Extracto
El objetivo de este estudio es los efectos anticancerígenos de
Cudrania Tricuspidata
vástago ( CTS) extracto de células de cáncer cervical. El efecto de la CTS en la viabilidad celular se investigó en células de cáncer de cuello uterino VPH positivas y queratinocitos humanos HaCaT normales. CTS mostró efectos citotóxicos dependientes de la dosis significativas en las células de cáncer de cuello uterino. Sin embargo, no hubo ningún efecto citotóxico de CTS en los queratinocitos HaCaT en concentraciones de 0,125 hasta 0,5 mg /mL. Sobre la base de este efecto citotóxico, hemos demostrado que CTS apoptosis por abajo de la regulación de los oncogenes virales E6 y E7 inducida. La apoptosis se detectó mediante tinción con DAPI, la anexina V-FITC /PI tinción, análisis del ciclo celular, Western Blot, RT-PCR, y JC-1 tinción en células de cáncer cervical SiHa. Los niveles de expresión de ARNm de moléculas vía extrínseca, tales como Fas, receptor de muerte 5 (DR5), y relacionado con TNF inductor de apoptosis ligando (TRAIL) se incrementaron en un CTS. Además, el tratamiento CTS activa /caspasa-8 y la escisión de poli (ADP-ribosa) polimerasa caspasa-3 (PARP). Sin embargo, los mitocondriales potencial de membrana y los niveles de expresión de moléculas de vía intrínseca, tales como Bcl-2, Bcl-xL, Bax, y el citocromo C no fueron modulados por CTS. Tomados en conjunto, estos resultados indican que la apoptosis inducida CTS mediante la activación de la vía extrínseca, pero no la vía intrínseca, en células de cáncer cervical SiHa. Estos resultados sugieren que CTS se puede utilizar como un agente de modulación en el cáncer cervical
Visto:. Kwon S-B, Kim M-J, Yang JM, Lee H-P, Hong JT, Jeong H-S, et al. (2016)
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Stem extracto induce la apoptosis a través de la ruta extrínseca en células SiHa cáncer cervical. PLoS ONE 11 (3): e0150235. doi: 10.1371 /journal.pone.0150235
Editor: Yi-Hsien Hsieh, Instituto de Bioquímica y Biotecnología, TAIWAN
Recibido: 24 Noviembre 2015; Aceptado 10 de febrero de 2016; Publicado: 9 Marzo 2016
Derechos de Autor © 2016 Kwon et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por el programa básico (2015R1A2A2A09001137) de la Fundación Nacional de investigación de Corea (NRF), http://www.nrf.re .kr /nrf_eng_cms. D. Y. Yoon fue apoyado en parte por el Programa de Investigación de Centros (desde 2.012 hasta 0.006.686) Prioridad. Los autores agradecen a Pharma Teksol y Chungcheongbukdo Bio CS por su apoyo intelectual y financiero de este proyecto. No había recibido financiación externa adicional para este estudio
Conflicto de intereses:. Autor Eun Suk Kim es empleado de una empresa comercial, Chungcheongbukdo Bio CS, y la compañía proporciona apoyo en forma de salario para ella. Sin embargo, la compañía no tenía ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. La función específica de este autor se articula en la sección 'autor' contribuciones
Abreviaturas:. VPH, el virus del papiloma humano; CTS,
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vástago; DR, receptor de muerte; TRAIL, ligando inductor de apoptosis relacionada con el TNF; PARP, poli (ADP-ribosa) polimerasa
Introducción
El cáncer cervical es una de las enfermedades más comunes que afectan a las mujeres en todo el mundo y sigue siendo una gran causa de mortalidad entre las mujeres en los países en desarrollo [1-2 ]. Los datos epidemiológicos y clínicos sugieren que la infección con los tipos de virus del papiloma humano de alto riesgo (VPH), tales como los tipos 16 y 18, juega un papel importante en la etiología multifactorial de cáncer [3] cervical. oncoproteínas VPH de alto riesgo E6 y E7 desempeñan papeles importantes en el mantenimiento del crecimiento de células de cáncer cervical. Oncoproteínas E6 y E7 inactivan tumor supresor de proteínas p53 y pRb, respectivamente [4]. El VPH de alto riesgo oncoproteína E6 se asocia con y degrada p53, mientras que la proteína E7 del VPH compite con E2F para la proteína retinoblastoma (pRb) sitios de unión [5].
