Extracto
A pesar de que los cánceres se consideran ampliamente que ser mantenido por las células madre, la existencia de células madre en células renales carcinoma (RCC) rara vez se ha informado, en parte debido a la falta de marcadores de la superficie únicos. Nosotros aquí identificamos células similares a las células madre del cáncer con la población lado fenotipo (SP) en cinco líneas celulares de RCC humanas. La citometría de flujo El análisis reveló que 769P, una línea celular humana CCR de células claras, contenía la mayor cantidad de células SP en comparación con otras cuatro líneas celulares. Estas células 769P SP poseían características de la proliferación, la auto-renovación y diferenciación, así como una fuerte resistencia a la quimioterapia y la radioterapia que fueron posiblemente relacionado con el transportador de ABCB1.
in vivo
experimentos con transplante del tumor en serie en ratones también mostraron que las células SP 769P tumores en ratones NOD /SCID formados. Tomados en conjunto, estos resultados indican que las células SP 769P tienen las propiedades de las células madre del cáncer, que pueden jugar un papel importante en la tumorigénesis y la terapia de resistencia al RCC
Visto:. Huang B, Huang YJ, Yao ZJ, Chen X, Guo SJ, Mao XP, et al. Las células (2013) Stem Cell-cáncer como lado Población en Clear Cell Carcinoma de células renales 769P línea celular. PLoS ONE 8 (7): e68293. doi: 10.1371 /journal.pone.0068293
Editor: Neil A. Bhowmick, Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: March 1, 2013; Aceptado: 28-may de 2013; Publicado: 11 Julio 2013
Derechos de Autor © 2013 Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales (Nº 81272809, Nº 80202011, Nº 81202013, Nº 30872584); Fundación de Ciencias Naturales de Guangdong (Nº 8251008901000018, Nº S2012040007557); Sun Yat-sen Programa de talento innovador de cultivo para los tutores Excelentes (No. 80.000 a 3.126.205); Ciencia y Tecnología Proyecto de Planificación de la provincia de Guangdong, China (Nº 2011B050400021, Nº 2012B090600021, Nº 445323198311050317); y Guangdong clave Laboratorio de Urología, Hospital primera Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou (núm 2010A060801016). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer renal es un importante problema de salud, causando más de 15.000 muertes al año en América del Norte. cáncer renal con metástasis o en fase avanzada en adultos es resistente a los fármacos quimioterapéuticos convencionales [1]. Dilucidar la génesis de este tipo de cáncer ayudará a que el diagnóstico precoz y el tratamiento, mejorando así el pronóstico.
Los tumores sólidos se componen de diversos tipos de células con diferente capacidad de proliferación. Sólo una pequeña población de estas células pueden formar tumores en ratones inmunodeficientes [2]. Esta observación ha llevado al concepto de las células madre de cáncer (CSC), los llamados células iniciadoras del tumor o células cancerosas de tallo como [3], [4], [5], [6], que se han pensado capaz de la proliferación, la auto-renovación y diferenciación en múltiples linajes, por lo tanto juega un papel esencial en el desarrollo y tratamiento de tumores [2], [3]. Aunque los CAC se han aislado de varios tipos de tumores humanos, incluyendo los cánceres hematológicos [7], el cáncer de ovario [8], cáncer de próstata [9], cáncer de mama [10], y los tumores cerebrales [11], la falta de CSC-específica marcadores de antígenos de la superficie celular se ha delimitado una mayor investigación sobre este tema [12]. parte de población (SP) es un término citometría de flujo (FCM) para definir grupos de células con una fuerte capacidad de flujo de salida ADN tinte Hoechst 33342 a través de transportadores ABC. células de población secundarios desaparecen después del tratamiento con cualquiera de los antagonistas del calcio o inhibidores de los transportadores ABC, como verapamilo y rapamicina [13] .Esta actividad conduce a la "cara" (baja fluorescencia) fenotipo de la población y se cree que es un auto fundamental función y por lo tanto con protección contra una característica universal de células madre [14], [15]. Desde que se introdujo por primera vez por Goodell et al. en 1996 [16], se ha informado ampliamente células SP para ser enriquecido en diversos tejidos cancerosos tales como el cáncer de mama [17], tumor del sistema gastrointestinal [18], y el cáncer de células pequeñas de pulmón [19] y de las líneas celulares tales como la nasofaringe líneas celulares de carcinoma de [20], carcinoma hepatocelular [21], y cáncer de vejiga [22]. células SP, con potenciales stemness, pueden formar xenoinjertos de tumores en animales y son resistentes a la quimioterapia y la radioterapia, lo que contribuye a la recaída del tumor [23].
