Extracto
La expresión de la proteína G-receptor acoplado inflamatoria CysLT
1R ha demostrado ser aumentada en pacientes con cáncer de colon y se asocia con un mal pronóstico. El presente estudio investigó la correlación entre CysLT
1R y el desarrollo del cáncer de colon
in vivo usando
CysLT
1R antagonistas (ZM198,615 o Montelukast) y el modelo de xenoinjerto en ratones desnudos. Se establecieron dos regímenes de administración de medicamentos. El primer régimen fue establecido para investigar la importancia de CysLT
1R en la iniciación del tumor. Los ratones desnudos se inocularon con 50 mM CysLT
HCT-116 células de cáncer de colon antagonistas pretratados 1R y recibieron tratamiento continuo (5 mg /kg /día, por vía intraperitoneal). El segundo régimen tenía como objetivo abordar el papel de CysLT
1R en la progresión tumoral. Los ratones desnudos fueron inoculados con células no tratadas previamente HCT-116 y no recibieron CysLT
tratamiento con antagonistas 1R, hasta la aparición del tumor grabable. Ambos regímenes resultaron en el tamaño del tumor reducido significativamente, atribuido a cambios en la proliferación y la apoptosis según se determina mediante la reducción de los niveles de Ki-67 y los niveles de p21
WAF /Cip1 (
P
& lt; 0,01) mayor, la caspasa escindido 3, y el producto de la caspasa-escindido de citoqueratina 18. la disminución de los niveles de VEGF (
P Hotel & lt; 0,01) y redujo el tamaño del barco (
P Hotel & lt; 0,05), también se observaron, este último sólo en el grupo ZM198,615-tratamiento previo. Por otra parte, hemos realizado una serie de
in vitro
estudios que utilizan la línea celular de cáncer de colon HCT-116 y CysLT
1R antagonistas. Además de las reducciones significativas en la proliferación celular, la adhesión y la formación de colonias, se observó la inducción de la detención del ciclo celular y la apoptosis de una manera dependiente de la dosis. La capacidad de Montelukast para inhibir el crecimiento de xenoinjerto de cáncer de colon humano fue validado mediante el uso de dos líneas adicionales de células de cáncer de colon, SW-480 y HT-29. Nuestros resultados demuestran que CysLT
antagonistas 1R inhiben el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de colon principalmente mediante la reducción de la proliferación y la inducción de la apoptosis de las células tumorales
Visto:. Savari S, Liu M, Zhang Y, Sime W, Sjölander A (2013) CysLT
1R Antagonistas de inhibición de crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de cáncer de colon. PLoS ONE 8 (9): e73466. doi: 10.1371 /journal.pone.0073466
Editor: Lishan Su, Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, Estados Unidos de América
Recibido: 1 Noviembre 2012; Aceptado: July 22, 2013; Publicado: 5 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Savari et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado por becas para AS de la Fundación de cáncer de Suecia (CAN 2009/1185, 10 0478), el Consejo Sueco de Investigación médica (X-10356), la Fundación de cáncer de Gunnar Nilsson (www.cancerstiftelsen.com), la Fundación Österlund, la Fundación en el hospital de la Universidad de Skåne, y por la Real Sociedad WS fisiográfica en Lund (www.fysiografen.se). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los eicosanoides incluyen una amplia variedad de metabolitos de lípidos bioactivos derivados de ácidos grasos esenciales de 20 carbonos poliinsaturados. El ácido araquidónico pertenece a la familia omega-6 y es el precursor de los eicosanoides tales como prostanoides, los leucotrienos, hidroxilo eicosatetraenoicos ácidos (HETE), y epóxidos. Estos eicosanoides son considerados pro-inflamatoria; epidemiología, y de los estudios de laboratorio clínicos han establecido que el metabolismo aberrante del ácido araquidónico a través de la ciclooxigenasa (COX) y la lipooxigenasa (LOX) itinerarios, que generan prostanoides y leucotrienos, respectivamente, pueden promover la inflamación crónica y la carcinogénesis [1], [2 ]. El leucotrieno inestable A
4 (LTA
4) está formado por 5-LOX en presencia de proteína de 5-lipoxigenasa de activación (FLAP). LTA
4 se metaboliza a cualquiera de LTB
4 o los cisteinil leucotrienos, LTC
4, LTD
4, y LTE
4 [3].
