140 nM de sonda cebador ligada inverso, 1 unidad de ADN GoTaq polimerasa (Promega Corporation, Madison, WI, EE.UU.), y 1 mu L extractos de la telomerasa. PCR se realizó utilizando un ABI StepOne en tiempo real termociclador (Applied Biosystems, Framingham, MA, EE.UU.). Después de 30 min de incubación a 30 ° C para la elongación de la telomerasa, la mezcla de reacción se calentó a 95 ° C durante 3 min para inactivar la telomerasa, seguido de una amplificación de 40 ciclos (94 ° C durante 15 seg y 60 ° C durante 60 seg incluyendo lectura de placas de 10 seg). Diez microlitros de cada extracto de la muestra se incubó a 95 ° C durante 10 min y después se añadió el volumen de un décimo a otra reacción en paralelo como control inactivación térmica. En cada experimento, 1 l de tampón de lisis CHAPS sustituido por extracto de proteína se utilizó como control negativo.
TSR8 es un oligonucleótido idéntico al cebador MTS extendida con ocho repeticiones teloméricas AG (GGTTAG)
7, que puede ser utilizado como un estándar para la estimación de la cantidad de cebadores de MTS con repeticiones teloméricas extendidos por la telomerasa en un extracto dado. Además, la detección de TSR8 indica que la etapa de amplificación del ensayo TRAP se realizó de manera efectiva [11]. Para realizar el ensayo TRAP, 1 l de cada dilución TSR8 (0,2 amol /l, 0,04 amol /l, 0,008 amol /l y 0,0016 amol /l, respectivamente) se utilizó para obtener la curva estándar en el que 0.001 amol TSR8 corresponde a cada unidad de TPG (producción total generada). Para un análisis válido, controles apropiados han sido incluidos en cada ensayo:
i) control de la inactivación térmica: la alícuota de extracto se calienta a 95 ° C durante 10 minutos; ii) control negativo: tampón de lisis sustituido por el extracto de proteínas y iii) control positivo: los extractos de células positivas de telomerasa. A veces, la actividad de la telomerasa positiva sólo se pudo detectar en el extracto diluido y no puede ser detectada en los extractos de más concentradas debido a que el extracto de tejido puede contener inhibidores de la polimerasa Taq. Así que para cada muestra de tejido, por lo menos tres concentraciones de proteína (2 mg /l, 0,2 g /l, 0,02 g /l) se ensayaron por duplicado, en los que el valor más alto TPG se consideró como la actividad de la telomerasa final.
la extracción de RNA y análisis en tiempo real de RT-PCR de ASV hTERT
el ARN celular total fue extraído de las muestras congeladas con el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. la calidad del ARN se evaluó mediante electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa. Sólo las muestras con afilados 18 S y 28 bandas S rRNA y sin degradación se utilizaron para el análisis adicional. Dos microgramos de ARN de cada muestra se utilizó para la producción de cDNA utilizando la transcriptasa inversa M-MLV y hexámeros aleatorios (Promega Corporation, Madison, WI, EE.UU.). El cDNA diluido (dilución 1:10) se utilizó para la amplificación de GAPDH de control para evaluar la eficiencia de transcripción inversa, así como la integridad del ARN.
PCR en tiempo real se realizó en un volumen total de 15 l que contenía 1 × tampón flexi GoTaq, 5 mM de MgCl
2, 200 mM de cada dNTP, 1 unidad de ADN polimerasa GoTaq, 800 nM primers (adelante y atrás), 400 sondas nm y 1 l de cDNA diluido (dilución 1:10). La temperatura de hibridación fue diferente para diferentes ASV. El protocolo de ciclado consistió en 3 min de desnaturalización a 95 ° C y una amplificación de 40 ciclos (94 ° C durante 15 s, temperatura de hibridación durante 60 segundos, incluyendo la lectura de la placa). Al probar cada transcripción ASV con el conjunto de cebadores específico, dos productos de la transcripción, con o sin supresión, se amplifican simultáneamente, pero la sonda de baliza única hibridaron con el producto de la transcripción deleción y de fluorescencia [12] emitida. El valor de Ct de cada variante de corte y empalme de TITEh se normalizó con el valor Ct de GAPDH restando el valor Ct GAPDH a partir del valor Ct objetivo. El nivel de expresión relativo para cada objetivo PCR se calculó utilizando la ecuación [13]: Expresión relativa = 2
- [Ct (objetivo) -Ct (GAPDH)] x 10.000. La proporción de constituyentes hTERT ASV (que se calcula dividiendo el valor relativo de expresión de los transcritos en general por el de la ASV) también se determinó para cada muestra de tejido.