RCC, el tercer cáncer más común del tracto urinario, representa aproximadamente 3% de todos los tumores malignos humanos. RCC se clasifican como de células claras, papilar, cromófobo, conductos colectores, y no clasificados RCC, con CCR de células claras (CCRCC) como el tipo más frecuente. Que representa el 82% de los CCR. El tratamiento de CCRCC metastásico sigue siendo un reto importante para los médicos y causa aproximadamente el 35% de la mortalidad relacionada con el RCC [24]. RCC casos han ido aumentando de manera constante durante décadas [25]. Por otra parte, la mayoría de los pacientes que ya tienen o enfermedad metastásica en el momento del diagnóstico inicial o metástasis a distancia después de la resección del tumor primario [26]. El pronóstico de RCC es pobre en parte debido a la resistencia de RCC metastásico a la mayoría de las terapias actuales, tales como la quimioterapia y la radioterapia. La terapia dirigida contra las CSC puede traer una nueva esperanza para mejorar el pronóstico de los pacientes con CCR.
Aunque se han realizado avances significativos en la investigación SP, el papel de las células SP en el CCR sigue siendo [27], [28 debe determinarse plenamente ], [29], [30]. Addla et al. [29] han informado de que tanto las células epiteliales renales normales y malignas contenían una proporción de células SP que eran enriquecer con algunas propiedades de células madre. Más recientemente, Nishizawa et al. [30] han encontrado que las células derivadas de células SP RCC mostraron una mayor capacidad iniciadoras del tumor de células de NSP. Por lo tanto, la hipótesis de que las células SP son una fracción enriquecida de las células madre del cáncer.
Se realizó el presente estudio para identificar las células SP a partir de líneas celulares de RCC humanas establecidas y determinar sus características y roles en la tumorigénesis y el tratamiento de RCC. A continuación, se aislaron células SP 769P de células, una línea celular humana CCRCC, mediante tinción con Hoechst y citometría de flujo. Nuestros experimentos in vivo e in vitro demostraron que en células SP poseían las conocidas características de CSC de proliferación, autorrenovación y diferenciación, así como una fuerte resistencia a la quimioterapia y la radioterapia que fueron posiblemente relacionados con el transportador de ABCB1. Estos hallazgos pueden proporcionar nuevas perspectivas para futuras investigaciones CSC y la terapia contra el cáncer clínico.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
cinco líneas celulares humanas RCC 769P, 786-O , OS-RC-2, SN12C, y SKRC39 se utilizaron en este estudio. Las líneas celulares 769P y 786-O se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.); OS-RC-2, SN12C, y SKRC39 fueron amablemente dotado por el Dr. Liu Zhuowei (Departamento de Urología, Sun Yat-sen Universidad del Centro del Cáncer), que obtuvo estas líneas celulares a partir de la Colección de Cultivos Tipo de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China) [31], [32], [33]. , 786-O, SO-RC-2 células 769P, y SKRC39 se cultivaron en medio RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, California, EE.UU.), mientras que las células SN12C se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco) a 37 ° C en un 5% de CO
2 atmósfera. Ambos medios contenían 10% de suero de ternera fetal (FCS, Gibco), 1% (v /v) de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina.