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es la pertenencia de un árbol de hoja caduca a la familia
Moraceae Windows que se distribuye principalmente en Corea, china y Japón. La totalidad de
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planta se ha explotado como un importante remedio popular para el cáncer en Corea durante las últimas décadas, mientras que también se ha utilizado como medicina tradicional para curar la neuritis y la inflamación en otras partes de Asia [6]. Además, varios efectos de
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extracto han sido reportados, incluyendo la actividad antioxidante [7] y los efectos inhibidores sobre la sintasa de óxido nítrico [8]. Sin embargo, los efectos anticancerígenos del extracto de la raíz de
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en células de cáncer cervical no se han investigado.
Por lo tanto, los objetivos de este estudio fueron investigar la actividad anticancerígena de
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vástago (CTS) extraer de células de cáncer cervical por VPH-positivo y para investigar los mecanismos apoptóticos de CTS. Aquí, mostramos que el tratamiento CTS provoca la apoptosis a través de la vía extrínseca, así como a través de la represión contra el VPH-16 oncoproteínas E6 y E7 y la alteración de los niveles de proteína de p53 y pRb-p.
Materiales y Métodos
Reactivos y anticuerpos
CellTiter 96 AQ
ueous Móvil One Solution Ensayo de proliferación de reactivo [MTS, 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) 2- (4-sulfofenil) 2H-tetrazolio] se adquirió de Promega (Madison, WI, EE.UU.). yoduro de propidio (PI) y 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) tinción se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). NE-PER nuclear y citoplasmática Extracción Los reactivos se adquirieron en Pierce (Rockford, IL, EE.UU.). Los anticuerpos específicos para PARP, caspasa-3, caspasa-8, p53, Bcl-2, Bcl-xL, Bax, Bid, pRb, p-pRb, y el citocromo C se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EE.UU.). El anti-IgG de conejo con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anticuerpo secundario anti-ratón y anticuerpo secundario IgG conjugado con HRP se adquirieron de Millipore (Billerica, MA, EE.UU.). Los anticuerpos específicos para p27, p21, y gliceraldehído 3-deshidrogenasa de Addison (GAPDH) fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.). JC-1 (5,5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-cloruro de tetraetilo benzimidazolycarbocyanine) fue adquirido de Enzo (Farmingdale, NY, EE.UU.). General de la caspasa-inhibidor Z-VAD-FMK y la caspasa-8 inhibidor Z-IETD-FMK se adquirieron de I + amp; D Systems (Minneapolis, MN, EE.UU.). El Kit de FITC-anexina V Detección de apoptosis que se adquirió de BD Biosciences (San Jose, CA, EE.UU.).
Los métodos de extracción
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vástago (CTS) extracto de la planta se adquirió de Corea del extracto bancario (KPEB), Corea del Instituto de Investigación de Biociencia y Biotecnología (KRIBB) (Ochang, Chungbuk, Corea). En resumen, el tallo seco de
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se lavó con agua estéril y se sometió a extracción con metanol (MeOH) a 30 ° C durante 3 días. El disolvente se evaporó a presión reducida para dar un extracto bruto, tal como se describe en un informe anterior [9].
cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)
El extracto se disolvió en metanol ( grado HPLC) y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,45 mm (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) antes de la HPLC (ACME 9000 del sistema, Younglin, Anyang, Corea) análisis. Las fases móviles fueron 0,1% (v /v) de ácido acético en agua (A) y 0,1% (v /v) de acetonitrilo en ácido acético (B). El sistema de gradiente de disolvente fue el siguiente: 92: 8 (%, v /v) A: B durante 2 min, 90:10 (%, v /v) A: B de 27 min, 70:30 (%, v /v) a: B durante 50 minutos, disminuyó a 10% a en 51 min, 0: 100 (%, v /v) a: B durante 60 min, y finalmente 92: 8 (%, v /v) a: B en 70 min. El caudal fue de 1 ml /min. El volumen de inyección fue de 20 mL. El detector de UV se hizo funcionar a 280 nm. La separación se realizó en una columna ODS (5 m, 4,6 x 250 mm, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.).
Cultivo de células
VPH-16-positivas SiHa y CaSki células de cáncer cervical fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EE.UU.). Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA) que contiene 10% (v /v) de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS; Hyclone Laboratories). Las células fueron incubadas a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO
2/95% de aire saturado de humedad.