Leucotrienos
Los cisteinil están implicados en los procesos de las vías respiratorias, tales como la secreción de moco, aumento de la permeabilidad vascular, la quimiotaxis de eosinófilos, y la broncoconstricción [4], [5], [6], [7]. Los cisteinil leucotrienos también están implicados en enfermedades inflamatorias crónicas, tales como artritis reumatoide, asma, y enfermedades inflamatorias del intestino (EII) [8], [9], [10]. El medio inflamatorio ha sido ampliamente apreciado como una de las características que permiten de cáncer [11]. Por consiguiente, existe una fuerte correlación entre larga data IBD, tales como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, en el que los eicosanoides pro-inflamatorias (es decir, derivados del ácido araquidónico) son abundantes y colorrectal cáncer [12], [13]. El cáncer colorrectal es el tercer cáncer más comúnmente diagnosticado en el mundo y tiene la tasa de mortalidad más alta cuarta [14]. Se estima que los pacientes que sufren de EII tienen un aproximadamente 30 veces más riesgo de desarrollar cáncer colorrectal [15]. Otros eicosanoides derivados de la vía araquidónico que están implicados en el cáncer de colon incluyen los prostanoides. La prostaglandina E
2 (PGE
2) se deriva del ácido araquidónico a través de la vía de la COX y es el prostanoide más abundante y más ampliamente estudiado en el cáncer, especialmente el cáncer de colon. PGE
2 se ha demostrado que aumenta la carga tumoral en los intestinos de ambos APC
Min /+ y ratones azoximetano inducida [2]. LOX-5 y la COX-2, las enzimas responsables de la producción de cisteinil leucotrienos y PGE
2, respectivamente, también han sido implicados en el cáncer de colon. Su aumento de la expresión se ha documentado en los pacientes con adenocarcinomas de colon [16].
Leucotrienos
cisteinilo median sus efectos a través de receptores acoplados a proteína G (GPCRs) y se conocen como CysLT
1R y CysLT
2R, en función de su caracterización farmacológica y funcional de perfiles en respuesta a una serie de agonistas o antagonistas en diferentes sistemas celulares y de tejido [17]. CysLT
1R tiene una mayor afinidad por LTD
4, el cisteinil leucotrieno más potente, mientras que CysLT
2R tiene una afinidad más baja pero iguales para ambos LTD
4 y LTC
4 [18] , [19]. ZM198,615 y Montelukast son CysLT
antagonistas 1R selectivos utilizados en los estudios de enfermedades inflamatorias tales como la artritis reumatoide y el asma [20], [21]. Este último CysLT
1R antagonista también se utiliza en la clínica para el tratamiento de pacientes asmáticos [22].
El equilibrio entre el CysLT
1 y CysLT
2 receptor parece ser importante en la etiología de la enfermedad de cáncer de colon. De hecho, hemos demostrado que estos dos receptores se co-localizados y forman dos heteroátomos y homodímeros en la línea celular epitelial intestinal humana Int 407 y que LTC
4 estimulación de CysLT
2R regula negativamente la expresión de superficie celular de CysLT
1R [23]. Nuestros estudios previos han demostrado también que LTD
4, a través de CysLT
1R induce la regulación al alza de las proteínas asociadas con el cáncer de colon, tales como COX-2, β-catenina, y Bcl-2 en las células epiteliales intestinales [24] . Además, hemos demostrado que CysLT
1R está aumentada en pacientes con cáncer de colon y se asocia con un mal pronóstico [16], mientras que la baja expresión concomitante de CysLT
1R y alta expresión de CysLT
2R median buena pronóstico [25]. Por otra parte, nuestro trabajo previo ha demostrado que
4 inducida por LTD CysLT
1R señalización resultados en la proliferación celular, la supervivencia y la migración [26], [27]. Por el contrario, LTC
4 estimulación de CysLT
2R se ha demostrado que induce la diferenciación de células de cáncer de colon, y la reducción de expresión de CysLT
2R se asocia con un mal pronóstico de los pacientes [28].
en el presente estudio, se investigó la función de CysLT
1R en el crecimiento del cáncer de colon usando CysLT
1R antagonistas. Se estudiaron los efectos de los antagonistas de CysLT
1R en 116 HCT-células de cáncer de colon humano, tanto
in vitro
y
in vivo
utilizando el modelo de xenoinjerto en ratones desnudos.