Side Análisis y Cell Población Ordenando
población Side se llevaron a cabo análisis y clasificación de células como se ha descrito previamente por Goodell et al. [16] con modificaciones. Brevemente, las células se tripsinizaron, se suspendieron a 1 × 10
6 células /ml en pre-calentado RPMI-1640 que contiene 2% de FBS y 10 mmol /L de HEPES (Gibco), después se incubaron con 5 mg /ml de Hoechst 33342 (Sigma , St. Louis, MO, EE.UU.) ya sea solo o en combinación con 50 mmol /L verapamil (Sigma), un inhibidor del transportador ABC, en oscuridad durante 90 min en el 37 ° C baño de agua con mezcla intermitente. Al final de la tinción, las células se centrifugaron y se resuspendieron en HBSS frío (Gibco) que contiene 2% de FBS y 10 mmol /L de HEPES. Después se llevaron a análisis FCM y clasificación de células directamente sobre EPICS ALTRA flujo Cytosorter (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.). Hoechst 33342 se entusiasma con 100 mW láser UV y se detectó con 450 filtro de BP para la fluorescencia azul y filtro de 675 BP por fluorescencia roja. Una 610-
nm espejo dicroico corto CD -
pase gratis (DMSP) del filtro se utiliza para separar las longitudes de onda de emisión. Una puerta en vivo poligonal FS-HO trama azul fue creado para excluir los desechos y células muertas. SP células y las células no-SP (NSP) se clasifican para los siguientes ensayos.
Formación de clonar y largo plazo Ensayos de diferenciación
En el modo de clasificación autoclone, cada 500 769P células de SP o NSP fenotipo fueron ordenadas directamente en una placa de cultivo de 6 cm, y se cultivaron con medio RPMI-1640 medio de cultivo completo durante 10 días. Después de la mayoría de los clones de células se habían expandido a más de 50 células, se lavaron dos veces con PBS, se fijaron en 75% de metanol durante 15 min, y se tiñeron con cristal violeta durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, los platos se enjuagaron y el número de clones que contenía más de 50 células se contó bajo un microscopio de contraste de fase. La eficacia de formación clon fue la relación entre el número de clones con el número de células sembradas. ensayos de formación de clones se repitieron por triplicado.
El ensayo de diferenciación a largo plazo se realizó 10 días después de la clasificación celular, de acuerdo con el protocolo de análisis de la población lado, para determinar la capacidad de diferenciación de las células SP y NSP.
Detección de la expresión del ARNm de ABC Family Members en Ordenada 769P SP células mediante RT-PCR
ARN total fue extraído de células SP y NSP por separado utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, San Diego, CA). La expresión de ABCB1, ABCC1, y ABCG2 se detectó utilizando el PrimeScript
Kit TMRT-PCR (Takara, Otsu, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores (Tabla 1) fueron diseñados y sintetizados por Invitrogen. GAPDH se utilizó como referencia interna. Las condiciones de PCR fueron desnaturalización a 94 ° C durante 4 minutos seguido de 40 ciclos de hibridación a 94 ° C durante 45 s, 58 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 45 s, con una elongación a 72 ° C durante 8 min . Los productos de PCR fueron analizados por electroforesis en agarosa al 1,5% para la expresión de ARNm de miembros de la familia ABC.
La detección de proteínas Expresión de ABC Family Members en Ordenada 769P SP células a través de Western Blot
Las proteínas totales se extrajeron de SP y las células NSP separado y desnaturalizadas en tampón de muestra de dodecilsulfato de sodio (SDS), a continuación, igualmente cargaron en gel de poliacrilamida 8%. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno. Las transferencias se incubaron con anticuerpos primarios indicados durante la noche a 4 ° C, después se incubaron con anticuerpo secundario de rábano picante y conjugado con peroxidasa, y finalmente se detectaron utilizando mayor quimioluminiscencia Western Blot detección reactivos (GE Healthcare, Reino Unido). El ABCG2 ratón (a dilución 1:1,000), ABCB1 (1:1,000), y ABCC1 (1:5,000) anticuerpos monoclonales a partir de Abcam Inc. (Cambridge, UK), así como anti-GAPDH (1:2,000) de Santa Cruz biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.) se utilizaron para determinar los niveles de proteína relativos.