Análisis estadístico
los datos estadísticos descriptivos básicos eran obtenido mediante el software SPSS 11.0. los coeficientes de correlación de Spearman (r) se calcularon para evaluar las asociaciones entre la actividad de la telomerasa, hTERT ASV de expresión y clinicopathological datos. Las diferencias en la actividad de la telomerasa o la expresión de hTERT cuantitativa entre los subgrupos analizados se evaluaron mediante la prueba t de una sola vía o desapareado ANOVA. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró significativo un
Resultados
La cuantificación de la actividad de la telomerasa y hTERT ASV en líneas celulares tumorales
La sensibilidad y la linealidad de la real basado en RPP. ensayo TRAP-tiempo se puede valorar como no microcítico de pulmón de células A549 línea celular de cáncer. Los sedimentos celulares que contenían aproximadamente 10
6 células se resuspendieron en tampón de lisis 200 mu l CHAPS, por lo que los extractos correspondían a la actividad telomerasa de 5000 células por microlitro. Los extractos de la telomerasa se diluyeron en serie 1000-1 de células por microlitro, y 1 l de extracto se utilizó en la cuantificación de la actividad de la telomerasa en triplicado. La telomerasa en extractos añadiría repeticiones teloméricas en el extremo 3 'del oligonucleótido sustrato (MTS) en la primera etapa de incubación y los productos se amplificado como molde en el proceso de PCR subsiguiente. Como se muestra en la Figura 1, utilizando la electroforesis en gel de poliacrilamida-TRAP (TRAP-PAGE) de ensayo, la actividad de la telomerasa puede ser detectada en al menos diez células A549, indicados por la presencia de una escalera hexanucleotide visible de productos de PCR en el gel de poliacrilamida. Sin embargo, utilizando el ensayo TRAP en tiempo real basada en RPP, la actividad de la telomerasa puede ser detectada en tan pocas como una célula A549. Una relación lineal también se observó entre la actividad de la telomerasa y el logaritmo del número de células que van de 1 a 1000 células. El coeficiente de correlación calculado a partir del modelo de regresión lineal fue hasta el 96,4%. Incluyendo la extracción de la telomerasa, el ensayo TRAP en tiempo real basado en RPP podría acabar en el plazo de tres horas, mientras que la TRAP-PAGE tomaría por lo menos 5 horas. Es importante destacar que, el ensayo TRAP en tiempo real basada en RPP fue precisión cuantitativa y reproducible. Como se muestra en la Tabla 1, las líneas celulares A549, H1299, SPC-A1 y PAA demostrado consistentemente la actividad de la telomerasa de 14.22 a 31.43 unidades de TPG por cada 100 células.
Las balizas moleculares son sensibles y específicos porque las sondas no son hidrolizados en la amplificación y sólo reconocen los objetivos perfectamente complementarias. En la cuantificación de hTERT ASV, la sonda de baliza molecular se hibrida con los transcritos correspondientes y monitorea la síntesis de los ácidos nucleicos específicos en tiempo real. Por ejemplo, el H1810 sonda es complementaria a la secuencia de ADN en la unión del exón 3 y el exón 4 del gen hTERT, y se hibridaría a todas las transcripciones de hTERT y por lo tanto detectar la transcripción de hTERT en general, incluyendo las transcripciones normales y variantes de empalme. Sin embargo, la sonda A2173, B2331 y R2699 sólo detectan las alfa, beta o deleción γ transcripciones respectivamente. Al utilizar el protocolo de cuantificación de nuevo desarrollo, en las células SPC-A1, todos los tres transcritos de corte y empalme de deleción se detectaron, con la relación de 0,21, 0,26 y 0,04 para alfa, beta o deleción γ transcripciones respectivamente (Tabla 1 y Figura 2), que induciría transcripciones parciales no funcionales y puede explicar su baja actividad de la telomerasa. En otras líneas celulares, la transcripción γ-supresión no se ha detectado y los niveles de expresión de las transcripciones α-supresión (rango, 0,25-0,44) fueron mayores que las transcripciones de eliminación beta (Tabla 1).
