Extracto
El cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa más común de muerte por cáncer en el mundo occidental y las interacciones entre factores genéticos y ambientales, incluyendo la dieta, están sugerido que desempeñar un papel fundamental en su etiología. Se realizó un experimento de alimentación a largo plazo en el ratón para hacer frente a la expresión de genes y cambios de metilación que surgen en la mucosa colónica histológicamente normales como eventos de predisposición al cáncer putativas disponibles para la detección temprana. La expresión de 94 genes reguladores del crecimiento previamente vinculado a la CRC humana se estudió en dos puntos de tiempo (5 semanas y 12 meses de edad) en el heterocigoto
Mlh1
+/-
ratones, un modelo animal para el síndrome de Lynch humana (LS), y el tipo salvaje
Mlh1
+ /+
hermanos de camada, alimentados por cualquiera de estilo occidental (WD) o AIN-93G dieta de control. En los ratones alimentados con WD, la mucosa del colon proximal, el sitio predominante de formación de cáncer en los modelos LS, mostraron una disminución significativa en la expresión de los genes supresores de tumores,
Dkk1, HoxD1
,
SLC5A8
, y
SOCS1
, los dos últimos sólo en los
Mlh1
+/-
ratones. la expresión de ARNm reducido fue acompañado por un aumento de la metilación del promotor de los respectivos genes. La disminución más fuerte expresión (7,3 veces), junto con un aumento significativo de su promotor metilación se observó en
Dkk1
, un antagonista de la vía canónica de señalización Wnt. Además, la inactivación de
Dkk1
parece predisponer a neoplasias en el colon proximal. Esto y el hecho de que
Mlh1
que mostró metilación solamente modesta todavía se expresó en ambos
Mlh1
+/-
y
Mlh1
+ /+
ratones indican que disminuye la expresión y la inactivación de los
Dkk1
en particular, es un marcador precoz prominente para la oncogénesis de colon
Visto:. Pussila M, Sarantaus L, Dermadi Bebek D, S Valo, Reyhani N, Ollila S, et al. (2013) los cambios de expresión génica contra el cáncer-Predecir en la mucosa colónica de la dieta occidental Fed
Mlh1
+/- ratones. PLoS ONE 8 (10): e76865. doi: 10.1371 /journal.pone.0076865
Editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 22 de mayo de 2013; Aceptado: 28 Agosto 2013; Publicado: 8 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Pussila et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo contó con el apoyo financiero de las subvenciones del Consejo Europeo de Investigación (2008-ADG-232635), la Fundación Sigrid Juselius (http://www.sigridjuselius.fi/foundation), cáncer de Organizaciones de Finlandia (http://www.cancer.fi/es /), la Academia de Finlandia (http://www.aka.fi/eng), y Biocentrum Helsinki (http://www.helsinki.fi/biocentrum/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) se desarrolla como un proceso de varios pasos, lo que requiere una serie de alteraciones genéticas y epigenéticas. El proceso se acelera en individuos con predisposición al cáncer hereditario, y las interacciones entre factores genéticos y ambientales, incluyendo la dieta, parece estar en posición clave en su etiología [1,2]. La importancia de las alteraciones epigenéticas tales como cambios en la metilación del ADN en el inicio de la CRC se reconoce ahora [3,4], sin embargo, los primeros eventos en la mucosa colónica normal disponibles para la detección temprana y la prevención del desarrollo del cáncer aún no se han dilucidado.
Aunque las mutaciones heredadas en el gen supresor de tumores (TSG) de APC (poliposis adenomatosa coli), un componente importante de la vía de señalización /β-catenina vía, y la reparación de apareamientos erróneos (MMR) genes (por ejemplo,
MLH1
, mutL homólogo 1), que controlan la tasa de mutación en una célula [2] puede conferir un alto riesgo de por vida de cáncer con una edad temprana de inicio, el cáncer colorrectal es claramente una enfermedad de la edad [3,4]. En consecuencia, los cambios de metilación de un pequeño subconjunto de ETG se han detectado en la mucosa del colon de envejecimiento de los individuos sanos normales, y esta metilación implica genes que a menudo se convierten en metilados más sustancialmente en células neoplásicas [5-7], lo que sugiere su papel en la iniciación del cáncer y progresión. Junto con el envejecimiento de algunos compuestos exógenos a partir de fuentes dietéticas son modificadores importantes de los patrones de metilación en el colon [8], probablemente explica por qué las poblaciones occidentales que consumen grandes cantidades de carne roja, grasas saturadas y azúcar, y sólo cantidades moderadas de fibra dietética, vitaminas y minerales (por ejemplo, calcio, ácido fólico y vitamina D), así como los nutrientes derivados de plantas muestran las incidencias más altas de CRC en el mundo [1] (Fondo Mundial para la Investigación del cáncer, www.dietandcancerreport.org). Así, los cambios epigenéticos proporcionan un posible vínculo entre la nutrición y el cáncer [9] y hacer hincapié en la necesidad de dilucidar los efectos de la dieta sobre la regulación de genes en la mucosa intestinal.