la radiación y la droga de sensibilidad Ensayos
SP
para determinar la sensibilidad de las células a la radiación, recién ordenados y las células fueron NSP sembradas en placas de 6 pocillos (500 células /pocillo), y se expusieron a 5 Gy de rayos X (500 cGy /min, utilizando un × campo de irradiación 12 cm 6 cm) con o sin 30 minutos de pre-incubación con verapamil (50 mmol /L) el día después de la clasificación. Cuando la mayoría de clones de células tenían más de 50 células, se tiñeron con cristal violeta para determinar el número de células de supervivencia.
Para determinar la sensibilidad de las células a los fármacos, las células SP y NSP se sembraron en placas de 96 pocillos (500 células /pocillo) y se cultivaron con mitoxantrona (MTX, un agente antineoplásico inhibidor de la topoisomerasa II, Sigma), 5-fluorouracilo (5-FU, Sigma), o sunitinib (un inhibidor de tirosina quinasa, Sutent, Pfizer, Nueva York, EE.UU. ) el día siguiente en un gradiente de concentración, con o sin 30 minutos de pre-incubación con 50 mmol /ml de verapamilo como quimiosensibilizador a la mitoxantrona. Se usaron células sin tratar como control. Cuatro pocillos paralelos se establecieron para cada grupo. Después de 3 días, la absorbancia de cada pocillo a una longitud de onda de 570 nm (
Un
570) se midió. tasa de supervivencia de las células se calculó utilizando la fórmula: tasa de supervivencia = (media
Un
570 de los pozos de prueba /media
Un
570 de los pocillos de control) x 100% . Tasa de inhibición se calculó usando la fórmula:. tasa de inhibición = 100% - tasa de supervivencia
xenoinjerto de tumor de formación Ensayo
Los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Laboratorio animales de la Universidad Sun Yat-sen. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentos con Animales de la Primer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen. Un total de 54 de 5 a 7 semanas de edad, diabéticos no obesos (NOD) /inmunodeficiencia combinada severa (SCID) los ratones hembra se obtuvieron del Centro de Experimentación Animal de la Universidad Sun Yat-sen. Los ratones se dividieron en 6 grupos, con 9 ratones en cada grupo. cantidad indicada de SP recién ordenados y las células del NSP se suspendieron en 200 l de PBS, por separado, y se inoculó por vía subcutánea en la fosa axilar de ratones NOD /SCID inmediatamente después de la clasificación. Los ratones se controlaron dos veces por semana para la formación de tumores palpables. A las 6 semanas después de la inoculación, los ratones se sometieron a eutanasia para evaluar la formación de tumores. Los tumores se midieron usando un calibre Vernier, se pesaron, y se fotografiaron. Se recogió una porción de cada tumor subcutáneo, se fijaron en formaldehído al 10%, e incluidos en parafina para la evaluación patológica después de H & amp; E tinción. La otra porción de cada tumor se disocia en suspensión de células individuales, que se preparó tal como se describe anteriormente [34] con modificaciones menores. Brevemente, el tejido tumoral se disoció manualmente en & lt; 0,5 fragmentos mm y se eliminaron todos los grumos visibles, entonces se digirió con 1 mg /ml de colagenasa tipo II (Sigma) y 1,2 mg /mL dispasa (Sigma) durante 45 a 90 min a 37 ° DO. De vez en cuando, se utilizó 0,2 g /ml de tripsina (Invitrogen) durante 10 minutos para asegurar la disociación en células individuales. Las células se filtraron a través de filtros de células 70-m consecutivas para eliminar los grumos restantes. células recogidas fueron suspendidas en PBS suplementado con 1% de FCS. Al menos 100.000 células recolectadas se tiñeron para el análisis de SP. Veinte de 5 a 6 semanas de edad ratones hembra SDIC fueron divididos en 4 grupos de ensayo de trasplante en serie. Cada 5.000 células disociadas a partir de un tumor de xenoinjerto, que se formó con 2.000 SP células, 20.000 SP células, 20.000 células NSP, o 200.000 células NSP, fueron re-inoculadas en un ratón NOD /SCID. evaluación de la formación de tumores y el examen patológico se realizaron 6 semanas más tarde.
