Extracto
Este estudio tiene como objetivo examinar si existen o no las células madre del cáncer en los tumores de la vaina nerviosa periférica tumores (MPNST). Las células de las líneas establecidas, cultivos primarios y tumores recién disecados se cultivaron en condiciones libres de suero suplementado con epidérmicas y de crecimiento de fibroblastos factores. A partir de una línea celular humana establecida TMVNP, S462, las células que satisfacen los criterios de las células madre de cáncer fueron aislados. Se obtuvieron esferas clonales, que podría ser a pases múltiples veces. El enriquecimiento de células similares a las células madre en estos ámbitos también fue apoyada por una mayor expresión de marcadores de células madre como CD133, Oct4, nestina y NGFR, y disminución de la expresión de marcadores de células maduras, como CD90 y NCAM. Además, las células de estas esferas S462 clonales diferenciarse en células de Schwann, músculo liso /fibroblastos y células de neuronas como en condiciones culturales específicos que inducen la diferenciación. Por último, la inyección subcutánea de las esferas en ratones desnudos inmunodeficientes condujo a la formación de tumores a una velocidad mayor en comparación con las células adherentes de los padres (66% versus 10% a 2,5 × 10
5). Estos resultados proporcionan evidencia de la existencia de células similares a las células madre del cáncer en los tumores de la vaina nerviosa periférica tumores
Visto:. Spyra M, L Kluwe, Hagel C, Nguyen I, J Panse, Kurtz A, et al. Las células (2011) Stem Cell-cáncer Al igual Derivados de nervio periférico maligno vaina tumores. PLoS ONE 6 (6): e21099. doi: 10.1371 /journal.pone.0021099
Editor: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: Diciembre 22, 2010; Aceptado: 20-may de 2011; Publicado: 13 Junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Spyra et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos estudios se apoya en parte por una subvención del programa del Departamento de Defensa neurofibromatosis (W81XWH-07-0359 a DEG) y "Bildung und Bundesministerium für Forschung" (BMBF) (01GM0480 a AK). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
malignos tumores de la vaina nerviosa periférica (MPNSTs) son sarcomas de tejidos blandos derivados de los nervios periféricos y tienen altas tasas de recurrencia local y metástasis hematógena [1]. Ellos representan el 10% de todos los sarcomas de tejidos blandos. La mitad de estos tumores malignos se presentan en pacientes con neurofibromatosis tipo 1, un síndrome de genes supresores de tumores, con una incidencia de aproximadamente 1 en 3000. TMVNP, especialmente aquellos asociados con la neurofibromatosis tipo 1, son una de las neoplasias más agresivas en los seres humanos con un muy mal pronóstico [2].
Los resultados de estudios recientes sugieren que muchos tumores malignos contienen células con propiedades de células madre, incluyendo la auto-renovación, clonalidad, multipotencia, y altas tasas de formación de tumores en ratones inmunodeficientes [3], [4 ]. Al igual que las células madre embrionarias, las células madre del cáncer se postulan para ser resistentes a los medicamentos [5], [6]. En nuestro ensayo clínico reciente con mesilato de imatinib, un inhibidor de la tirosina quinasa del receptor, varios pacientes con TMVNP mostraron respuestas iniciales prometedores como sus tumores reducido a muy pequeños núcleos. Sin embargo, la recaída se produjo en todos los casos y los tumores recurrentes no respondió a la terapia inicial más (observaciones no publicadas). Posiblemente, una pequeña porción de las células similares a células madre escapó de la terapia y condujo a la recaída
Si bien se ha informado de células madre de cáncer y estudiado en una serie de tumores sólidos ampliamente [7] - [9]., Se aún no han sido identificados en MPNSTs. En el presente estudio, hemos probado la hipótesis de que MPNSTs también contienen células similares a las células madre, que pueden ser enriquecido
in vitro
. Las células similares a las células madre a partir de una línea celular humana establecida TMVNP, S462, se caracterizaron adicionalmente
in vitro
,
in vivo
y molecularmente.