Ensayos de viabilidad celular
La viabilidad celular se evaluó mediante la reducción del colorante MTS ensayo, que mide la función respiratoria mitocondrial. se sembraron células de cáncer cervical (12 × 10
4 células /ml) en 100 l de medio /pocillo en placas de 96 pocillos, se incubaron durante la noche, y tratadas con varias concentraciones de CTS, como se menciona en las leyendas de las figuras, por 24 h . La viabilidad celular se calculó mediante la evaluación de metabolismo MTS como se informó anteriormente [10]. En breve, las muestras de medios de comunicación (100 mu l) fueron retirados y se incubaron con 100 l de solución de mezcla MTS-PMS durante 1 hora a 37 ° C. absorbancia óptica se midió a 492 nm usando un lector de ELISA (Apolo LB 9110, Berthold Technologies GmbH & amp; Co. KG, Bad Wilbad, Alemania) |
No se observó tinción DAPI
morfología nuclear
apoptótica. utilizando tinción DAPI. células SiHa se sembraron en portaobjetos 2 pocillos y se trataron con las concentraciones especificadas de CTS durante 24 h, después de lo cual las diapositivas 2 pocillos se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS). A continuación, las células SiHa se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con solución de tinción DAPI. Las diapositivas 2 pocillos se lavaron con PBS y se montaron en portaobjetos de microscopio con una solución de montaje. Se sembraron las células teñidas se observaron mediante microscopía de fluorescencia (Olympus, Tokio, Japón).
Anexina V y yoduro de propidio tinción
células de cáncer cervical (2,5 × 10
5 células /ml) en placas de cultivo de 60 mm y se incubaron durante la noche. Las células se trataron con CTS durante 24 h, se recogieron usando tripsina-EDTA, y se lavaron con PBS. Anexina V y tinción PI se realizaron utilizando el kit de FITC-anexina V Apoptosis Detección I (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Los datos se analizaron mediante citometría de flujo utilizando un instrumento FACSCalibur y el software CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.).
análisis del ciclo celular por citometría de flujo
El ciclo celular se analizó mediante propidio yoduro (PI) tinción y citometría de flujo. células SiHa (2,5 × 10
5 células /pocillo) se sembraron en placas de cultivo de 60 mm y se trataron con varias concentraciones de CTS para 24 h. Las células se recogieron con tripsina-EDTA y se fijaron con 80% de etanol. A continuación, las células se lavaron dos veces con PBS frío y se centrifuga, después de lo cual se descartaron los sobrenadantes resultantes. El sedimento se resuspendió y se tiñó con PBS que contenía 50 mg /ml PI y 100 mg /ml de RNasa A durante 20 min en la oscuridad. El contenido de ADN se analizó mediante citometría de flujo utilizando un instrumento FACSCalibur y el software CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.).
En tiempo real cuantitativa reacción en cadena de la polimerasa
Las células tratadas con CTS eran cosechado. El ARN se extrajo usando un fácil-BLUE
TM total RNA Extraction Kit (Intron Biotechnology, Sungnam, Corea) según las instrucciones del fabricante tal como se informó anteriormente [10]. productos de ADNc se obtuvieron utilizando M-MuLV transcriptasa inversa (New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU.). PCR en tiempo real cuantitativa se realizó con un protocolo de cuantificación relativa utilizando Roter-Gen software de la serie 6000 1.7 (QIAGEN, Venlo, Holanda) y el Kit de SensiFAST
TM SYBR NO-ROX (BIOLINE, Londres, Reino Unido). Los niveles de expresión de todos los genes diana se normalizaron a la de limpieza gen GAPDH. Cada muestra se realizó con los siguientes conjuntos de cebadores: E6, 5'-GCA GCC CTT GAA TTA CCC AT-3 '(hacia adelante), 5'-CAG AGG AGG TTG GAC GAA GAA-3' (hacia atrás); E7, 5'-TGA AGG ACA TGG CTT AGA AGT G-3 '(hacia adelante), 5'-GGT ACG AGG GTC ACA GTG TT-3' (hacia atrás); TRAIL, 5'-AAG TTT GTC GTC GTC GGG GT-3 '(hacia adelante), 5'-TGG TGC AGG GAC TTC TCT TC-3' (hacia atrás); Fas, 5'-TGA AGG ACA TGG CTT AGA AGT- 3 '(hacia adelante), 5'-GGT ACG AGG GTC ACA GTG TT-3' (hacia atrás); DR5, 5'-CAG AGG GAT CAA GGT GGT CG 3 ', 5'-TGA TGA TGC CTG ATT CTT TGT GG-3'; y GAPDH, 5'-TGG GCT ACA CTG CAG ACC AG-3 '(hacia adelante), 5'-GGG TGT TGT CGT TGA AGT CA-3' (hacia atrás).