Análisis estadístico
Los datos se expresan como la media ± desviación estándar (DE) de al menos tres experimentos independientes. Microsoft Office Excel 2007 y softwares SPSS13.0 fueron utilizados para el procesamiento de datos. La significación estadística se determinó con
t de Student
. Un
P
valor & lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
existencia de células SP en RCC líneas celulares
Cinco líneas celulares de RCC fueron analizados para. sus fenotipos SP. La puerta R2 muestra que el porcentaje de células SP, con dim Hoechst 33342 de fluorescencia, se redujo de 4,82% entre las células 769P sin tratamiento verapamil a 0,02% entre las células 769P con verapamil pre-incubación (Fig. 1A). Repetición de la prueba de células clasificadas demostró una pureza de 96,61% para las células SP y 99,89% para las células de NSP (Fig. 1B). Para las otras cuatro líneas celulares de RCC, las proporciones de células SP en 786-O y OS-RC-2 células fueron 0,1% y 0,2%, que eran demasiado bajos para los siguientes experimentos; no se detectaron células SP entre SN12C y las células SKRC39 (Fig. S1). Por lo tanto, las células SP y NSP fueron ordenados a partir de células 769P para experimentos posteriores.
A, SP de clasificación utilizando Hoechst 33342. Una puerta en vivo poligonal fue creado para excluir los desechos y células muertas. Se adquirieron al menos 50.000 células para analizar el fenotipo SP de cada muestra. El porcentaje de células SP se redujo cuando las células 769P se pre-incubaron con verapamil para bloquear el transportador de ATP. B, la pureza de las células recién ordenados 769P SP y no SP (NSP) fue 96,61% y 99,89% (1-0,11%).
Formación de clonar y diferenciación de las Ordenada 769P SP y células NSP
Después de 7 días de cultivo, la mayoría de los clones contenía más de 50 células. Se contó el número de clones y se encontró que la media eficacia de formación clon de células SP fue significativamente mayor que la de las células de NSP [(56,4 ± 1,3)% vs. (22,7 ± 1,5)%,
P
& lt; 0.001; Higo. 2A).
A, ensayos de formación de clones reveló que la eficiencia de la formación de clon de células SP recién según fue mayor que la de las células de NSP. **,
P Hotel & lt; 0,01. B, a los 10 días después de la clasificación, la proporción de células SP (indicado por la puerta R2) entre células SP ordenados y ordenadas se midieron las células de NSP. La proporción de células SP entre células SP ordenados sólo es 19,51%, lo que sugiere que las células SP más ordenados se diferencian en células de NSP. La proporción de células SP entre las células clasificadas NSP es solamente un 2,39%, lo que sugiere que las células NSP ordenados no pueden diferenciarse en células SP.
Después de 10 días de cultivo, las células SP 769P más ordenados diferenciadas en células de NSP, mientras que no se detectó sólo una pequeña proporción de células SP entre las células 769P NSP ordenados (Fig. 2B), lo que sugiere la capacidad de las células SP a la auto-renovarse y diferenciarse en células de NSP.
Expresión de ABC Family Members en Ordenada 769P SP y NSP células
La expresión de ABCB1, ABCG2, y ABCC1 fue detectado por RT-PCR y Western Blot. Ambos experimentos demostraron que ABCB1 se expresó en un nivel alto en las células SP ordenados pero a un nivel muy bajo en las células del NSP ordenados, mientras que ABCC1 y ABCG2 fueron indetectables en cualquiera SP ordenada o células de NSP (Fig. 3).
A, reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa. B, inmunotransferencia de tipo Western. Carril 1, ordenados células NSP; carril 2, ordenadas células SP. GAPDH se utilizó como control interno. Ambos experimentos muestran que la expresión de ABCB1 es más fuerte en el SP que en las células de NSP y que ABCG2 y ABCC1 no se expresan en células SP y NSP.
Sensibilidad del Ordenada 769P SP y NSP células a la radiación y Drogas
Se midió la sensibilidad de las células SP 769P y NSP ordenados a la radiación por ensayo de formación de clon. La eficiencia de la formación de clon de células SP fue significativamente mayor que la de las células de NSP ya sea antes o después de la irradiación (
P
& lt; 0.05; Fig. 4A). En detalle, la eficiencia de la formación de clon de células SP no cambió notablemente después de la radiación (
P
& gt; 0,05), mientras que la de las células de NSP se redujo drásticamente (
P
& lt; 0,05), lo que sugiere que las células SP eran más resistentes a los daños de rayos X que las células de NSP.
a, la eficacia de formación clon de células 769P SP según es significativamente mayor que la de las células de NSP, ya sea antes o después de 5 Gy de rayos X irradiación. La eficiencia de la formación de clon de células SP es significativamente mayor que la de las células después de la irradiación de NSP (
P
& lt; 0,01); la eficacia de formación clon de células no irradiadas NSP es significativamente mayor que la de las células irradiadas NSP (
P
& lt; 0,05). B, las células SP 769P recién ordenados son más resistentes a la mitoxantrona que las células de NSP (
P
& lt; 0,01), mientras que esta resistencia se invierte con el pretratamiento verapamil. células C, SP también son más resistentes a 5-fluorouracilo que las células de NSP (
P
& lt; 0,05). La resistencia también puede estar invertida con pretratamiento verapamil. D, la sensibilidad de las células SP al sunitinib es similar a la de las células de NSP (
P Hotel & gt; 0,05) guía empresas
También midió la sensibilidad de las células SP 769P y NSP ordenados. a MTX, 5-FU, y sunitinib. SP células mostraron una fuerte resistencia a MTX, mientras que las células NSP fueron sensibles a MTX (
P Hotel & lt; 0,001). Verapamilo, un inhibidor del transportador ABC, mejora el efecto inhibidor de MIX en células SP, con una tasa de inhibición de la proliferación similar a la de las células de NSP en las mismas condiciones (
P
& gt; 0,05); sin embargo, verapamil no para mejorar el efecto de MIX en las células de NSP (
P
& gt; 0,05) (Fig 4B.). También se encontró que las células SP eran mucho más resistentes a 5-FU que las células de NSP (
P Hotel & lt; 0,05; Fig. 4C), pero sus sensibilidades a sunitinib fueron similares (
P Hotel & gt ; 0,05;. la Fig. 4D)
tumor Formación de células clasificadas 769P SP y NSP en NOD /SCID
Las células clasificadas 769P SP y NSP se inocularon en ratones NOD /SCID para observar su capacidad para formar tumores. Un ratón que fue inoculado con 20.000 células NSP y 1 con 200.000 células NSP murió después de la inoculación. A las 6 semanas después de la inoculación de células, 2 ratones desarrollaron tumores con sólo 200 SP células, mientras que la cantidad más baja de las células de NSP para formar tumores fue 20.000 células (Fig 5A;. Tabla 2). El examen anatomopatológico confirmó que los tumores formados con células SP y NSP mostraron las mismas características que las células típicas RCC al igual que las células no clasificadas 769P (Fig. 5B)
.
, los puntos de inyección A y B de ratones NOD /SCID de 6 semanas después de la inoculación con SP recién ordenados o células de NSP. Los tumores se observaron en todos los ratones inoculados con 2.000 SP células, pero no en los ratones inoculados con 2.000 células NSP. C y D, examen anatomopatológico muestra típica de carcinoma de células renales en ratones inoculados con cualquiera 2.000 SP células o 200.000 células NSP.