Materiales y Métodos
los pacientes y los tumores
el diagnóstico de neurofibromatosis tipo 1 se hizo de acuerdo con el Instituto Nacional de Salud de los criterios de diagnóstico [10]. MPNST tumores (n = 12), plexiforme (n = 3) y neurofibromas cutáneos (n = 3) se obtuvieron principalmente de los departamentos de cirugía maxilofacial y quirúrgicas del Centro Médico Universitario de Hamburgo-Eppendorf y algunos de la Clínica La neurofibromatosis, Munich. La obtención de los tumores fue aprobado por la junta de revisión local de consentimiento (Hamburgo Ärztkammer, OB-011/07) y todos los pacientes dieron por escrito. Inmediatamente después de la extirpación quirúrgica, las muestras se colocaron en solución salina tamponada de Hanks (Gibco, Paisley, UK). Una parte de cada muestra se utilizó para confirmar el diagnóstico patológico del tumor (Instituto de Neuropatología, Hospital de la Universidad de Hamburgo-Eppendorf). Otra parte se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. Se utilizó el tejido restante para el cultivo celular.
Cultivo de células
Las células de líneas celulares establecidas MPNST S462 y S1507-2 se cultivaron bajo condiciones estándar con suero [11]. La disociación y el cultivo de células de MPNSTs recién resecados fueron como se describe anteriormente [11].
El enriquecimiento de células similares a las células madre
Las células de las líneas establecidas, cultivos primarios y tumores recién disociados se cultivaron bajo vástago condiciones de células en medio de células madre (SCM) que consiste en Neurobasal medio (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) con factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (EGF, 20 ng /ml, R & amp; D Systems, Minneapolis, MN), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF , 20 ng, Prepotech, Rocky Hill, NJ), heparina (32 IE /ml, Rathiopharm, Ulm, Alemania) y suplementado con 1% de N2 y 1% B27 (ambos de Invitrogen). Las densidades de las células cultivadas en placas oscilaron desde individuales hasta 500 células por pocillo. Para esferas de paso, las esferas se recogieron por centrifugación suave a 800
g
de 5 min, y mecánicamente disociado pipeteando arriba y abajo con una pipeta de 1 ml. A continuación, la suspensión celular se filtró a través de un filtro de malla de 30 micras para eliminar los agregados restantes. Única células se sembraron en diferentes densidades en SMC.
Ensayos de proliferación celular
La proliferación celular se evaluó mediante el ensayo de incorporación de bromodesoxiuridina (Roche, Mannheim, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se leyó la absorbancia en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 405 nm.
formación de esferas clonal
Las células se cultivaron en placas a baja densidad en placas de 96 pocillos. Los pocillos que contenían células individuales fueron marcados mientras que los que contienen más de una célula por pocillo fueron excluidos del análisis. Después de dos (o tres) semanas, se contaron los pocillos que contienen esferas. La frecuencia de formación de esferas se calculó como la proporción de los pocillos que contienen esferas contra los pocillos que contenían células individuales.
PCR en tiempo real
ARN se preparó a partir de las esferas y las células adherentes utilizando columnas NucleoSpin RNA XS (Macherey Nagel, Düren, Alemania). Para la síntesis de ADNc se utilizaron cebadores hexámeros aleatorios (Fermentas, St.Leon-Rot, Alemania) y Revertir la ayuda de la transcriptasa inversa (Fermentas). Para la expresión de genes análisis validado ensayos de expresión TaqMan Gene (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania) fueron utilizados. Para la discriminación CD133 se utilizó TaqMan Gene ensayos de expresión de unión en el exón 2/3 y 4/5 del exón CD133. Las cantidades relativas de ARN diana se normalizaron a la proteína ribosomal L13a (RPL13A) como control interno y los valores cuantitativos relativos fueron calculados de acuerdo con el método ΔΔCt.