Western blot
las células se trataron con las concentraciones especificadas de CTS durante 24 h, cosechadas, lavadas con PBS y centrifugar (1.890 ×
g
, 5 min, 4 ° C). Los sedimentos celulares resultantes se resuspendieron en tampón de lisis que contenía Tris 50 mM (pH 7,4), cloruro de sodio 1,5 M, EDTA 1 mM, 1% NP-40, 0,25% de desoxicolato de sodio, 0,1% de dodecilsulfato de sodio (SDS), y una proteasa cóctel inhibidor. Los lisados celulares se incubaron en hielo durante 1 h y se clarificaron por centrifugación a 17.010 ×
g
durante 30 min a 4 ° C. El contenido de proteína se cuantificó usando un ensayo de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) y un espectrofotómetro UV. Los lisados celulares se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS 10 a 12% (SDS-PAGE). Las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF; Millipore, Billerica, MA, EE.UU.), que fueron bloqueadas en el 5% seca no grasa de leche disuelto en solución salina amortiguadora Tris que contiene Tween-20 (2,7 M NaCl, KCl 53,65 mM, 1 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,1% de Tween-20) durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios específicos. Después del lavado, las membranas se incubaron con los anticuerpos secundarios (HRP conjugado anti-conejo o anti-IgG de ratón) para 1 h a temperatura ambiente. Después del lavado, se analizaron las manchas utilizando West-Zol Plus y un sistema de detección de transferencia Western (Intron Biotecnología, Sungnam, Corea del Sur).
Nuclear y fraccionamiento citoplasmática
Las células tratadas con CTS eran se recoge y se fracciona utilizando NE-PER nuclear y citoplasmática de extracción Reactivos (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Análisis del potencial de membrana mitocondrial (MMP)
MMP (Δψ
m) se evaluó por JC-1 tinción y citometría de flujo. células SiHa se sembraron en placas de cultivo de 60 mm (2,5 × 10
5 células /pocillo) y se trataron con varias concentraciones de CTS. Las células se recogieron con tripsina-EDTA y se transfieren a 1,5 mL tubos. Se añadió JC-1 (5 mg /ml) a las células y se mezcló hasta que se disolvió completamente, después de lo cual las células se incubaron en la oscuridad durante 10 min a 37 ° C en una incubadora. Las células se centrifugaron (300 ×
g
, 5 min, 4 ° C), se lavó dos veces con PBS, y se resuspendieron en 200 l de PBS. Las soluciones se dividen usando un instrumento FACSCalibur y se analizaron mediante el programa informático CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). El protocolo completo se realizó en un mínimo de luz.
El silenciamiento de la expresión endógena de HPV16 E6 y E7 de siRNAs
El siRNAs de E6 y E7 y revueltos siRNA fueron adquiridos de Dharmacon (Dharmacon, Lafayette, CO ). La secuencia de siRNA E6 y E7 de la secuencia de siRNA se utilizaron como se describe en el informe anterior [11]. Para suprimir la transcripción de los genes HPV16 E6 y E7 endógenos, las células SiHa fueron transitoriamente co-transfectadas con los siRNAs sintéticos para HPV16 E6 y E7 o un siRNA nontargeting usando el reactivo Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.
análisis estadístico
los datos se presentan como la media ± SEM de al menos tres experimentos independientes. La significación estadística se evaluó con la prueba t de Student. *
p Hotel & lt; 0,05 ** o
p Hotel & lt; 0,005 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
La identificación de compuestos fenólicos en CTS
Se identificaron los posibles componentes medicinales (Figura 1, Tabla 1) y un gran número de ácidos clorogénicos (Tabla 2) en el extracto CTS usando HPLC. La Tabla 2 lista los componentes en el extracto de CTS, que incluían ácido clorogénico, (+) - catequina, ácido cafeico, ácido phloretic, ácido veratric, hesperidina, quercetina, naringenina y. El extracto CTS contenía diversos ácidos fenólicos y eran ricos en ácido clorogénico (64,42 mg /g). El ácido clorogénico se ha informado que tienen propiedades anticancerígenas y antioxidantes [12-15]. Quercetina, hesperidina, y otra fenólicos ácidos tales como ácido cafeico también se ha informado que presentan efectos anti-cáncer en varios tipos de cáncer [16-18]. Sin embargo, estos compuestos estaban presentes en bajas concentraciones en el extracto CTS.