Para confirmar el papel postulado de células SP en la formación del tumor, un tumor formado con 200 células SP y un tumor formado con 20.000 células NSP se disociaron en suspensión de células, respectivamente, y se tiñeron con Hoechst 33342. análisis FCM mostraron que la proporción de células SP fue mayor en tumor formado por células SP que en tumor formado por células NSP . (Fig. 6), lo que sugiere la in vivo auto-renovación y diferenciación de NSP-SP células
a, las células fueron disociadas del tumor formado con 200 células SP 769P; B, las células se disocia del tumor formado con 20.000 células 769P NSP. La proporción de células SP fue mayor en tumor formado por células SP que en NSP tumor formado por células (1,5% vs. 0,2%).
A fin de determinar la capacidad de formación de tumores de segunda generación SP células, se inocularon células SP 5000 (de 2 tumores formados con 20.000 y 2.000 células SP, respectivamente) o 5.000 células NSP (de 2 tumores formados con 200.000 y 20.000 células NSP, respectivamente) en ratones NOD /SCID. Todos los ratones desarrollaron tumores 6 semanas después de la inoculación. Los tumores de NSP de segunda generación fueron significativamente más pequeños y más ligeros que los tumores SP de segunda generación (
P Hotel & lt; 0,01; Fig. 7A y B). Todos los tumores de segunda generación eran histológicamente idénticos a los xenoinjertos de tumores primarios (Fig. 7C). Estos resultados indicaron que las células SP fueron capaces de generar tumores en serie.
A, los ratones NOD /SCID se inocularon con 5.000 células SP segunda generación a partir de un tumor formado con 2.000 SP células o con 5.000 células NSP segunda generación de un tumor formado con 200.000 células NSP. Los tumores se retiraron de los ratones 6 semanas después de la inoculación. B, los tumores SP de segunda generación son mucho más pesados que los tumores de NSP de segunda generación (**
P Hotel & lt; 0,01). C, El examen anatomopatológico muestra que tanto el tumor SP de segunda generación y la segunda generación de tumores histológicamente NSP son idénticos a los xenoinjertos de tumores primarios.
Discusión
En los últimos años, las investigaciones sobre células madre cancerosas en tumores sólidos han demostrado resultados notables. En este estudio, se aislaron células SP de líneas celulares de RCC de células claras humanos para determinar las propiedades biológicas de esta población de células.
Se encontró que 4,8% de las células RCC 769P eran células SP, que mostraron la capacidad de auto renovación y diferenciación multi-linaje. Se observó una eficacia de formación clon de células SP más altas que la de las células de NSP. Además, las células SP mostraron capacidad de formación de tumor al menos 100 veces más alta que la de las células de NSP. Los tumores se forman en ratones NOD /SCID que fueron inoculadas con sólo 200 células SP recién ordenados, mientras que se requieren al menos 20.000 células NSP para formar tumores en ratones. Estos resultados proporcionan evidencia directa de la alta tumorigenicidad de células SP.
auto-renovación y diferenciación de las capacidades multi-linaje son características de las células madre. El trasplante de células en serie en modelos animales, aunque imperfecta, puede ayudar a evaluar la estabilidad de las células SP en comportamientos biológicos. Nuestro análisis SP re-clasificación después de un trasplante de células SP serie en ratones mostraron que las células SP de segunda generación derivados de los xenoinjertos de tumores de células SP mantienen la capacidad de auto-renovación y diferenciación multi-linaje. Además, las células de tumores de xenoinjertos tanto SP y NSP mantienen la capacidad de formar tumores en ratones, pero los tumores SP segunda generación eran significativamente más pesados que los tumores de NSP de segunda generación, lo que sugiere que las células SP 769P son más tumorigénico de células de NSP.