Representante curvas de amplificación lineales se muestran para la detección cuantitativa de hTERT general (a), α-supresión (B), β-eliminación (C) y γ-deleción (D) transcripciones respectivamente. GAPDH sirvió como un control interno. Carolina del Norte:.
Control negativo
La cuantificación de la actividad de la telomerasa y hTERT ASV en muestras de tumores de pulmón
En el ensayo TRAP de la muestra de tejido tumoral, los resultados, tanto en la electroforesis en gel de poliacrilamida y curvas de amplificación de TRAP en tiempo real basada en RPP se indica la relación lineal entre la actividad de la telomerasa y el logaritmo de la concentración de proteína (Figura 3). En un caso de carcinoma de células escamosas, la actividad telomerasa se pudo detectar a una concentración de proteína tan bajo como casi 0.002 mg /l. Para obtener el resultado TRAP cuantitativa fiable, al menos tres concentraciones de proteína (0,02, 0,2 y 2 mg /l) por duplicado para cada muestra de tumor se analizaron con dos experimentos separados.
Serial extractos de proteínas diluido a partir de 2 g hasta 0,0002 g se ensayaron para la actividad de la telomerasa en un caso de carcinoma de células escamosas. Los resultados en la electroforesis en gel (izquierda), gráfico de amplificación (arriba) y las curvas de calibración (abajo) indican constantemente la relación lineal entre la actividad de la telomerasa y la concentración de proteína, mientras que 6 representa un control negativo.
En todo 165 especímenes de tejidos de tumor de pulmón, la actividad de la telomerasa variaron de 0.39-482.46 unidades TPG (Tabla 2). La actividad media de la telomerasa en pacientes de sexo masculino fue significativamente mayor que en pacientes de sexo femenino (P = 0,006). Actividad de la telomerasa se asoció negativamente con la diferenciación del tumor (r = 0,022, P = 0,005), en el que los tumores pobremente diferenciados mostraron la mayor actividad de la telomerasa. Actividad de la telomerasa fue significativamente diferente entre los cuatro principales fenotipos histológicos de carcinomas de pulmón (P = 0,001), lo que también fue evaluada por pares. La pequeña celda combinada y el carcinoma de células escamosas (CSS) mostraron la mayor actividad de la telomerasa (frente a otros tres histotypes, P = 0,001), seguido por Scc y carcinoma adenoescamoso (asc) (frente a otros tres histotypes, P = 0,025, respectivamente), mientras Adc mostró la menor actividad de la telomerasa (frente a otros tres histotypes, P = 0,001). No se encontró asociación entre la actividad de la telomerasa y el estadio TNM se encontró en este estudio (P & gt; 0,05) guía empresas
La cuantificación de los transcritos en general y la supresión de empalme de TITEh se realizaron en todas las muestras tumorales.. En el análisis de Spearman, no hubo correlación significativa entre la expresión de hTERT transcripciones generales y actividad de la telomerasa (r = 0,092, P = 0,241), y entre la expresión de hTERT transcripciones en general y cualquier parámetro clínico patológica (P & gt; 0,05). Se detectaron las transcripciones, ß y γ deleción en 41,82%, 92,12% y 16,36% de los pacientes, y su relación media constituyente fue de 0,12, 0,23 y 0,18, respectivamente. Sólo 16 pacientes expresaron todos los tres transcritos de deleción en el mismo tiempo. Era notable que todos los coeficientes de constituyentes tres transcritos de deleción 'se correlacionaron significativamente con la actividad de la telomerasa, mientras que el coeficiente de correlación fue de -0,267 para α-supresión transcripción (P = 0,026), -0,693 para β-eliminación transcripción (P = 0,0001) y -0,614 para γ-eliminación transcripción (P = 0,001), respectivamente. En pacientes masculinos, los coeficientes medios constitutivos de las tres deleciones eran más bajos que los de pacientes de sexo femenino, en consonancia con la más alta actividad de la telomerasa entre ellos. Sin