Los diecisiete tipos de la composición de ácido fenólico de la muestra se analizaron comparando el espectro de los componentes de la muestra y estándares emparejados para crear una curva estándar a partir de área del pico por componente para cuantificar la cantidad de cambio. (A) Los diecisiete tipos de los compuestos de ácido fenólico de referencia. (B)
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vástago (CTS) extracto. El análisis por HPLC mostró la presencia de ocho compuestos que corresponden a 8 entre 17 compuestos estándar. El 5, 7, 11 picos representados ácido clorogénico, ácido cafeico y ácido veratric, respectivamente.
CTS induce efectos citotóxicos en las células de cáncer de cuello uterino y queratinocitos normales
los efectos citotóxicos de CTS se evaluaron en varias líneas celulares utilizando el ensayo de MTS. líneas celulares de cáncer de cuello uterino y queratinocitos normales HaCaT se trataron con varias concentraciones y períodos de tiempo (Fig 2). Como se muestra en la figura 2B, la viabilidad de las células de cáncer de cuello uterino se redujo en una dosis y tiempo dependiente por el extracto de CTS. La viabilidad de las células CaSki HPV16-positivas se redujo en un tiempo y dependiente de la dosis de manera por el extracto de CTS, pero en un grado menor que el observado en las células SiHa HPV16-positivas. Además, CTS no tuvo ningún efecto citotóxico en concentraciones HaCaT queratinocitos normales humanos de desde 0,125 hasta 0,5 mg /ml (Fig 2A). Por lo tanto, se decidió realizar un estudio sobre la apoptosis inducida por el mecanismo subyacente por el extracto de CTS en células de cáncer cervical SiHa.
(A) HaCaT, (B) células SiHa y CaSki fueron tratados durante 24-48 h con varios concentraciones de extracto de CTS, después de lo cual se investigó la viabilidad celular usando el ensayo de MTS. Resultados de * p & lt; 0,05 y ** p & lt; 0,005 se consideraron estadísticamente significativos. Las células tratadas con CTS se compararon con las células de control.
CTS induce cambios morfológicos y la apoptosis en células SiHa
microscopía de contraste de fases mostró que la muerte celular inducida por CTS y cambios morfológicos en células SiHa de una manera dependiente de la dosis después de un tratamiento de 24 h (figura 3A). tinción DAPI se utiliza para observar la condensación nuclear, un marcador de apoptosis. condensación nuclear fue significativamente y dependiente de la dosis se incrementó en las células tratadas con CTS en comparación con la de las células control (Fig 3B y 3C). Anexina V-FITC /PI tinción se utiliza generalmente para detectar la apoptosis y la necrosis. La apoptosis se confirma además por la anexina V-FITC y PI-tinción después de un tratamiento de 24 h con CTS. Las células SiHa tratados con CTS en concentraciones de 0,125 hasta 0,5 mg /ml para 24 h mostraron un aumento significativo del porcentaje de células apoptóticas en comparación con la de las células de control, lo que indica que la apoptosis inducida CTS. Sin embargo, no hubo alteraciones en el STC trataron células HaCaT (Figura 3D).
(A) Imágenes microscópicas de células SiHa tratados con CTS durante 24 h. Las fotografías fueron tomadas por microscopía de contraste de fase a 100 × magnificación. (B) de fluorescencia imágenes microscópicas de células SiHa tratados con CTS durante 24 h. Se observaron condensación nuclear y la contracción de la cromatina. (C) Los datos sobre los núcleos apoptóticos de células teñidas con DAPI enteros se resumieron en forma de gráficos de barras. * Los resultados de
p Hotel & lt; 0,05 y **
p Hotel & lt; 0,005 se consideraron estadísticamente significativos. (D) Después del tratamiento con la concentración indicada de CTS durante 24 h, las células SiHa y HaCaT fueron teñidas con anexina V-FITC /PI.