citometría de flujo
Para la detección de marcadores de superficie CD133, CD34, el receptor del factor de crecimiento nervioso (NGFR, CD271), neural molécula de adhesión celular (NCAM, CD56) y CD90, las células se suspendieron en 30 l de tampón diluyente de anticuerpos (Beckman Coulter, Krefeld, Alemania) y 10 l anti-CD133 /2 -PE (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania), 11 l CD271-FITC (amp I +; D), 5 l CD34-PE, 5 l CD56-PC5 o 5 l CD90-PC7 (Beckmann Coulter) se añadieron concentraciones de anticuerpos óptima ( se determinaron por varios experimentos de dilución). Como controles negativos, las células se incubaron en el mismo tampón suplementado con 10 l IgG1-PE, 10 l IgG1-FITC, 5 l IgG1-PC5, 10 l IgG1-PC7 (Beckmann Coulter) durante 30 min a 4 ° C. Para la detección del antígeno intracelular nestina (R & amp; D), las células se fijaron y se permeabilizaron con el reactivo AB, siguiendo las instrucciones del fabricante (R & amp; D) y 10 l nestina-PE (R & amp; D) o 10 l se añadieron IgG1-PE para 30 min a 4 ° C.
Después de lavar con solución salina tamponada con fosfato, las células se analizaron dentro de 1 h por citometría de flujo, ya sea en un 500 flujo FC citómetro usando software CXP (Beckman Coulter) o en un sistema de análisis de partículas PAS (Partec, Münster, Alemania).
clasificación celular magnética
Las células suspendidas en solución salina tampón fosfato que contiene 0,5% de albúmina de suero bovino y EDTA 2 mM se marcaron magnéticamente con anti-CD133 /2, CD34 y las microbolas CD271 utilizando el Miltenyi Biotec CD133 /2, kits de microperlas CD34, CD271 siguientes instrucciones del fabricante. La separación magnética se lleva a cabo con columnas de separación MACS (Miltenyi Biotec). Las fracciones positivas y negativas se eluyeron tres veces para aumentar la pureza de las muestras. Se evaluaron alícuotas de células clasificadas positivos y negativos para la pureza por citometría de flujo con un flujo de 500 FC citómetro de uso de software CXP (Beckman Coulter).
ensayos de diferenciación celular
esferas Disociar las células adherentes o los padres eran chapado en pocillos recubiertos con poli-lisina y laminina, y se cultivan en DMEM:F-12 (03:01) que contenía suero bovino fetal al 10%. Para la diferenciación de células gliales, 5 ng /ml neoregulina-SS1 humana recombinante (amablemente proporcionado por el Dr. S. Carroll, División de Neuropatología, Departamento de Patología de la Universidad de Alabama en Birmingham, Birmingham, Alabama) y la forskolina 2 mM (Sigma, Munich, Alemania) se añadieron durante al menos 2 semanas [12]. Para fibroblastos músculo liso (/Fb SM) la diferenciación, 40 ng /ml se añadió bFGF (Prepotech) durante 5 días, y después se añadió 1 ng /ml de transformación del factor de crecimiento ß1 (Sigma) durante 7 días [12]. Para las neuronas, medio neurobasal fue suplementado con 1 mM de ácido retinoico (Sigma), 10 mg /AMP cíclico ml (Sigma), 1% B27, y glutamina 2 mM [7] durante 1 semana o más. Para todas las condiciones, el medio se cambió cada tres días
inmunofluorescencia tinción
Las células cultivadas en portaobjetos de cámara se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con los anticuerpos siguientes:. Conejo S100 anti-humano (1 :500, DAKO, Hamburgo, Alemania), de conejo anti-actina de músculo liso (1:100, Santa Cruz, Heidelberg, Alemania), asociada a los microtúbulos proteína de ratón anti-humano (MAP) -2 (Millipore, Schwalbach, Alemania), ratón NGFR anti-humana (1:100, Millipore), neurofilamentos ratón anti-humano (1:400, Millipore) y nestina de ratón anti-humano (1:200, Millipore). Para el doble etiquetado S100, ya sea con o neurofilamentos NGFR, se utilizó el mismo procedimiento para el segundo anticuerpos primarios y un segundo anticuerpo producido en otra especie y se marcó con se utilizó otro colorante. controles de isotipo apropiados y la omisión de los anticuerpos primarios y secundarios se utilizaron para descartar un posible immunolabelling no específica. Los núcleos fueron etiquetados con 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (Invitrogen).
ensayo de tumorigenicidad en ratones desnudos
ratones desnudos atímicos (Charles River) se anestesiaron brevemente con una mezcla de CO
2/0
2 y disociada esferas o células adherentes en suspensión en 50% de Matrigel (R & amp; D) se inyectaron por vía subcutánea en ratones [13]. El crecimiento del tumor se controló dos veces a la semana. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la autoridad local (Behörde für Wissenschaft und Gesundheit, Hamburgo, 68/06).