embargo, sólo β-eliminación y γ-deleción mostraron diferencias significativas entre los pacientes masculinos y femeninos (P = 0,006, p = 0,027, respectivamente). En cuanto a las comparaciones por pares entre los subtipos histológicos y tres supresión transcripcional relaciones de constituyentes, la CSS mostró relación inferior constitutiva significativo en β-eliminación (P = 0,011) y γ-borrado (P = 0,015) que Adc. El SCC sólo se presentó menor proporción de constituyentes en γ-supresión (p = 0,006) que el ADC. No se encontró asociación significativa entre ninguna supresión transcripcional proporción de constituyentes y la diferenciación tumoral, el estadio o la metástasis de los ganglios linfáticos. Además, los pacientes con metástasis pleural mostraron proporción de constituyentes transcripcional significativamente mayor en β-eliminación (P = 0,041), pero no en otros dos deleciones (P = 0,227 y P = 0,735 respectivamente).
Discusión
Desde la telomerasa se expresa en casi 90% de todos los cánceres humanos, ha habido gran interés en el desarrollo de un ensayo de telomerasa adecuado para los ensayos clínicos [14]. Como punto final y análisis semi-cuantitativo, la TRAP tradicional es de bajo rendimiento, limitada en la cuantificación precisa y probable que sea falso negativo debido a que la eficiencia de la amplificación PCR puede ser inhibida por la proteína en el extracto celular. La cuantificación de la actividad de la telomerasa usando el análisis en tiempo real es más preciso porque se basa en los valores de Ct determinados durante la fase exponencial de PCR a concentraciones relativamente bajas de producto de PCR antes de la saturación o meseta. Anterior tiempo real cuantitativa TRAP con tintes fluorescentes o sonda TaqMan es menos específica y más limitados en su potencial cuantitativo debido a la no correspondencia de uno a uno entre la fluorescencia y el producto de PCR [15], [16]. Aquí, se describe un nuevo ensayo TRAP cuantitativa mediante el uso de una sonda de cebador inverso ligada (RPP). RPP es un interruptor molecular para detectar la amplificación de ADN mediante la utilización de transferencia de energía entre el fluoróforo (FAM) y extintor (DABSYL). El OFF a ON cuando se produce la conformación de la RPP cambia de un "cerrado" estructura de tallo-bucle intramolecular a una estructura de "abrir" extendida. Este cambio estructural se consigue cuando uno RPP se incorpora en una molécula de doble cadena de ADN por PCR. La amplificación se puede controlar mediante la medición directa de la fluorescencia de la mezcla de reacción. En este estudio, la actividad telomerasa demostró relaciones lineales satisfactorios con el logaritmo del número de células cultivadas o concentración de proteína en el rango apropiado. Actividad de la telomerasa puede ser detectada en tan sólo una de las células tumorales cultivadas o tan bajo como 0,002 g de proteína a partir de tejido tumoral. En consonancia con el informe anterior, el ensayo TRAP en tiempo real basados en fluoresceína sonda dio resultados más rápidos y precisos para la actividad de la telomerasa cuantificación de TRAP tradicional con electroforesis en gel [17]. En nuestro estudio anterior, se analizó la actividad de la telomerasa de 60 tejidos de cáncer de pulmón utilizando SYBR TRAP en tiempo real verde, un análisis cuantitativo relativo, y sólo encontramos la diferencia en la actividad de la telomerasa entre NSCLC y CSS [9]. En este estudio, se aplicó el TRAP en tiempo real basada en RPP a un mayor número de muestras de tumor de pulmón de tejido (165 casos) y análisis de la curva estándar que se utiliza. Se encontró una diferencia significativa en la actividad de la telomerasa entre cuatro tipos histológicos: CSS & gt; Scc & gt; ASc & gt; Adc, que era consistente con el informe de Fujiwara [18]. Ohmura y Maniwa han informado de una mayor actividad de la telomerasa en NSCLC (42.3 y 75.24 