materiales y Métodos
Reactivos
el CysLT
1R antagonista ZM198,615 (ICI-198615) fue un regalo de AstraZeneca y la CysLT
1R antagonista montelukast se adquirió de Cayman Chemicals Co (Ann Arbor, MI). reactivo de proliferación celular WST-1 y el anticuerpo monoclonal de ratón M30 CytoDeath (01:10) eran de Roche (Basilea, Suiza). El Kit de Anexina V-PE de detección de apoptosis fue de BD Pharmingen (San Diego, CA). El colorante reactivo de inicio rápido ™ Bradford, Mini-Protean TGX ™ geles, los anticuerpos de rábano picante conjugada secundaria, y el reactivo de detección quimioluminiscente eran de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). monoclonal de conejo troceados anticuerpo caspasa 3 anti-humana (1:200) se adquirió de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). El anticuerpo monoclonal de conejo anti-humano Ki67 (1:500) se obtuvo de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). PECAM-1 (CD31) anticuerpo policlonal de cabra anti-ratón (1:700) y el anticuerpo VEGF anti-humano policlonal de conejo (1:200) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Ratón monoclonal anti-p21 humano
anticuerpo WAF1 /Cip1 (1:1200) era de DakoCytomation (Glostrup, Dinamarca). policlonal de conejo anti-humano CysLT
anticuerpo 1R (1:250) se obtuvo de Innovagen (Lund, Suecia). Ratón anticuerpo anti-β-actina monoclonal fue de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). El kit de cisteinil leucotrieno EIA se adquirió de Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI). Todos los demás productos químicos eran de grado analítico y se obtuvieron de Chemicon International (Temecula, CA) o Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).
Cultivo celular
células HCT-116 ( ATCC
® No. CCL-247), derivada de carcinoma de colon humano, SW-480 (ATCC
® No. CCL-228) y HT-29 (ATCC
® Nº HTB-38), derivada de adenocarcinoma de colon humano, se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA).
HCT-116 y HT-29 células se cultivaron en medio 5A de McCoy, mientras que las células SW-480 se cultivaron en RPMI 1640. Todos los medios se complementaron con 10% de suero bovino fetal (FBS) 55 mg /ml de estreptomicina, 55 UI /ml de penicilina, y 1,5 mg /ml de Fungizone. Las células fueron cultivadas durante 5 días a 70
-
80
%
confluencia a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2. Todos los experimentos se realizaron con células en pasajes de 5 a 30, y las células fueron probados con regularidad para asegurar la ausencia de contaminación por micoplasma.
xenoinjertos de tumores Estudios
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Regional de Ética Comité de Investigación Animal de la Universidad de Lund, Suecia (M205-10). 6 a 8 semanas de edad, los ratones desnudos atímicos hembra (BalbC nu /nu) fueron adquiridos de Taconic Europa A /S (Ry, Dinamarca). Para inducir subcutáneos xenoinjertos de cáncer de colon humano, 2,5 × 10
6 bajo paso células HCT-116 en 100 l de PBS se inyectaron en dos flancos por ratón (n = 7 ratones /grupo). Se establecieron dos regímenes de administración de medicamentos para investigar la importancia funcional de CysLT
antagonistas 1R en la iniciación y progresión tumoral. Los animales tratados de acuerdo con el primer régimen se inocularon con células HCT-116 pretratadas con DMSO (DMSO I), 50 mM ZM198,615 (Pre-ZM), o 50 mM Montelukast (Pre-Montelukast), por 30 min. La viabilidad celular se determinó por el ensayo de exclusión del colorante azul de tripano y sólo se consideraron células viables para la inyección subcutánea. A partir de entonces, desde el día de la inoculación, los ratones recibieron i.p. inyecciones con DMSO o CysLT
1R antagonistas (5 mg /kg) disuelto en DMSO, se diluyó en PBS para un volumen total de 100 l (Figura 1A). De acuerdo con el segundo régimen, los animales fueron inoculados con células HCT-116 no tratados previamente. Una vez que se establecieron tumores palpables 6 días después de la inyección, los ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos y luego se decidió a qué grupo debe ser tratado con DMSO (DMSO II), ZM198,615, o Montelukast. El i.p. diaria ratones recibieron inyecciones de DMSO o el CysLT
1R antagonistas (5 mg /kg) (Figura 1E)