Se eliminaron los tumores desarrollados en ratones, se fijaron en formalina al 7% e incluidos en parafina. Las secciones fueron teñidas con hematoxilina. Para la inmunohistoquímica se utilizaron anticuerpos de conejo anti-S100 humana (1:500) y de conejo anti-humano Ki67 (1:50, Neomarkers, Asbach, Alemania). Para la detección de anticuerpos, se utilizó el Kit Envision sistema dual peroxidasa (Dako). reacciones de color se desarrollaron con VectorRed (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y los núcleos se contratiñeron con hematoxilina.
análisis de los datos
La comparación de la frecuencia de la formación de esfera entre diferentes pasajes y el aumento de la el número de células capaces de formar esferas tumorales con pases fue probado por un ANOVA no paramétrico; si es significativo, se realizaron comparaciones post-hoc utilizando el test de Dunn. El aumento en el número de células proliferativas en el tiempo se analizó usando un mediciones repetidas ANOVA no paramétrico; si es significativo, se realizó la comparación post hoc utilizando el test de Tukey. Se realizó el mismo ensayo para comparar un aumento en la proliferación de esferas CD133 positivas y negativas en el tiempo. Las diferencias en la cantidad relativa de cDNA se analizó por RT-PCR, y los cambios en el porcentaje de células positivas en las células adherentes de los padres y esferas analizadas por citometría de flujo, se ensayaron usando el U-test no paramétrico de Mann-Whitney. Las diferencias en la frecuencia de la formación de tumores entre los ratones inyectados con células adherentes y esferas, respectivamente, se calcularon mediante la prueba de Chi-cuadrado. Todos los valores promediados se representan como la media ± error estándar de la media (SEM). Los valores se consideraron significativos cuando p. & Lt; 0,05
Resultados
formación de Esfera a partir de células MPNST
Para examinar si o no MPNSTs contienen células madre similares a las células, a partir de 2 líneas establecidas y 12 tumores diseccionados fueron cultivadas en medio libre de suero que contiene EGF y FGF. Esferas o agregados de esfera como se obtuvieron de las dos líneas celulares y 10 de los 12 tumores diseccionados frescos. Esferas formadas a baja densidad, tan bajos como una célula por pocillo, y se propagaron durante al menos 20 pasajes de la línea celular establecida TMVNP S462. Esferas o agregados en forma de esfera también se obtuvieron de otra línea TMVNP establecida (S1507-2) y a partir de células primarias y MPNST MPNSTs recién disecados; sin embargo, sobrevivieron sólo para 2 a 12 pasajes, y no se pudieron obtener a densidades de células por debajo de 100 células por pocillo. Del mismo modo, esferas o agregados de esfera como también se obtuvieron a partir de cultivos primarios derivados de neurofibromas plexiformes y neurofibromas cutáneos, pero no se podían ser pasados más de dos veces. por tanto, más experimentos se centraron en las esferas de la S462.
in vitro caracterización de esferas TMVNP S462
células parentales TMVNP S462 de paso 35, que bajo condiciones de medio estándar con suero crecen de forma adherente, esferas flotantes formadas después 2 días en condiciones de células madre (figura 1A, B;. S462 células adherentes se refieren a la línea celular parental S462). La proliferación de células en las esferas demostró que éstos eran no sólo agregados (Fig. 2A). Cuando estas esferas primarias se disociaron y las células sembradas a muy baja densidad en pocillos de una placa de 96 pocillos, esferas secundarias se obtuvieron en 16,7% ± 2,4 de los pocillos que contenían células individuales. La frecuencia de la formación de esfera a partir de células individuales aumentó cuando las esferas se pasaron más (Fig. 2B). esferas clonales también se obtuvieron a partir de células S462 adherente de la muy temprana paso 2, con una mayor frecuencia de formación de esferas primario 31,86% ± 2,50, casi dos veces mayor que con las células adherentes S462 de paso 35. Hasta la fecha, esferas MPNST S462 han sido pases en condiciones clonales más de 20 veces |.