unidades TPG respectivamente), en el que se examinaron 60 y 40 casos, respectivamente, y se utilizan métodos semi-cuantitativos [19], [20]. Consideramos que estas contradicciones se podían atribuir a la diversidad en las poblaciones y tamaño de la muestra, y en especial a las diferentes técnicas utilizadas para detectar la actividad de la telomerasa. También entraba en conflicto en la literatura si el nivel de actividad de la telomerasa se correlaciona con las características clínico-agresivas, como la diferenciación del tumor y el estadio TNM [6], [19] - [21]. Uso de la TRAP en tiempo real basada en RPP, se observó una fuerte correlación entre la actividad de la telomerasa y la diferenciación del tumor. Era interesante que se observó diferencia en la actividad de la telomerasa entre los pacientes masculinos y femeninos en este estudio. Que los pacientes de sexo femenino que sufren principalmente de Adc, que tenía actividad de la telomerasa más bajo que otros subtipos, pueden contribuir a su actividad de la telomerasa menor que los pacientes masculinos. Así, la actividad de la telomerasa parece ser un marcador útil para determinar el tipo histológico y la diferenciación en los carcinomas de pulmón.
Algunos autores afirman que la detección de hTERT mRNA por RT-PCR o hibridación in situ podría utilizarse para evaluar la telomerasa actividad [5]. Sin embargo, la regulación transcripcional y post-transcripcional de hTERT era compleja y no completamente aclarada. Anteriormente, se utilizó conjunto de cebador o sonda TaqMan que abarca el sitio de deleción en la mayoría de los estudios para los exámenes variantes de empalme [22] - [26]. Sin embargo, estos conjuntos de cebadores o sondas pueden amplificar tanto las transcripciones de larga duración y las transcripciones de eliminación debido a la hibridación escalonada con plantillas mixtas. En el presente estudio, hemos desarrollado un ensayo cuantitativo utilizando las balizas moleculares y detectamos todas las tres transcripciones de supresión en las células SPC-A1. Se encontró una relación relativa alta constituyente (rango, 0,21-0,44) para las transcripciones α-supresión en las líneas celulares de cáncer de pulmón de cuatro, que no es consistente con los datos que muestran menor proporción de constituyentes (rango, 0,06-0,15) anteriormente [1] , [25], [27]. Esto se puede atribuir a nuestro uso de la baliza molecular más específica, en lugar de los ensayos de PCR anidadas semi-cuantitativos. Los patrones de ASV hTERT mostraron ser variado en los tumores de mama, hígado, gástrico, de colon, de tiroides y de pulmón, en el que las tasas positivas de ASV hTERT fueron probablemente sobreestimadas por amplificación de una región que abarca los dos sitios de deleción [1], [11] , [21] - [24], [26], [28]. Nuestro ensayo cuantitativo para cada una transcripción eliminación proporciona una solución para cuantificar con precisión la expresión ASV y evaluar su relación con los parámetros clínico-patológica.
En este estudio, no se observó ninguna asociación entre la actividad global transcripciones hTERT expresión y la telomerasa, coherentes con los informes anteriores en otros tumores [29], [30], lo que indica que no era razonable sustituir la detección general de ARNm de hTERT para la evaluación de la actividad de la telomerasa. Se encontró que más del 92% de los pacientes expresa al menos una deleción de transcripción, pero sólo el 9,7% expresado todos los tres transcritos de deleción. En particular, las relaciones de constituyentes de los tres transcritos de deleción se correlacionaron significativamente con la actividad de telomerasa. Las transcripciones β-deleción fueron las variantes de empalme más comunes en la mayoría de los carcinomas de pulmón y mostró la correlación más fuerte con la actividad de la telomerasa. Esto es similar a los resultados anteriores en otros tipos de tumores [11], [22] - [24], [26].