CTS inhibe la expresión de E6 /E7 y regula la expresión de E6 /E7 de metas de factores anti-tumorales
oncoproteínas
E6 y E7 son conocidos por causar la degradación de p53 y pRb, respectivamente. Por lo tanto, se esperaría que la baja regulación de los oncogenes E6 y E7 para dar lugar a la restauración de los niveles de p53 y pRb [19-20]. VPH-16 E6 y E7 de ARNm de los niveles de expresión fueron investigados por RT-PCR cuantitativa. expresión E6 ARNm se redujo en CTS tratada células SiHa en comparación con la de las células de control no tratadas. Además, también se redujo la expresión de E7 mRNA (Fig 4A). El nivel de expresión de p-pRb se había reducido regulado, pero la expresión de pRb se mantuvo sin cambios en las células SiHa tratados con CTS (Figura 4B). CTS dependiente de la dosis aumentó el nivel de expresión de p53, lo que resulta en la modulación de los factores de aguas abajo de p21 y p27. Como se muestra en la figura 4B, los niveles de p21 y p27 de expresión se incrementaron de una manera dependiente de la dosis mediante el tratamiento CTS como se esperaba.
niveles (A) de ARNm de las oncoproteínas E6 y E7 como se detecta por qRT-PCR. análisis (B) Western blot de PRB, p-pRb, p53, p21, y p27. SiHa células fueron tratadas con la concentración indicada de CTS durante 24 h.
CTS inhibe la progresión del ciclo celular y modula los factores relacionados con el ciclo celular
Para evaluar el efecto de la CTS en el ciclo celular progresión, se examinó el estado del ciclo celular por citometría de flujo. En los experimentos anteriores, los niveles de expresión de p53 y genes aguas abajo de p21 y p27 se aumentaron después del tratamiento con CTS (Fig 4B). En comparación con las células no tratadas de control, las células tratadas con CTS mostraron una acumulación significativa y dependiente de la dosis en la sub-fase G1 (Figura 5B). Sin embargo, no hubo cambios significativos en las poblaciones de células en la fase G0 /G1, S, y G2 /M fases siguientes del tratamiento con CTS (Figura 5A).
(A) perfiles del ciclo celular de CTS tratados SiHa Células. (B) La proporción de células en la fase sub-G1. ** Los resultados de
p Hotel & lt; 0,005 se consideraron estadísticamente significativos. las células tratadas con CTS se compararon con las células no tratadas.
Los efectos de CTS son independientes de la vía intrínseca
La disfunción mitocondrial es el factor más importante en la vía de la apoptosis intrínseca. Cuando las mitocondrias membrana colapsos potenciales, el citocromo C se libera en el citosol, después de lo cual forma la apoptosome con Apaf-1 y la caspasa-9 [21]. Para medir la membrana mitocondrial potencial colapso después de un tratamiento de CTS, se realizó JC-1 tinción y análisis FACS. Como se muestra en la Figura S1 A, el pico de JC-1 no se cambió después del tratamiento CTS. Además, los análisis Western blot mostraron que el tratamiento CTS no alteró los niveles de expresión del factor pro-apoptótica Bax o los de factores anti-apoptóticas Bcl-2 y Bcl-XL. Además, el citocromo C no se libera en el citosol (Figura S1B). Por lo tanto, concluimos que la amplificación de la señal apoptótica después del tratamiento CTS es independiente de la señalización a través de la vía intrínseca de apoptosis.