Los modelos animales, en particular los roedores, proporcionan un recurso valioso en el ámbito de medio ambiente epigenética incluyendo estudios sobre los cambios mediados a través de la dieta [10]. Los resultados sugieren que la dieta de estilo occidental (WD) induce tumores gastrointestinales en modelos de ratón de cáncer intestinal familiar e incluso de tipo salvaje (WT) los ratones sin tratamiento con el carcinógeno [11-14] nos llevó a estudiar los efectos de la exposición sobre WD gen la regulación y la metilación en la mucosa normal del colon con y sin la susceptibilidad al cáncer de colon hereditario. Hemos seleccionado 94 genes reguladores del crecimiento previamente vinculados a CRC humana y estudiamos su expresión en el heterocigoto
Mlh1
+/-
ratones análogo al síndrome de Lynch humana (LS), y WT
Mlh1
+ /+
hermanos de camada. Durante un experimento de alimentación a largo plazo que utilizamos nuestra propia modificación del estilo occidental de la dieta (WD *), que se parece mucho a la nueva dieta occidental (NWD) demostrado inducir neoplasias benignas y malignas en el colon de /6 ratones normales C57BL después de una 18 experimento de alimentación meses [12]. La principal diferencia entre NWD y WD * es la fuente de grasa que a su WD * fue cambiado en gran medida a partir de aceite de grasa animal (leche) y por lo tanto se asemeja más grasa consumida por la población occidental. Aquí, el colon proximal, el sitio predominante de formación de cáncer en los modelos LS [15], reveló varios cambios significativos relacionados con la edad en la expresión de genes. Algunos cambios se potenciaron por WD * y algunos se encuentran sólo en ratones con predisposición al cáncer genético. Además, demostró que los cambios de expresión detectados a partir de la mucosa histológicamente normal se producen notablemente temprana antes de la
APC
inactivación y el segundo golpe en
Mlh1
.
Métodos
ratones
Heterocigota B6.129-
Mlh1
tm1Rak
ratones (Mlh1
+/-) (01XA2 cepa) se obtuvieron a partir del NCI -MMHCC; Institutos Nacionales de Salud, ratón repositorio, NCI-Frederick, MD. En B6.129-
Mlh1
tm1Rak
ratones, el exón 2 no se encuentra en uno de los dos
Mlh1
alelos que conducen a la proteína Mlh1 no funcional [16 ]. Mlh1
+/- ratones tienen un aumento de la morbilidad en comparación con sus compañeros de camada WT y aproximadamente un tercio desarrollan tumores, tales como linfomas, así como tumores del intestino delgado y grueso y un número de otros órganos durante su vida útil [17]. El Mlh1
+/- y Mlh1
+ /+ ratones fueron genotipo utilizando ADN genómico extraído de asignaciones de acuerdo con el protocolo publicado en la página web del ratón repositorio (http://mouse.ncifcrf.gov/protocols.asp? ID = 01XA2 & amp; p_allele = Mlh1% 3Ctm1Rak% 3E & amp; prot_no = 1) (Ver Materiales y Métodos S1)
Ética declaración
los ratones fueron criados y tratados de acuerdo con el protocolo del estudio aprobado por. la Junta nacional Experimental Animal en Finlandia (ESLH-2.008-06.502 /YM-23). Los ratones fueron sacrificados humanitariamente con la inhalación de CO2.
Dietas
A la edad de 5 semanas (punto de tiempo 0, TP0),
Mlh1
+ /- Opiniones y
Mlh1
+ /+
ratones se dividieron al azar en dos grupos de dieta (n = 8 /grupo, incluyendo ambos sexos) alimentados con AIN-93G ( AIN) control de la dieta [18] o de estilo occidental (WD *) dieta (Harlan Teklad, Madison, WI) (Tabla 1, la descripción detallada de las dietas nutricionales y sus composiciones se encuentran en la Tabla S1).