(A) Protocolo experimental para los grupos de tratamiento previo.; ratones BalbC (nu /nu) se inyectaron por vía subcutánea en dos flancos con las células HCT-116 tratadas previamente con ZM198,615 o Montelukast (50 mM), y recibieron tratamiento por vía intraperitoneal desde el día de la inoculación con DMSO, ZM 198.615, o Montelukast (5 mg /kg /día). (B) la incidencia de tumores de ratones tratados con DMSO (DMSO grupo I), ZM198,615 (grupo Pre-ZM), o Montelukast (grupo Pre-Montelukast) y el peso del tumor (C) en comparación con el grupo de DMSO I al final de el experimento (día 21). (D) Imágenes representativas del tumor del grupo de tratamiento previo. (E) Protocolo experimental para el estudio de tratamiento; no pretratados HCT-116 células se inyectaron por vía subcutánea en dos flancos de ratones desnudos. DMSO (DMSO grupo II), ZM198,615 (grupo ZM), o Montelukast (grupo de montelukast) el tratamiento se inició el día 6 después de la inoculación de las células tumorales. Los volúmenes tumorales (F) durante un período de 21 días y el peso del tumor (G) al final del experimento (día 21). (H) imágenes representativas del tumor del grupo de tratamiento. Los datos cuantitativos se muestran son la media ± SEM. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P Hotel & lt; 0,001. El análisis del volumen del tumor se realizó mediante ANOVA de dos vías y el peso del tumor El análisis se realizó por el estudiante de
t
prueba.
Además, SW-480 o células HT-29, 2,5 x 10
6 células de bajo pasaje en 100 l de PBS se inyectaron en dos flancos por ratón (n = 12 y n = 18 ratones para SW-480 y HT-29, respectivamente) para inducir subcutáneos xenoinjertos de cáncer de colon humano en hembra 6 -to ratones desnudos atímicos de 8 semanas de edad (BalbC nu /nu). Todos los ratones habían establecido tumores palpables en ambos flancos en el día 7 y fueron asignados al azar en dos grupos para cada línea celular. Antes de iniciar los tratamientos, un investigador medir los tamaños de los tumores de todos los tumores para asegurar que no había ninguna diferencia de tamaño entre los diferentes grupos. Los ratones a continuación, recibimos inyecciones diarias IP durante 14 días, ya sea con DMSO o Montelukast (5 mg /kg) (= 6 y n = 9 ratones por grupo de tratamiento para SW-480 y HT-29, respectivamente).
ratón peso corporal y el tamaño tumoral se registraron cada tercer día. La fórmula para calcular el volumen del tumor fue
V = π
/6 × 1,58 (
longitud x anchura
)
3/2 [29]. Después de 21 días, todos los ratones se sacrificaron, y los tumores se retiraron, miden, se pesan, y se fotografiaron. Los tejidos tumorales se fijaron en formalina al 10% tamponada, se embebieron en parafina para el análisis de inmunohistoquímica y /o se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C para análisis de transferencia Western.
La dosis de Montelukast (5 mg /kg) fue elegido sobre la base de los datos publicados, en dosis que oscilan desde 5 hasta 10 mg /kg han sido reportados en una amplia gama de ratones modelos experimentales [30], [31], [32]. Las dosis de 2 mg /kg y 10 mg /kg también se investigaron y los resultados revelan tendencias similares en la inhibición del crecimiento tumoral de xenoinjertos (datos no mostrados).
Inmunohistoquímica
secciones embebidas en parafina obtenida de los tumores xenoinjertados se seccionaron (5 micras) para la tinción inmunohistoquímica. Todos los procedimientos se realizaron utilizando una tinción de portaobjetos automática Dako de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los portaobjetos se fotografiaron con un microscopio Nikon Eclipse 800 y se evaluaron de una manera ciega por dos observadores de forma independiente. Enteras Ki-67 secciones teñidas fueron escaneados con Aperio ScanScope CS (Aperio Technologies, Inc, Vista, CA) y un área en la que la tinción fue particularmente prevalente (es decir, punto caliente) se identificó en cada tumor usando un campo de baja potencia (× 40). 3 campo de gran aumento (x400) fueron seleccionados para el análisis de imágenes en cada punto caliente. El uso de software NIS-Elements un umbral se fijó para definir y medir la relación de Ki-67 zona manchada positiva a la superficie total del campo de alta potencia. Estimación de células apoptóticas se realizó por detección del producto de la caspasa-escindido de citoqueratina 18 con CytoDeath (M30). Dependiendo del tamaño del tumor, 5-10 campos al azar fueron elegidos, y se midió el número de células apoptóticas promedio por campo (× 200). Anticuerpo dirigido contra CD31 se utilizó para cuantificar la densidad de microvasos (MVD). Imágenes (× 100) se tomaron de tres zonas con la aparición más alta densidad de los microvasos (es decir, puntos calientes) y el valor medio de los recuentos de CD31-positivo calculado. Para estimar el área de estructuras CD31-positivo (área del vaso), las imágenes se guardan como archivos TIFF. La tinción positiva se cuantificó utilizando la función de umbral de Adobe Photoshop y se combina con análisis de histograma. Se registró el número medio de píxeles positivos por sección tumor a partir de tres puntos calientes.