apoptosis inducida por CTS está mediada por receptores de muerte señalización
Debido a que hemos demostrado que la apoptosis vía intrínseca no estaba involucrado en la apoptosis inducida por CTS, nos centramos en la siguiente vía de la apoptosis extrínseca. La vía de la apoptosis extrínseca recibe señales a través de la unión de las proteínas extracelulares de ligandos de muerte a los receptores pro-apoptóticos de muerte (DR) [22]. La vía extrínseca transmite señales de ligandos extracelulares a través de DRs proapoptóticos a la maquinaria apoptótica caspasa [23]. Además, poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) está implicado en la apoptosis, así como un número de otros procesos celulares. Se investigaron los niveles de expresión de los factores relacionados con la vía extrínseca-TRAIL, DR5, y Fas en células SiHa después del tratamiento CTS (Figura 6A). Nuestros resultados demostraron que el tratamiento CTS regula por incremento los niveles de ARNm de TRAIL, DR5, y Fas. los niveles de expresión de la proteína de la caspasa-3, caspasa-8, PARP, y Bid, se escindieron de una manera dependiente de la dosis por CTS (Fig 6B). Además, se identificaron las caspasas específicas implicadas en el mecanismo de pro-apoptótica de CTS. células SiHa fueron pretratados con inhibidores de caspasas, incluyendo un inhibidor de la caspasa general y un inhibidor de la caspasa-8. Como se muestra en la figura 6C, el pretratamiento con el inhibidor general de caspasas Z-VAD-FMK antes de CTS tratamiento bloqueó significativamente la apoptosis inducida por CTS. Un efecto inhibitorio similar en la apoptosis inducida por CTS fue producido por la caspasa-8 inhibidor Z-IETD-FMK. Estos resultados muestran que la caspasa-3, caspasa-8, y PARP se activa a través de la señalización mediada por DR durante la apoptosis inducida por CTS.
niveles (A) de ARNm de TRAIL, DR5 y Fas como se detecta por qRT-PCR . (B) Análisis de transferencia Western de los factores relacionados con la vía-extrínsecos. células SiHa se trataron con la concentración indicada de CTS durante 24 h. (C) Análisis de transferencia Western de los efectos de CTS tras el tratamiento previo con inhibidor general de caspasas Z-VAD-FMK o inhibidor de la caspasa-8 Z-IETD-FMK en las células SiHa.
El descenso de regulación de E6 y genes E7 mejorada CTS apoptosis inducida
Para investigar si la apoptosis inducida por CTS se vería afectada por los niveles de E6 /E7, E6 /E7 siRNA se transfectó y se trató con CTS. proteínas de apoptosis de activación tal como la caspasa-3, caspasa-8, y PARP fueron más escinden bajo E6 /E7 siRNA transfección y tratamiento CTS (Fig 7). nivel de expresión de p-pRb se redujo en E6 /E7 siRNA transfectaron células SiHa en comparación con las células control transfectadas siRNA. Sin embargo, el nivel de expresión de p53 no fue alterada (Fig 7). Estos resultados muestran que el CTS podría apoyar la inducción de la apoptosis a través de la baja regulación de expresiones E6 /E7 mRNA.
Western blot de los factores relacionados con la apoptosis después de la transfección de ARNsi de control o E6 /E7 siRNA dirigidos.
Discusión
el principal objetivo de nuestro estudio era confirmar la eficacia anti-cáncer y mecanismos asociados de CTS en las células de cáncer cervical humano. extracto de CTS inhibe la proliferación de células de cáncer de cuello uterino en las células SiHa y CaSki VPH positivas. La eficacia citotóxica de CTS en las células SiHa HPV-16-positivas fue ligeramente mejor que su eficacia en las células CaSki (Fig 2). Este efecto podría ser debido al hecho de que el número de copias del genoma de HPV en las células CaSki es más alta que la de las células SiHa [24]. Este hallazgo sugiere que el número total de copias de HPV en las células puede haber influido en su susceptibilidad a los efectos pro-apoptóticos de CTS [24]. Además, hemos demostrado que CTS reguladas por los niveles de expresión de los oncogenes E6 y E7 en líneas de células VPH-16-positivas. Como era de esperar sobre la base de la disminución del nivel de expresión de E6, se confirmó que la expresión de p53 se incrementó en forma dependiente de la dosis. Curiosamente, disminuyó la expresión de E7 no se asoció con la expresión alterada pRb; sin embargo, p-pRb se redujo de una manera dependiente de la dosis por CTS (Fig 4B). Este resultado recordó informes anteriores que demuestran que la inhibición de E7 dieron lugar a la fosforilación reducida de pRb sin cambiar la expresión de proteína pRb general [20].