AIN93- g
WD *
fuentes de grasa (g /kg)
a (g /kg)
bSoybean Oil70-grasa de leche anhidra-133Canola aceite-aceite-55Sunflower 12Carbohydrate SourcesStarch397306Maltodextrin13295Sucrose100116Protein Source200 ( La caseína) 232 (caseína, libre de vitamina) contenido total de energía (kcal /g) 3.84.6Kcal de la grasa (%) 17.239.2Kcal de los carbohidratos (%) 63.942.3Kcal de proteína (%) 18.818.5Vitamin D (IU /kg) 1000100Folic ácido (mg /kg) 20.2Calcium50.5Table 1. dieta información nutricional.
Para la composición detallada de las dietas experimentales véase la Tabla S1.
a menos que se estipule de otra manera
b Si no se indique otra CSV Descargar CSV
preparación de la muestra
Ocho ratones por cada grupo en TP0 (Mlh1
+/-, Mlh1
+ /+) y TP1 (12 meses de edad) (Mlh1
+ /+ AIN, Mlh1
+/- AIN, Mlh1
+ /+ DL *, Mlh1
+/- WD *) 48 ratones en total fueron sacrificados y se tomaron muestras. Los estudios histológicos se llevaron a cabo en el Centro Finlandés para el Laboratorio de Patología Animal (FCLAP), Universidad de Helsinki, Finlandia.
Para el ADN genómico y extracciones de ARN total, la mucosa (6 x 4 mm) se separó de la subyacente submucosa y la musculatura bajo un microscopio de disección. Las muestras para la extracción de ARN se almacenaron en RNAlater (Qiagen, Valencia, CA) a -80 ° C.
extracción de RNA y Las muestras de ARN total se prepararon usando el Kit RNeasy Plus transcripción inversa
( Qiagen, Valencia, CA) con un tratamiento con DNasa extra (Qiagen, Valencia, CA). La integridad del ARN se analizó con los Agilent 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) Bioanalyzer y única de ARN de alta calidad (número integridad del ARN RIN & gt; 8) se utilizó para reacciones de síntesis de ADNc, que se corrían como duplicados y se agruparon para la RT -qPCR reacciones. La transcripción inversa ya sea de 200 ng (muestras individuales para StellARray) o 1600 ng (piscinas de ocho muestras, 200 ng de cada uno, de ocho ratones diferentes que pertenecen a cada grupo TP1 para TaqMan RT-qPCR) de ARN total se logró con M-MuLV RNasa H
+ (Thermo Scientific, Finlandia) y superíndices III (Life Technologies, Carlsbad, CA), respectivamente, utilizando cebadores aleatorios de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
estudios de expresión de ARN
las expresiones de ARN de histológicamente muestras de tejido normal de la mucosa del colon proximal se analizaron mediante el uso de una costumbre cuantitativa hecho StellARray
TM plataforma (Lonza Group Ltd, Bar Harbor Biotecnología). El StellARray incluye 94 genes (73 ETG) previamente asociados con el desarrollo de cáncer colorrectal y /o documentada para exhibir isla CpG (CGI) hipermetilación en el CCR y otros cánceres humanos (Tabla S2).
APC
se incluyó en la matriz como un indicador de la carcinogénesis en curso. Ocho ratones de cada grupo de estudio se analizaron por separado para la expresión de los 94 genes de interés (48 matrices de RT-qPCR en total).