Western Blot
Para la caspasa 3 escindida y CysLT
analiza 1R, las células se cultivaron durante 5 días a 70% de confluencia. Sólo HCT-116 adherentes, SW-480 y las células HT-29 se recogieron para CysLT
analiza 1R. Para el análisis de la caspasa 3 escindida Se utilizó tanto las células adherentes y flotantes HCT-116. Los lisados celulares se prepararon y se solubilizaron en tampón de muestra como se describe anteriormente [26]. La extracción de proteínas a partir de tejido del tumor xenoinjertado se realizó por sonicación. En resumen, los tejidos tumorales en 700 l de tampón reducción de hielo frío de carga (Tris 62,5 mM, pH 6,8, 6 M urea, 10% de glicerol, y 2% de SDS) que contiene inhibidores de proteasa (2 Na mM
3Vo
4, 4 mg /ml de leupeptina, y 60 mg /ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo) se sometieron a sonicación en hielo durante 30 seg. lisados de células enteras fueron centrifugadas a 3400 ×
g
durante 15 min a 4 ° C. azul de bromofenol (0,003%) y mercaptoetanol (5%) se añadieron a los sobrenadantes de la muestra. Las proteínas se separaron por electroforesis en prefabricado cualquier kD ™ geles de SDS-poliacrilamida y se electrotransfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con 5% de leche en polvo sin grasa o 5% de BSA en 0,05% de Tween /PBS durante 1 h a temperatura ambiente y después se incubó con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C. Por último, las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario apropiado conjugado con peroxidasa de rábano durante 1 h a temperatura ambiente y se detecta con un reactivo de quimioluminiscencia. resultados de inmunotransferencia se visualizaron con el sistema de XRS Molecular Imager ChemiDoc y software Lab Image (Bio-Rad Laboratories).
Ensayo de proliferación de
La proliferación celular se midió usando el ensayo de WST-1 la proliferación celular de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se sembraron por triplicado en placas de 96 pocillos de fondo plano a 1.500 células /pocillo y se cultivaron durante 24 h en medio que contiene 2% de FBS. Posteriormente, las células se trataron con CysLT
antagonistas 1R para diferentes puntos de tiempo. Después de la incubación con 10 l de reactivo WST-1 de 90 min, la absorción de las muestras se midió a 440 nm usando el lector de placas Tecan Infinito M200.
Citometría de Flujo
ciclo celular y la célula mediciones de muerte fueron evaluados con citometría de flujo. Brevemente, HCT-116 células se privaron de suero durante la noche y se trató con CysLT
1R antagonistas en medio fresco que contiene 2% de FBS. Después de 24 h, se recogieron las células adherentes y flotantes y se lavaron con PBS. Para los perfiles del ciclo celular, las células se fijaron inmediatamente en 70% (v /v) de etanol, se trató con citrato de sodio 0,1% y 100 mg /ml de RNasa A, y se incubaron durante 30 min a 37 ° C con 50 mg /ml de yoduro de propidio. La inducción de la apoptosis se determinó en células viables usando el kit de detección de Anexina V-PE Apoptosis según el protocolo del fabricante. Todas las mediciones de citometría de flujo se realizaron con el flujo FACS Calibur citómetro (Becton Dickinson, San Jose, CA), y el análisis se realizaron con FCS Express, versión 4.0 (Software De Novo).