(A) células parentales S462 en condiciones normales de cultivo con suero crecen de forma adherente (paso 35). (B) flotante esfera secundaria después de dos semanas bajo condiciones de células madre sin suero. La esfera se deriva de una sola célula y por lo tanto era clonal. Bares = 20 micras.
ensayo de incorporación de bromodesoxiuridina reveló proliferación de células S462 en las esferas clonales (esferas secundarias). El aumento de la absorbancia de células fue significativo para 8, 10, y 15 días en SCM frente a 3 días (p & lt; 0,01 **). Los cambios en la frecuencia de formación de esfera en pocillos que contienen células individuales originalmente de adherente S462, a continuación, a partir de esferas disociadas sembraron como células individuales y se pasaron de forma consecutiva. El aumento de la frecuencia de formación de esfera con el aumento de paso fue significativa (paso 1 (esferas primarias) frente a pasajes 10 (10
TH esferas) y 12 (12
TH esferas), P & lt; 0,01 **, paso 2 ( esferas secundarias) frente a los pasajes 10 (10
º esferas) y 12
º esferas), P & lt; 0,05 *) guía empresas
Sobre regulación de marcadores de células madre y la regulación de madurez hacia abajo. marcadores de células en las esferas S462
real-Time PCR reveló la sobre regulación de marcadores de células madre Nestin, NGFR, Oct4, Notch4, SOX2, CD133 y SOX9 en esferas S462 de pasajes entre 13 y 16, en comparación con S462 las células adherentes se mantienen bajo condiciones de cultivo SCM durante 14-16 horas (Fig. 3A, izquierda). Por el contrario, el receptor de EGF (EGFR) y NCAM, un marcador de las células de Schwann inmaduras, se expresaron a niveles más bajos en las esferas S462 que en sus células adherentes parentales (Fig. 3A, derecha).
(A) real -Tiempo de PCR. La expresión de cada marcador en las esferas se normalizó contra la expresión del mismo marcador en las células S462 adherentes. Esferas en pasajes entre 13 y 16. * p & lt; 0,05; adherente frente expresión ámbito transcripción (nestina, NGFR, Oct4, Sox2, CD133, Sox9, EGFR y NCAM). (B) La citometría de flujo. Los cambios en el porcentaje de células que expresan maduro y marcadores progenitoras de células madre en células adherentes y en esferas (conductos 8 y 13), CD133 y NCAM adherentes frente a esferas p & lt; 0,05 *, CD34 y CD90 adherente frente a esferas p & lt; 0,01 **, NGFR y nestina adherente frente a esferas p & lt; 0,01 ***. EGFR, epidérmico receptor del factor de crecimiento; NGFR, el nervio del receptor del factor de crecimiento; NCAM, molécula de adhesión celular.
La citometría de flujo reveló aumento de la expresión de marcadores de la cresta neural NGFR, CD133 y Nestin en las esferas en comparación con las células adherentes S462 parentales (Fig. 3B). La proporción de células que expresan CD34 también se incrementó en las esferas a aproximadamente 50%. Además, aproximadamente el 60% de la población positiva NGFR co-expresó-CD133 en adherente S462 y en las esferas (66,84 ± 10,82% adherentes frente a 60,81 ± 12,21% esferas, no significativo), (Fig. 4). Por el contrario, CD90 y NCAM se expresaron con menos frecuencia en las esferas S462 que en las células adherentes (Fig. 3B).
Side y el análisis de dispersión hacia adelante de células adherentes (columna izquierda) y esferas (en el paso 8, columna derecha) mostró diferentes tipos de células. Las células vivas fueron cerrada en R1 (paneles superiores), y gatings para NGFR (R2) de células positivas (paneles centrales) se muestran en naranja. células NGFR-positivos (representados en naranja) dentro de las células CD133 positivas muestran co-expresión de CD133 /NGFR (paneles inferiores). células NGFR co-expresan CD133 son poco frecuentes en la población de células adherentes y el aumento en esferas. controles de isotipo para todos los antígenos se utilizaron para establecer los cuadrantes para las poblaciones negativas. NGFR, receptor del factor de crecimiento nervioso.