células madre del cáncer se considera capaz de someterse a una división celular auto-renovación asimétrica, que se divide en una célula madre y una célula progenitora, lo que podría generar una variedad de células funcionales más diferenciadas que forman parte de toda la sociedad del tumor [35]. En nuestro estudio, la pureza de las células SP 769P según fue 96,61% y la de las células NSP según fue 99,89%. Es posible que algunas células SP pueden haber unido a las células y por lo tanto NSP sido recogidos juntos. Después de un cultivo de 10 días, las células SP ordenados desarrollan en una comunidad que contiene 19.51% de células SP y células NSP alrededor del 80%, mientras que las células NSP ordenados desarrollan en una comunidad que contiene células SP solamente 2,39% que se pueda derivar de unos pocos furtivamente en la SP las células durante la clasificación. células NSP pueden forman colonias algunas más pequeñas y tumores también regenerados aunque los tumores eran más pequeños. Tomados los resultados de la diferenciación a largo plazo y experimentos de trasplante de serie juntos, sugiere fuertemente que las células SP se someten a la división asimétrica y son capaces de diferenciarse en células de NSP y la formación de la mayor parte de tumor. Las capacidades de las células para formar colonias de NSP y tumores, que eran mucho más débiles que las capacidades de las células SP, pueden explicarse por la pequeña proporción de colarse en células SP entre las células NSP ordenados.
El fenotipo es SP determinado por los estados de los transportadores ABC ABCB1, ABCC1-5, y ABCG2 [36]. Así, las células SP se clasifican a través de la medición de la rápida eflujo de tintes fluorescentes lipofílicos por transportadores ABC [16]. La mayoría de los estudios anteriores se han centrado en la función de ABCG2, mientras que la necesidad de la función de la bomba de ABCB1 en la expansión de células madre estaba bajo debate [37]. En nuestro estudio, la expresión de ABCB1 fue alta en células SP, pero baja en las células del NSP como se detecta por ambos RT-PCR y Western Blot. Curiosamente, ni ABCC1 ni ABCG2 se expresó en células SP y NSP, lo que sugiere que sólo ABCB1 contribuye a la función del fenotipo SP en células 769P.
De acuerdo con la teoría de CSC, CSC en tumores sólidos son resistentes a la quimioterapia y radioterapia, y residentes que sobrevivieron a las CSC tratamiento pueden reformar los tumores [38]. Hemos llevado a cabo ensayos de quimiosensibilidad y radiosensibilidad de comparar la sensibilidad de las células SP y NSP a las terapias convencionales. Encontramos que las células SP eran más resistentes a la radiación que las células de NSP. Además, las células SP eran más resistentes a mezclar y 5-FU que las células del NSP, lo que indica que las células SP son ampliamente resistentes a los fármacos quimioterapéuticos convencionales. Sin embargo, esta resistencia a los medicamentos podría ser revertido por el tratamiento previo con verapamilo, un inhibidor de transportador de ABC, lo que sugiere que los transportadores ABC pueden ser responsables de la resistencia a fármacos [36], [37], [39].
En conclusión, nuestro estudio demostró que las células SP aisladas a partir de la línea celular RCC 769P poseen características de las células madre a través tanto de
in vitro
y
in vivo
experimentos. Estas células SP se caracterizan por un fuerte potencial de proliferación, autorrenovación, la diferenciación, la resistencia a la quimioterapia y la radiación, y
in vivo
capacidad de formación de tumores. ABCB1 se ha encontrado para contribuir a la función de las células SP. Con suerte, el desarrollo de una terapia de focalización esta población celular ayudará a mejorar el pronóstico de la RCC.
Apoyo a la Información
Figura S1.
células SP ordenar los resultados en líneas celulares de cáncer de células renales humanas 786-O, SO-RC-2, SN12C, y SKRC39 utilizando Hoechst 33342. Sólo se detectaron unas pocas células SP-786 entre O y SO-RC-2 células , y el porcentaje de células SP cayó cuando las células se pre-incubaron con verapamil durante aproximadamente 30 min. No se detectaron células SP entre las células SN12C y SKRC39
doi:. 10.1371 /journal.pone.0068293.s001 gratis (TIF)