Ensayo de adhesión
HCT-116 células se suspendieron en medio que contiene 2% de FBS a una densidad de 2,0 × 10
5 células /ml y tratados con o sin CysLT
1R antagonistas para 30 min a 37 ° C antes de chapado en plana -bottomed placas de 12 pocillos (Corning, 1 ml /pocillo). Las células se incubaron a 37 ° C en 5% de CO
2 para 1 h, seguido por tres lavados con PBS para eliminar las células no unidas. Después de la fijación en 4% de formaldehído durante 15 min, las células se lavaron dos veces con PBS y se tiñeron con violeta cristal (5 mg /ml en 2% de etanol) durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las células se lavaron extensamente, y la tinción fue lanzado usando 2% de SDS en PBS. La intensidad de la tinción se cuantificó por espectrofotometría a 550 nm usando el lector de placas Tecan Infinito M200.
Soft Agar Ensayo
células HCT-116 se cultivaron en medio que contenía 2% de FBS con o sin CysLT
1R antagonistas. Brevemente, se añadió 1 ml de 0,5% de agar bien (capa inferior) /a placas de 6 pocillos y se dejó solidificar durante por lo menos 1 h a temperatura ambiente. A continuación, 1,0 × 10
4 células se suspendieron en 1 ml de medio con 0,35% de agarosa (capa superior). Diferentes dosis de CysLT
1R antagonistas se añadieron a la agarosa (la capa superior) y agar (la capa inferior) antes de que se colocaron en los pocillos. An 2 ml adicionales de medio de cultivo que contiene el CysLT
1R antagonistas se colocaron por encima de la capa superior. El medio se sustituyó cada 3 días con o sin la adición de CysLT
antagonistas 1R. Después de 14 días de incubación a 37 ° C, las colonias se visualizaron por tinción con 0,005% de cristal violeta. Las imágenes fueron adquiridas mediante el ChemiDoc ™ + Sistema XRS y las colonias se contaron utilizando el software ImageJ.
cisteinil leucotrieno Enzyme Immunoassay
Las células se cultivaron durante 5 días a 70-80% de confluencia. Al día 4 se cambió el medio y se recoge en el día 5 para la separación de cisteinil leucotrienos por extracción en fase sólida Sep-Pak Vac RC (C18-500 mg) cartuchos de Water Corporation (Milford, MA). la producción de cisteinil leucotrienos se midió con un inmunoensayo enzimático de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron en Prism Software (GraphPad, Inc.), y la significación estadística de los datos fue determinado como
P Hotel & lt; 0,05. Para la comparación entre los dos grupos, ya sea un apareado o desapareado
t
prueba (
t de Student
) se utilizó. Unidireccional o bidireccional ANOVA se utilizó para comparar varios grupos. Todos los valores se expresan como la media ± error estándar de la media (SEM).
Resultados
CysLT
1R Antagonistas Disminuir xenoinjerto crecimiento tumoral
Una de xenoinjertos de cáncer de colon modelo fue empleado para investigar los efectos de CysLT
antagonistas 1R en el crecimiento del cáncer de
in vivo
. Para examinar los efectos de CysLT
1R antagonistas sobre la iniciación del tumor, se inocularon ratones desnudos con células HCT-116 pretratadas con antagonistas CysLT
1R. El tratamiento se inició de inmediato, ya sea con o ZM198,615 Montelukast (5 mg /kg /día) en el día de la inoculación. Los ratones se sacrificaron el día 21, antes de volúmenes de los tumores alcanzaron 1 cm
3, de acuerdo con el permiso ético (Figura 1A). Como se muestra en la Figura 1B, la aparición de tumores se retrasó significativamente en el grupo Pre-ZM (4 tumores) en comparación con el grupo de DMSO I (12 tumores) en el día 6. Además, Montelukast pretratamiento inhibió completamente HCT-116 de generación de tumor. El peso medio del tumor se redujo significativamente en el grupo Pre-ZM comparación con el grupo DMSO I (0.165 ± 0.048 g
vs
0,372 ± 0,082 g;. Figura 1C).
Además, hemos examinado los efectos de CysLT
antagonistas 1R en la progresión tumoral mediante la inoculación de ratones desnudos con células no tratadas previamente HCT-116. Después de la iniciación del tumor grabable (el día 6), CysLT
tratamientos antagonistas 1R se llevaron a cabo durante 2 semanas (Figura 1E). En el día 21, el tamaño medio de tumor de los grupos ZM198,615 y Montelukast fue significativamente menor que los tumores en el grupo de DMSO II (490,1 ± 66,21 mm
3 y 336,9 ± 55,38 mm
3
vs.