Mayor frecuencia de formación de esferas S462 y la proliferación de las células CD133 +
Uso magnética clasificación basada en perlas, hemos enriquecido células CD133 positivas y negativas a partir del suero -cultured células adherentes S462 (paso 35) a 90 y 80%, respectivamente, y los cultivaron por separado en SCM en baja densidad celular. Más esferas formadas en la población CD133 + en comparación con la población CD133- (35,21% frente a 18,35%). Además, las células en esferas CD133 + proliferaron más rápidamente que los de las esferas CD133- (absorbancia a 405 nm de 0,7 ± 0.047 frente a 0,39 ± 0,0312, p & lt; 0,001).
esferas S462 son capaces de diferenciación de linaje
para evaluar el potencial de diferenciación multilinaje-, esferas clonal derivados y las células adherentes S462 de paso 35 eran cultivadas en un medio que contiene suero, lo que induce la diferenciación. Después de dos a tres semanas, se observó expresión de S100 en un pequeño número de células de esferas clonales S462, lo que indica la diferenciación del linaje de células similares a células de Schwann. En contraste, la expresión de este marcador no se observó en las células adherentes S462 (datos no mostrados). Más de 50% de las células de las esferas clonales expresó nestina cuando se cultivan en medio que contiene suero, en comparación con ninguna de las células adherentes S462 (datos no mostrados).
Adición de neurregulina y forskolina inducida diferenciación específica de S100 + Schwann células en casi todas las células de esferas S462 clonales, pero sólo una pequeña parte de las células adherentes S462 eran realmente positivos para S100 y mostraron una ligera morfología diferente (Fig. 5A). La morfología bipolar de las células de Schwann S100 + diferenciadas a partir de esferas clonales (Fig. 5A, D) fue similar a la de las células de Schwann derivadas de un neurofibroma plexiforme (Fig. 5A inserto). Estas células diferenciadas a partir de esferas clonales también expresan la Schwann marcadores de células de neurofilamentos y NGFR (Fig. 5A), las células adherentes expresadas neurofilamentos pero muy rara vez NGFR (datos no mostrados).
Las células adherentes (columna izquierda) y disociada esfera células (columnas de la derecha) se cultivaron con factores de crecimiento para inducir la diferenciación en células que se asemeja /Fb y neuronas células (a) de Schwann, (B) SM (C), que se tiñen positivamente para S100 /NGFR /neurofilamentos (células de Schwann), SMA ( SM /Fb), y MAP-2 (neuronas), respectivamente. Insertar en A ilustra las células de Schwann S100 + derivadas de una cultura neurofibroma plexiforme. micrografías de contraste (D) de fase de células diferenciadas de 3 condiciones de cultivo para generar células de Schwann, SM /Fb y células similares a neuronas. Las células diferenciadas se indican con flechas y las células no diferenciadas por puntas de flecha. Bares = 20 micras. NGFR, factor de crecimiento nervioso; SMA, actina de músculo liso; MAP-2, microtúbulos proteína 2 asociada; PNF, neurofibroma plexiforme; LC, como las células.
Del mismo modo, la exposición a bFGF y factor de crecimiento transformante ß1 inducen diferenciación específica a células /Fb-SM como en una gran parte de las células de esferas S462 clonales mientras que sólo unos pocos células adherentes S462 mostraron expresión actina de músculo liso y la morfología fibroblastoide (Fig. 5B, D).
Finalmente, el AMP cíclico y ácido retinoico inducen la diferenciación de linaje neurogénica en las células de esferas clonales, ya que expresan MAP-2 y exhibieron la morfología neuronal específica, tales como cuerpos y neuritas (Fig. 5C, D) de células grandes. En contraste, mientras que las células adherentes expresan MAP-2 en las mismas condiciones culturales (Fig. 5C), estas células no mostraron morfología similares a neuronas.