Cada pocillo de placa StellARray estaba cargado con 20 l de mezcla maestra de SYBR Green contiene 8μl de la muestra de ADNc específico y modificado
brockianus Thermus
ADN polimerasa (Thermo Scientific, Finlandia). Las matrices de RT-qPCR se realizaron en un ciclador Mx3000P (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) utilizando los siguientes parámetros de ciclo: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 7 minutos, 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, y 60 ° C durante 1 min. Fluorescencia datos fueron adquiridos durante el 60 ° C paso de recocido /extensión. El primer especificidad fue monitoreado a través de un análisis de la curva de fusión. Se analizaron las diferencias de expresión entre los diferentes grupos de ratones usando el patrón global Recognition ™ (GPR) de software (Bar Harbor Biotecnología, Trenton, ME)
Los resultados de los cambios de expresión estadísticamente significativas en relación con WD * y /o heredados predisposición al cáncer fueron validados en TP1 utilizando ensayos TaqMan (Tabla S3). En contraste con StellARray RT-qPCR, el análisis TaqMan RT-qPCR se realizó a partir de muestras reunidas. Cada muestra combinada se sometió a ensayo por triplicado para los genes diana, así como los genes de referencia endógenos utilizando los siguientes parámetros de ciclación: 1 ciclo de 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, y 60 ° C durante 1 minuto. El ciclo térmico y adquisición de datos de fluorescencia se realizaron con un ciclador StepOnePlus (Life Technologies, Carlsbad, CA) y los valores Cq fueron llamados usando el software de asistencia-Data v2.0 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Los genes de referencia, expresado de manera uniforme (
HDAC1
y
STK4
) fueron seleccionados utilizando el algoritmo GeNorm [19] de entre los 94 genes incluidos en el StellARray.
Mlh1
niveles de expresión en TP0 fueron también su cuantificación mediante ensayo TaqMan.
Si la cantidad de molde era demasiado bajo para obtener resultados fiables, la validación de RT-qPCR se realizó utilizando ADNc pre-amplificado. Para cada grupo de TP1, muestras combinadas fueron multiplex pre-amplificado utilizando 16 ng de cDNA con el kit TaqMan PreAmp Master Mix (Life Technologies, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los parámetros de ciclación fueron los siguientes:. 1 ciclo de 95 ° C durante 10 min y 10 ciclos de pre-amplificación de 95 ° C durante 15 s, y 60 ° C durante 4 min
metilación del ADN análisis
Para el análisis de la metilación del ADN, sólo los genes que habían mostrado una disminución significativa expresión mRNA (es decir, candidato hypermethylated ETG) en asociación con predisposición hereditaria y /o WD * fueron seleccionados, y los niveles de metilación de sus islas CpG (CGI) fueron evaluados de forma individual para cada TP0 y TP1 ratón. ADN genómico para el análisis de metilación fue extraído por medio DNeasy Blood & amp; Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) a partir de muestras de tejido de las inmediaciones de los utilizados para los estudios de expresión de ARN.
El análisis de metilación cuantitativa se realizó con el sistema de TM MassARRAY EPITYPER
de Sequenom (Sequenom GmbH, Hamburg , Alemania), que es una tecnología basada en bisulfato de depender de la escisión-base específica de RNA y de láser de desorción ionización de espectrometría de masas de tiempo de vuelo asistida por matriz (MALDI-TOF-MS) para determinar el grado relativo de metilación en fragmentos de ADN que contiene o bien uno o varios sitios posteriores CpG, que se hace referencia como unidades de CpG [20]. En el espectro de masas, un patrón de señal diferente resulta de la secuencia diana metilado y no metilado, y el software EPITYPER determina las proporciones de metilación individuales (es decir, relaciones de intensidad de señal como porcentaje de metilada a señales no metilados) de CpG sitios /unidad dentro de una secuencia diana. El sistema es capaz de detectar los niveles de metilación de tan solo el 5%.
Los amplicones fueron seleccionados principalmente para cubrir los CGI anotado por el navegador UCSC genoma y que se solapa con el sitio de inicio de la transcripción y la UTR 5 'o ser en su proximidad. En total, doce amplicones diferentes se analizaron (longitudes entre 174 y 499 pb) de los cuales ocho pertenecían a la pre-validado ratón estándar EpiPanel y cuatro eran ensayos de metilación de ADN de encargo diseñados utilizando el software EpiDESIGNER de Sequenom (Sequenom GmbH, www.epidesigner.com), para el que las secuencias de cebadores y los sitios de destino se proporcionan en la Tabla S4. Con el fin de reducir la variabilidad de metilación introducido durante la PCR [21], se realizaron tres amplificaciones replicadas y se agruparon para el análisis de masas. Los datos iniciales de metilación se filtró por Sequenom excluir mediciones de baja calidad. unidades de CpG que produjeron datos en más del 75% de las muestras pasaron el control de calidad inicial. De estos, se seleccionaron muestras que produjeron datos en mayor que 80% para todas las unidades de CpG en un amplicón para ese par de muestra /amplicón. Para un análisis más detallado, las unidades de CpG que había datos disponibles por menos de 50% de todas las muestras y las muestras que tenían se excluyeron los datos disponibles por menos de 50% de todas las unidades de CpG. Después del control de calidad del 78% de las unidades analizadas CpG (152 de 196) y todas las 48 muestras se incluyeron en posteriores etapas de análisis.