711,6 ± 82,6 mm
3
P Hotel & lt; 0,05 o
P Hotel & lt; 0,001, respectivamente) (Figura 1F). Del mismo modo, el peso medio de los tumores en los grupos ZM198,615 y Montelukast frente al grupo DMSO II se redujo significativamente (Figura 1G;. 0,31 ± 0,037 g y 0,22 ± 0,036 g
vs
0.424 ± 0.038 g, respectivamente,
P Hotel & lt; 0,05). Figura 1D y H son imágenes representativas del tumor tomadas de cada grupo. En conclusión, estos resultados apoyan la hipótesis de que CysLT
1R es importante para el crecimiento del cáncer de colon.
CysLT
1R Antagonistas de reducir la proliferación e inducir la apoptosis
A continuación se investigó los mecanismos subyacentes por el cual CysLT
1R antagonistas ejercían sus efectos inhibidores sobre el crecimiento del tumor. secciones de tumores HCT-116 se tiñeron con el marcador de proliferación Ki-67 o el marcador de apoptosis M30 CytoDeath. La más frecuente Ki-67 zona manchada fue seleccionado para cada tumor de xenotrasplante y tres imágenes de campos de alta potencia dentro de esta área se analizaron adicionalmente. El nivel de Ki-67 en estas áreas seleccionadas se redujo moderadamente en el grupo Pre-ZM (Pre-ZM
vs
DMSO grupo I;. Figura 2 A y B) y estadísticamente significativa (
P & lt;
0,05) disminuyó en los grupos de tratamiento (ZM198,615
vs
DMSO grupo II;. Figura 2C y D). el número de células apoptóticas aumentó ligeramente en los tumores del grupo Pre-ZM (Pre-ZM
vs
DMSO grupo I;. Figura 2E y F) y los grupos de tratamiento (ZM198,615 o Montelukast
vs
DMSO grupo II;. Figura 2G y H)
(A y C) imágenes representativas de Ki-67-manchadas de secciones de parafina de los tumores de xenoinjertos (× 400). (B y D) Una Ki-67-manchado punto caliente se seleccionan de cada tumor y 3 áreas separadas dentro de estos puntos calientes se analizaron en el campo de alta potencia (x 400). Ki-67 fracción área positiva se determinó como proporción de área manchada por el área de campo de alta potencia. (E y G) representativos M30 imágenes CytoDeath-manchadas de secciones de parafina de los tumores de xenoinjertos (× 200). blanco y negro flechas indican las células teñidas positivamente. regiones encajonados dentro de los paneles principales muestra las células teñidas positivamente indicadas por las flechas blancas a mayor aumento (x400). (F y H) el número de células apoptóticas por campo promedio se determinó mediante recuentos positivos M30- (flechas negras) en secciones de tumor de xenoinjerto-mediana de tamaño tomados de la parte media. Los datos cuantitativos se muestran son la media ± SEM. *
P
. & Lt; 0,05 por
t de Student
Los efectos de la CysLT antagonistas
1R en la vascularización del tumor se estudiaron mediante tinción para CD31 , un antígeno específico de células endoteliales. Se ha observado una ligera disminución en el número buque en las secciones tomadas del grupo Pre-ZM comparación con el grupo DMSO I (46,1 ± 6,7
vs
56,0 ± 7,9;. Figura 3A y B). número Vascular no es el único parámetro para indicar el suministro de sangre del tumor adecuada; área del vaso también es un determinante crítico de flujo de sangre del tumor [33]. En las secciones del tumor del grupo Pre-ZM, nos dimos cuenta de que los vasos aparecido más pequeños y delgados, y tenían menos de ramificación. Los vasos del tumor en el grupo DMSO me parecían más maduro con lúmenes, paredes gruesas, y una fuerte tinción CD31 largo de su longitud. lo tanto, medir las áreas de tinción CD31-positivo. Como se muestra en la Figura 3C, los tumores del grupo-ZM198,615 Pre tenían una estadísticamente significativa (
P
& lt; 0,05) disminución de la media de la zona de CD31-positivas en comparación con los tumores en el grupo de DMSO I (2596 ± 121,4 píxeles
vs.