In vivo caracterización de células esfera S462
La inyección subcutánea de 2,5 x 10
5 células de esferas S462 clonales (n = 9) condujo a la formación de tumor sólido visible 1 a 3 meses después de la inyección en 66% de los ratones desnudos. Por el contrario, los tumores sólidos detectables solamente forman en 10% de los ratones nude (n = 10) cuando se inyectó el mismo número de células adherentes S462, este tumor se necesita más de tres meses para formar (Fig. 6A). Histológicamente, los tumores de células adherentes ambas esferas y exhiben características típicas de TMVNP:. En forma de huso, altamente proliferativa como se muestra con un número elevado de células Ki67 positivas, y las células tumorales negativos S100 (Figura 6B) guía
(A) Frecuencia y la hora de la formación de tumores con 2,5 × 10
5 adherente (n = 10, el paso 35) o esfera clonal S462 (n = 9), CD133
+ (n = 9) y CD133
- (n = 5) células inyectadas por vía subcutánea. Se obtuvieron todas las células esfera entre los pasos 8 y 13. adherente frente esferas y adherente frente a CD133 + esferas p & lt; 0,05 *. (B) Histología de los tumores derivados de células adherentes (panel izquierdo) y células esfera mostró que estos tumores se asemejan MPNSTs. H & amp; E muestra células típicas de husillo de forma de TMVNP (flechas, panel superior), que son altamente proliferativo Ki-67 immunstaining (flechas, panel central) y negativas para S100 (panel inferior). Barra = 200 micras, se aplica para todas las micrografías. esferas secundarias (C) Las células disociadas de ratones tumores formados
in vitro gratis (esfera secundaria representativa 3 semanas después de la siembra de células individuales). Bar = 20 micras.
Cuando 2,5 × 10
5 células CD133 + de esferas (n = 9) y esferas CD133- (n = 5) fueron inyectados por vía subcutánea en ratones desnudos, sólo las células CD133 + conducido a la formación de tumor visible en el 55% de los ratones, entre dos semanas y 1 mes después de la inyección (Fig. 6A). Cuando (n = 3) se inyectaron 5,6 × 10
4 células CD133 + de esferas, tumores formados en el 66% de los ratones y se llevaron alrededor de un mes para desarrollar. Por el contrario, el 2,5 × 10
5 células de esferas CD133- no dio lugar a ninguna formación de tumores visibles; y un mayor número de células (5 × 10
6, n = 7), dirigida a los tumores visibles en sólo el 14% de los ratones y aproximadamente 2 meses después de la inyección.
Cuando los tumores de los ratones estaban recién disociadas y chapado como células individuales en condiciones de cultivo de células madre, esferas redondas aparecieron dentro de los dos días (Fig. 6C). Estas esferas se podrían cultivar clonalmente sobre pasajes consecutivos. La frecuencia de la formación de la esfera de las células de los tumores desarrollados en ratones fue de aproximadamente 32%, superior a la de las células S462 adherentes en el paso 35 (que era aproximadamente el 17%), mientras comparable al de las células S462 adherentes en el paso 2, que fue de alrededor de 31%.
Discusión
En este estudio, hemos aplicado las condiciones de cultivo optimizadas para las células madre neurales, para el enriquecimiento de las células madre, como el cáncer de MPNSTs. Hemos tenido éxito en la obtención y el enriquecimiento de estas células de una línea celular establecida TMVNP, S462, y así demostramos que existen células madre, como el cáncer en TMVNP. Esferas podrían obtenerse a partir de células individuales MPNST S462, que indica que son verdaderos esferas proliferantes y no agregados de células. Esferas también se obtuvieron de S462 primaria en el paso 2, con una frecuencia aún más alta. Por tanto, es poco probable que las células madre similares se obtuvieron, enriquecido y se estudió un artefacto de cultivo a largo plazo.
No pudimos obtener esferas clonales que podrían ser pasados de una segunda línea de células TMVNP, varios primaria culturas MPNST, tumores recién disecados o plexiforme y neurofibromas cutáneos [12]. tumores MPNST son clínicamente, genéticamente e histopatológicamente muy heterogéneo [1]. Es posible que sólo la línea S462, que se derivó de un tumor muy agresivo y recurrente, contiene una proporción adecuada de las células similares a células madre que son lo suficientemente inmaduros para permitir la formación de esferas clonal en las condiciones seleccionadas. Esferas de algunos otros MPNSTs podrían ser pasados a densidades más altas de hasta 12 veces, lo que indica un cierto potencial de las células madre similares. Las condiciones de cultivo que hemos aplicado en este estudio son poco probable que sea óptimo para las células madre, como el cáncer en TMVNP. Esto también se puede reflejar en las dificultades para establecer cultivos permanentes de tumores frescos, incluso en condiciones normales de cultivo con suero ([14].