análisis estadísticos
En StellARray RT-qPCR, una común umbral se fijó a través de todas las placas de 48 dentro del experimento. Se analizaron las diferencias de expresión entre diferentes grupos usando el software de patrón global Recognition ™ (GPR), que ejecuta la corrección eficiencia y normalizaciones de genes y de control de referencia del grupo (www.bhbio.com/BHB/dw/products.gpr.html~~number=plural). GPR también se aprovecha de réplicas biológicas para extraer cambios significativos en la expresión génica. El sistema StellARray no funciona con genes de referencia definidos por el usuario. En lugar de ello, el algoritmo de software GPR determina el mejor conjunto de genes de referencia en el experimento mediante la comparación de la expresión de todos los genes incluidos en el ensayo entre las muestras de prueba y de control, genera un patrón global de los cambios de expresión, y crea una lista clasificada de significativa cambios [22]. De este modo, la selección de genes de referencia es imparcial, ya que permite que los datos experimentales para definir los genes expresados de forma estable de referencia
.
En ensayos TaqMan, se analizaron los cambios relativos de expresión de ARNm utilizando el comparativo C
t (ΔΔC
método T), que presenta los datos como cambios veces en la expresión génica normalizaron a genes de referencia endógenos y en relación con el grupo de control [23]. software v2.0 de datos de asistencia de (Life Technologies, Carlsbad, CA) fue utilizado para (CQ) de datos, y un método de permutación mediana [24] se utilizó para determinar la significación de la expresión pliegue cambios de control de calidad y la normalización del ciclo de cuantificación en comparación con el grupo de control con un nivel de significación de
P
& lt; 0.05
.
La correlación entre los patrones de expresión StellARray de 5 semanas de edad
Mlh1
+ /+
y
Mlh1
+/-
ratones se estudió mediante análisis de correlación de Pearson (
R
valor) del sistema de PASW Statistics 18.
software Chipster [25] fue utilizado para visualizar y analizar la metilación de datos. La herramienta no métricas escalamiento multidimensional (CMBD) se utilizó para producir mapas bidimensionales basado en la disimilitud de muestra calculado utilizando la distancia euclídea, y se utilizó la herramienta dendrograma para crear dendrogramas de muestras utilizando los datos normalizados con correlación de Pearson y el método de vinculación promedio . Para Chipster análisis, se definieron los valores que faltan de metilación de CpG unidades individuales como el valor de la mediana de la unidad de CpG dentro del grupo de ratones en particular.
La comparación de los niveles promedio de metilación entre los diferentes grupos de ratones se realizó mediante la prueba de Mann-Whitney del sistema de PASW Statistics 18.
Resultados
neoplasias del colon se desarrollan predominantemente en WD * ratones
en general, se observó un adenocarcinoma proximal y cinco adenomas /pólipos hiperplásicos en el 32 ratones en TP1. La importancia de WD * sobre el riesgo de CCR en nuestra serie del ratón se destaca por el hecho de que 5 de cada 6 ratones con neoplasias fueron alimentados con WD * y que WD * causó el desarrollo de tumores también en ratones de tipo salvaje y sin predisposición hereditaria, es decir, el único el carcinoma y un adenoma fueron encontrados en el
Mlh1
+ /+
WD * ratones (Tabla 2, Figura S1). La única AIN ratón alimentado el desarrollo de la neoplasia (pólipo hiperplásico) era portadora de la mutación.
Ratón Grupo
Dkk1
expresa (n = 16)
Dkk1 no
expresa ( n = 16)
Mlh1
+ /+
AIN62
Mlh1
+/-
AIN3
a5
Mlh1
+ /+
WD * 4
b4
c
Mlh1
+/-
WD * 35
a, b, bdTable 2.