3900 ± 522,3 píxeles, respectivamente), que corresponde a una reducción de 33%. No hubo diferencias estadísticamente significativas en la media de vasos vasculares y tamaño entre los ratones en los grupos de tratamiento (DMSO II
vs
ZM198,615 o Montelukast;. Figura 3D, E y F). El tamaño vascular reducida en secciones tumorales tomadas del grupo Pre-ZM indicó que CysLT
tratamiento antagonista 1R durante 21 días podrían inhibir la vascularización del tumor y que tienen un efecto más pronunciado en la progresión tumoral.
(A y D) Representante CD31 imágenes teñidas (× 100). (B y E) la densidad de vasos se determinó con un recuento de CD31-positivo en tres diferentes campos (puntos calientes). (C y F) Análisis cuantitativo de áreas CD31-positivo utilizando Adobe Photoshop. Los datos cuantitativos se muestran son la media ± SEM. *
P Hotel & lt; 0,05 por
t
prueba
A continuación, los niveles de expresión de proteínas seleccionadas que intervienen en el ciclo celular, la apoptosis y la angiogénesis eran de Student. investigado. p21
WAF /Cip1, un potencial inhibidor del ciclo celular, ha demostrado ser significativamente upregulated en muestras de tumores del grupo Pre-ZM comparación con el grupo DMSO I (
P
& lt; 0,01; Figura 4A) . También se observó moderadamente aumento de los niveles de caspasa 3 escindida fragmentos (Figura 4B) y disminuyó significativamente los niveles de expresión de VEGF (
P
& lt; 0,05; Figura 4C) en los tumores del grupo de Pre-ZM en comparación con el DMSO I grupo. Se hicieron análisis similar para los grupos de tratamiento (ZM198,615 o Montelukast
vs.
DMSO II). Significativamente aumento de los niveles de expresión de p21
WAF /Cip1 (
P
& lt; 0,01; Figura 3D) y disminución de los niveles de expresión de VEGF (
P
& lt; 0,05; Figura 4D) podría ser observado para el grupo de Montelukast-tratada, pero no para el grupo tratado con ZM198,615 comparación con el grupo DMSO II. Aumento de los niveles de caspasa 3 escindida fragmentos también se observaron en los grupos de tratamiento (ZM198,615 o Montelukast
vs.
DMSO II) (Figura 4E).
Las muestras tumorales (tres o cuatro tumores de cada grupo) se sometieron a análisis de transferencia Western. Las membranas se probaron para p21 (A y D)
WAF /Cip1; (B y E) escinden caspasa 3; y (C y D) VEGF. Los datos se normalizaron sobre la base de los niveles de beta-actina. El análisis densitométrico de expresión de la proteína representa la media ± SEM. * P
Restaurant & lt; 0,05, ** P
. & Lt; 0,01 por
t de Student
CysLT
Antagonistas 1R reducir la proliferación e inducir G
1 detención de células HCT-116
Debido a que se observó que CysLT
tratamiento con antagonistas 1R podría inhibir el crecimiento tumoral
in vivo
en parte, mediante la inducción de la detención del ciclo celular , estábamos al interesado para confirmar este hallazgo
in vitro
. Para investigar si CysLT
antagonistas 1R tenían ningún efecto directo sobre la proliferación de células de cáncer de colon, se realizó el ensayo de proliferación celular WST-1. El tratamiento con concentraciones crecientes de ZM198,615 causó la inhibición de la proliferación de células HCT-116 en una forma dependiente de la dosis. En el día 4, el crecimiento de las células tratadas con 12,5, 25 y 50 mM ZM198,615 se redujo en un 11%, 31% y 88% respectivamente, en comparación con las células control tratadas con DMSO (Figura 5A). Cuando se utilizaron las mismas concentraciones de Montelukast como ZM198,615, se observó un efecto aún más fuerte en la inhibición del crecimiento celular; 35%, 88% y 100% para 12,5, 25, y 50 mM Montelukast, respectivamente, en comparación con las células de control tratadas con DMSO (Figura 5B). A continuación examinó si la CysLT
1R antagonista de inhibición del crecimiento mediada por las células HCT-116 se debió a la intervención del ciclo celular. Se encontró que el Montelukast induce la detención del ciclo celular de las células HCT-116 dentro de las 24 h en G
1 fase. Como se muestra en la Figura 5C, panel derecho, 81% y 87% de las células tratadas con 12,5 y 25 mM Montelukast, respectivamente, estaban en G
1 fase en comparación con 64% de las células tratadas con DMSO.