Extracto
CTS contiene varios compuestos fenólicos (Fig 1). El ácido clorogénico está presente en la concentración más alta entre ellos. El ácido clorogénico se ha informado que tienen el cáncer, antioxidante, y efectos antidiabéticos [14, 25-26]. Además, el ácido clorogénico es el segundo mayor componente bioactivo en el café después de la cafeína [25]. El ácido clorogénico estimula el transporte de glucosa en el músculo esquelético L6 a través de la activación de AMPK, que contribuye a los efectos beneficiosos para la diabetes [25]. Además, el ácido clorogénico es un antioxidante que puede retardar la liberación de glucosa en el torrente sanguíneo después de una comida [26]. Además, el ácido clorogénico puede inducir daño en el DNA celular y apoptosis en células de cáncer de pulmón sin afectar a los fibroblastos pulmonares normales [14]. Sin embargo, los efectos anticancerígenos de ácido clorogénico en células de cáncer de cuello uterino no se han investigado exhaustivamente. ácidos cafeico se encuentran en muchas plantas naturales [27] y se ha demostrado para suprimir el crecimiento de tumores mediante la inhibición de proliferación de células tumorales y la mejora de la actividad antioxidante [28]. Un estudio previo mostró que los ácidos cafeico inhibió la proliferación, adhesión y migración por A549 células de cáncer de pulmón humano y células de cáncer de colon HT29-D4 [29]. Además, se ha informado de la hesperidina, naringenina y la quercetina para exhibir efectos contra el cáncer en varios tipos de células de cáncer [16-17, 30-31].
La apoptosis está mediada por las vías intrínseca y extrínseca. La vía intrínseca está mediada por la permeabilización mitocondrial membrana externa (MOMP) y la liberación de citocromo c de la mitocondria en el citoplasma [32-33]. En el citosol, el citocromo c induce montaje del apoptosoma, que contiene la proteína adaptadora Apaf-1 y proteasa apoptosis de iniciación de la caspasa-9. La formación del apoptosoma activa la caspasa-9, que activa las caspasas efectoras [34]. La vía extrínseca recibe señales a través de la unión de ligandos de proteínas extracelulares de DR proapoptóticos situados en la superficie de la célula [23]. Aunque se han descrito varios proyectos de resolución, nos centramos en Fas (CD95) y DR5 y sus respectivos ligandos tales como ligando de Fas (Fas L) y TRAIL [35]. DRs tienen un dominio de muerte intracelular que recluta proteínas adaptadoras y la caspasa-8 [36]. La unión del ligando de muerte a la República Dominicana como resultado la formación de la induce a la muerte complejo de señalización (DISC), compuesto por el receptor de muerte, FADD y la caspasa-8 [37]. El DISCO activa una cascada de señalización aguas abajo que resulta en apoptosis [38-40]. Se investigaron las vías que están involucrados en la apoptosis inducida por CTS en células de cáncer de cuello uterino SiHa. Aunque los factores intrínsecos relacionados con la vía, no se vieron afectados por el tratamiento de CTS (S1 figura), los niveles de expresión de los factores relacionados con las vías-extrínsecos tales como Fas, DR5, TRAIL, y la caspasa-8, se vieron afectados por el tratamiento de CTS (Figura 6).
Nuestros resultados muestran que CTS tiene un efecto anti-cáncer profunda contra células de cáncer cervical. Esta es la primera demostración de la capacidad de CTS para inhibir la expresión de HPV-16 E6 y E7 oncogenes, y para inducir la apoptosis mediada por la vía extrínseca en células de cáncer de cuello uterino. Sin embargo, otros estudios se deben identificar los compuestos específicos en CTS responsables de sus efectos contra el cáncer.
Apoyo a la Información
S1 Fig. Efectos de la CTS en el potencial de membrana mitocondrial y la liberación del citocromo C en las células del cáncer de cuello de útero. SiHa gratis (A) La diferencia de colores JC-1 se analizó mediante citometría de flujo. JC-1 agregados (naranja) son una característica de las células sanas, mientras que JC-1 monómeros (verde) son una característica de las células apoptóticas. (B) Análisis de transferencia Western de los factores anti-apoptóticas Bcl-2 y Bcl-xL, el factor pro-apoptótica Bax y citocromo C en células de cáncer cervical SiHa. SiHa células fueron tratadas con la concentración indicada de CTS durante 24 h
doi:. 10.1371 /journal.pone.0150235.s001 gratis (TIF)
Reconocimientos
Esta investigación fue apoyado por el programa básico (2015R1A2A2A09001137) de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF). (Http://www.nrf.re.kr/nrf_eng_cms). D. Y. Yoon fue apoyado en parte por el Programa de Centros de Investigación Prioritaria (2012-0006686).