Dkk1
de inactivación y colon neoplasias en diferentes grupos de ratones
pólipo hiperplásico.;
b adenoma;
c adenocarcinoma;
D no confirmado histológicamente CSV Descargar CSV
Mlh1
+/- y Mlh1
+ /+ ratones muestran patrones de expresión de ARNm similares al inicio
Al comienzo de la alimentación experimental periodo (TP0), el Mlh1
+/- y Mlh1
+ /+ ratones mostró una buena correlación notablemente (de Pearson
R
= 0,989,
P Hotel & lt; 0,01) entre los patrones de expresión de mRNA de los 94 genes incluidos en la costumbre StellARray RT-qPCR array (Figura S2A). Sin embargo, distinto de los otros genes, pero de acuerdo con los diferentes genotipos, la expresión de
Mlh1
fue aproximadamente 50% menor en los ratones heterocigotos que en los ratones WT (Figura S2B). En general, un fondo isogénicas en el principio hizo justificada a la razón de que las diferencias de expresión que aparecerían entre los diferentes grupos de ratones fueron posteriormente adquiridos y no el resultado de la constitución genética heredada.
WD * y /o predisposición hereditaria están asociados con la expresión diferencial de varios genes en TP1
a la edad de 12 meses (TP1), se encontró que la expresión de varios genes a ser aumentado o disminuido en comparación con TP0 (Tablas 3 y 4). Todos los resultados de GPR (
P-valores
y doblar cambios) de las diferencias de expresión entre los diferentes grupos de ratones para todos los 94 genes están en el cuadro S5. Nueve de los 94 genes mostraron estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,05) entre los cambios de expresión TP0 y TP1 en todos los grupos de ratones (Mlh1
+ /+ AIN, Mlh1
+/- AIN, Mlh1
+ /+ DL *, Mlh1
+/- WD *) (Tabla 3). La disminución en los niveles de ARNm se observaron en
CCND1 gratis (ciclina D1),
Cdh1 gratis (cadherina 1), y
Mal gratis (mielina y proteínas de linfocitos, la proteína de diferenciación de células T), mientras que el aumento de expresión se observó en
AXIN2
,
CDX1 gratis (Caudal tipo homeobox 1),
Fzd10
[homólogo Frizzled 10 (
Drosophila
)],
MBD2 gratis (metil-CpG proteína del dominio de unión 2),
MBD4 gratis (metil-CpG proteína del dominio de unión a 4), y
Rasgrf2 gratis (Ras-proteína específica de nucleótidos guanina liberación factor de 2). Dado que estos cambios no dependen de la predisposición hereditaria o WD * que puede ser atribuible al envejecimiento.
Mlh1
+ /+
AIN
Mlh1
+/-
AIN
Mlh1
+ /+
WD
Mlh1
+/-
WD
downregulated GenesFold Cambio (
P
) doble cambio (
P
) doble cambio (
P
) veces el cambio (
P
)
CCND1
3,3 (0.003) 3,8 (0.000) 4,3 (0.001) 3,6 (0.000)
Cdh1
5,4 (0.002) 4,9 (0.000) 5,9 (0.002 ) 8,4 (0.000)
Mal
3,4 (0.025) 3,4 (0.014) 3,2 (0.034) 2,7 (0.028) upregulated GenesFold Cambio (
P
) doble cambio (
P
) doble cambio (
P
) doble cambio (
P
)
AXIN2
2,6 (0.005) 3,0 (0.002) 1,8 (0.039) 1,6 (0.028)
CDX1
4,1 (0.002) 5,6 (0.000) 3,4 (0.002) 5,4 (0.000)
Fzd10
4,8 (0.002) 7,6 (0.000) 3,4 (0.021) 5,0 (0.000)
MBD2
3.3 (0.004) 4,7 (0.000) 3,2 (0.003) 5,7 (0.000)
MBD4
3,0 (0.005) 6,0 (0.000) 3,0 (0.004) 3,3 (0.000)
Rasgrf2
2,3 (0.002) 1,8 (0.006) 2,3 (0.001) 1,5 (0.040) Tabla 3. Los genes que muestran estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,05) las diferencias de expresión de ARNm entre TP0 y TP1 en los cuatro grupos de ratones; en el grupo control (Mlh1
+ /+ AIN) y los tres grupos de estudio (Mlh1
+/- AIN, Mlh1
+ /+ WD, Mlh1
+/- WD).
Descargar CSV CSV
Mlh1
+ /+
AIN
Mlh1
+/-
AIN
Mlh1
+ /+
WD
Mlh1
+/-
WD
regular a la baja GenesFold Cambio (
P
) doble cambio (
P
) doble cambio (
P
) doble cambio (
P
)
Dkk1
2,0 (0.110) 5,1 (0.012) 6,2 (0.003) 7,3 (0.003)
SLC5A8
1,3 (0.078) 1,7 (0.041) 1,3 (0.224) 1,5 (0.032)
HoxD1
1.1 (0,348 ) 2,0 (0.075) 2,1 (0.019) 1,5 (0.191)
SOCS1
1,6 (0.460) 2,7 (0.067) 1,0 (0.485) 3,1 (0.026) upregulated GenesFold Cambio (
P
) veces el cambio (
P
) doble cambio (
P
) doble cambio (
P
)
Dkk2
2,2 (0.108) 2,2 (0.037) 1,7 (0.329) 1.0 (0.637)
RPRM
1,4 (0.442) 2,0 (0.017) 1,1 (0.725) 3,3 (0.019)
Acaa1b
2,4 (0.120) 1,8 (0.140) 3,5 (0.124) 9,4 (0.000) Tabla 4. Los genes que muestran estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,05) las diferencias de expresión de ARNm entre TP0 y TP1 en al menos uno de los grupos de estudio, pero no en el grupo control (Mlh1
+ /+ AIN).
CSV Descargar CSV
Estadísticamente significativos cambios de expresión entre TP0 y TP1 asociado con la predisposición hereditaria del cáncer (Mlh1
+/-) y /o WD * se observaron en siete genes (Tabla 4, el cuadro S5); disminución de la expresión de
Dkk1
[Dickkopf homólogo 1 (
Xenopus laevis
)]
, SLC5A8
[(soluto transportista familia 5 (transportador de yoduro), el elemento 8]
, HoxD1 gratis (Homeobox D1), y
SOCS1 gratis (supresor de la señalización de citoquinas 1), y el aumento de la expresión de
Dkk2
[Dickkopf homólogo 2 (
Xenopus laevis
)],
RPRM gratis (Reprimo, TP53 dependiente de detención en G2 mediador candidato), y
Acaa1b gratis (acetil-coenzima A aciltransferasa 1B).
La disminución más fuerte expresión (7.3 veces) se observó en la señalización de Wnt gen supresor
Dkk1 Estar entre la Mlh1
+/- ratones alimentados con WD *. en los ratones heterocigotos alimentados con AIN y en ratones WT alimentados con WD *, la disminución fue 5,1 y 6,2 veces, respectivamente. Curiosamente, el gen homeobox
HoxD1
mostró una disminución de la expresión relacionada con la edad (2,1 veces) sólo en el Mlh1
+ /+ DL * grupo, y la disminución estadísticamente significativa relacionada a WD * se observó además que este grupo se comparó con el grupo control (
Mlh1
+ /+
AIN) en TP1 (1,9 veces) (Tabla S5). La disminución de la expresión del transportador de butirato
SLC5A8 servicios asociados sólo con el
Mlh1
heterocigosidad (1,5 y 1,7 veces en WD * y AIN grupos, respectivamente), mientras que
SOCS1
, un regulador de la señalización de citoquinas, fue significativamente reducido regulado (3,1 veces) sólo si ambos factores de riesgo estaban presentes, es decir, en el
Mlh1
+/-
WD * grupo.
la expresión de
Dkk2
, otro modulador de la señalización de Wnt, se incrementó significativamente en el Mlh1
+/- grupo AIN (Tabla 4), de manera que en TP1,
Dkk2
expresión entre Mlh1
+/- ratones fue significativamente menor (2,2 veces) en el grupo de WD * en comparación con el grupo de AIN (Tabla S5).
RPRM
mostró un aumento de la expresión relacionada con la edad estadísticamente significativa en asociación con
Mlh1
heterocigosidad (3.3 y 2.0. * Doblar por WD y AIN, respectivamente).
Acaa1b
mostró un aumento significativo en la expresión de la Mlh1
+/- WD * ratones (9,4 veces) y los niveles de expresión reveló una diferencia significativa (5,0 veces) cuando el
Mlh1
+/-
ratones WD * se compararon con los
Mlh1
+/-
AIN grupo en TP1 (cuadro S5).
No hubo muestras de tejidos disponibles /extractos para validar los resultados a nivel de proteína. Por lo tanto, TaqMan RT-qPCR se utilizó para validar los cambios de expresión asociados con la Mlh1
mutación de predisposición al cáncer
y /o WD *. El fondo isogénica y nuestros propios resultados que los ratones mostraron patrones de expresión de ARNm similares desde el principio (Figura S2A, S2B) hicieron justificada para combinar las muestras individuales (n = 8) de cada grupo en piscinas para un uso posterior en los experimentos de validación. La figura 1 ilustra las diferencias observadas entre los grupos de estudio y el grupo control en TP1.
Expresión relativa de los diferentes grupos de estudio (Mlh1
+/- AIN, Mlh1
+ /+ DL *, y Mlh1
+/- WD *) se compara con el grupo control (Mlh1
+ /+ AIN). Cada muestra es una mezcla de ocho muestras de ARN a partir de ocho ratones TP1 diferentes que pertenecen a cada grupo de ratones. Los datos se presentan como media ± SEM (error estándar de la media) (n = 3), * Diferencia significativa en comparación con el grupo control. permutación método mediana,
P Hotel & lt; 0.05. (A)
Mlh1
muestra la misma expresión diferencia del 50% entre los genotipos como en el punto de partida del estudio. (B)
Dkk1
es significativamente reducido regulado en los grupos de estudio con WD * y /o
Mlh1
heterocigosidad. (C)
SLC5A8
no muestra diferencias significativas de expresión en TP1. (D)
HoxD1
es el regulado en asociación con WD * en ambos genotipos; la regulación a la baja, siendo especialmente fuerte en el
grupo + /+ WD Mlh1. (E)
SOCS1
no muestra diferencias significativas de expresión en TP1. (F)
Dkk2
es el regulado en asociación con WD * en ambos genotipos.
Los ensayos TaqMan confirmaron la observación de que
Dkk1
es uno de los más candidatos prominentes con la expresión en la mucosa del colon alteradas en asociación con predisposición al cáncer hereditario y WD *. Debido a los bajos niveles de
Dkk1
mRNA, RT-qPCR se realizó en cDNA pre-amplificado (valor uniformidad amplificación de -0,76).
niveles Dkk1
mRNA se redujeron significativamente en comparación con el grupo control (
Mlh1
+ /+
AIN) en todos los grupos de estudio [Mlh1
+ /+ DL *, 1,5 veces (rango, 1,4-1,7); Mlh1
+/- AIN, 1,4 (1,3-1,5); Mlh1
+/- WD *, 1,2 (1,1-1,2)] (Figura 1B). La expresión de
HoxD1
se redujo significativamente no sólo en Mlh1
+ /+ DL * ratones [1,9 (1,7-2,2)], un hallazgo ya observado en StellARray, sino también en el Mlh1
+/- WD * grupo [1,3 (1,2-1,3)] (Figura 1D), destacando el efecto de WD * en
HoxD1
expresión. El TaqMan RT-qPCR también confirmó la importancia de WD * en la expresión de
Dkk2
, donde en StellARray se observó una disminución estadísticamente significativa en Mlh1
+/- WD * ratones [1,2, (1.2- 1.3)], pero ahora también en ratones WT alimentados con WD * [1.2 (1.2-1.3),
P = 0,053
] (Figura 1F). La expresión de
Acaa1b
También se encontró que era significativamente aumentó tanto en el Mlh1
+/- WD * y Mlh1
+ /+ DL * ratones [2,6 (2,3-2,8) y 1,7 ( 1,7-1,8), respectivamente] (Figura S3). Los niveles de expresión de
SLC5A8
y
SOCS1
no fue diferente entre el grupo control y los grupos de estudio (Figura 1 C, E).
En particular, hay una edad o una dieta significativa No se encontraron cambios de expresión relacionados en
Apc
o
Mlh1
. Al igual que en el inicio, la expresión de
Mlh1
fue aproximadamente 50% menor en los ratones heterocigotos en comparación con los ratones WT, lo que indica que el segundo golpe de inactivación de
Mlh1
aún no se había producido por TP1 ( Figura 1A). La expresión de
Apc
fue similar en ambos genotipos (StellARray).
Los aumentos significativos en los niveles de metilación de ADN acompañan a una expresión reducida de los genes
Los niveles de metilación del CGI de la genes que habían mostrado disminución estadísticamente significativa en la expresión de ARNm en asociación con
Mlh1
heterocigosidad y /o WD * (
Dkk1, SLC5A8, HOXD1
, y
SOCS1
; Tabla 4 ) fueron analizados individualmente para cada TP0 y TP1 ratón usando el sistema TM MassARRAY EPITYPER
de Sequenom. Además,
Mlh1
, y
Sfrp1
que había mostrado relacionada con la edad disminución de la expresión de la significación marginal (1,4 veces,
P
= 0,06) en el Mlh1
+ 0.05.