Células
S462 expresaron una serie de marcadores de células progenitoras o madre, incluyendo nestina, NFGR CD133 y CD34 en diversos grados, lo que sugiere que estas células son menos diferenciadas y más inmaduros. la expresión de estos marcadores se ha incrementado sustancialmente en los ámbitos clonales apoyan nuestra hipótesis de que el tallo-como las células se enriquecen en las esferas. esferas CD133 + S462 tenían una mayor frecuencia de formación de esferas
in vitro
y la formación de tumores en ratones cuando se compara con las esferas CD133-. Este marcador marca así como las células madre cancerosas en TMVNP en cierta medida, pero no exclusivamente.
madre de la cresta neural células tienen la capacidad de auto-renovación y diferenciarse en un número de linajes incluyendo las neuronas, glia, y miofibroblastos [15], [16]. En presencia de respectivos factores de crecimiento, las células de las esferas clonales MPNST S462 diferenciadas en células que se asemejan Schwann células, SM /Fb y neuronas. Esta diferenciación del linaje era mucho menos profundo y menos frecuente en las células adherentes MPNST. Estos hallazgos sugieren que las células no diferenciadas o indiferenciadas, que poseen un mayor potencial de diferenciación de células diferenciadas, se enriquecen en esferas S462 clonales. De hecho, CD34, un glycophosphoprotein, normalmente expresado por las células endoteliales maduras, mesenquimales y células progenitoras hematopoyéticas, y más importante en las células madre neurales también se localiza en los tumores MPNSTs, probablemente en fibroblastos endoneurial [17], [18]. El aumento de la expresión de este marcador en las esferas indica que un número creciente de células está asociada con un fenotipo más diferenciado en las condiciones de células madre utilizadas. También es posible que las condiciones de cultivo de células madre neuronales inducen o promueven la desdiferenciación de las células o la proliferación de células madre similares presentes en la población parental S462.
Auto-renovación es una de las propiedades de las células madre similares. El aumento en la formación de esfera con pases en medios de células madre sugiere que la frecuencia de células madre como dentro de las esferas aumenta con el crecimiento, como sería de esperar si estas condiciones de cultivo seleccionar para, o soporte aumento de la proliferación o la supervivencia, de tallo-como Células. Por lo tanto, un enriquecimiento de las células madre del cáncer en esferas junto con proporciones reducidas de células diferenciadas es la causa probable para el aumento de la potencia tumorigénico de las esferas. Curiosamente, como se ve en TMVNP nativa, los tumores derivados de ratón mostraron de hecho ninguna expresión de la diferenciación de las células de Schwann marcador S100.
Nuestros resultados proporcionan evidencia de la existencia de la madre de cáncer o las células madre similares a células en TMVNP. Estas células crecen esferas como clonales para múltiples pasajes en condiciones culturales de células madre neuronales, tallo expresa marcadores de células progenitoras /e inducen la formación de tumores en ratones desnudos inmunodeficientes a una frecuencia sustancialmente más alta que las células adherentes. El estudio de estas células puede contribuir a una mejor comprensión de la biología y la patogénesis de TMVNP y puede permitir la identificación de objetivos específicos para el desarrollo de terapias.
Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias a los Departamentos de Neurocirugía, Oncología y Neuropatología (Centro Médico Universitario Hamburg Eppendorf, Hamburgo, Alemania) por permitirnos usar sus instalaciones. Un agradecimiento especial al Dr. H. Guenther (Departamento de Neurocirugía), K. Kluge, A. Schaefer y C. Horn, (instalación de citometría de flujo del Departamento de Oncología y Hematología) y M. Haberkorn (Departamento de Neuropatología) por darnos asesoramiento científico y técnico. También estamos muy agradecidos con el Profesor R. Friedrich, el Dr. M. Blessmann (Departamento de Cirugía Maxilofacial), el profesor E. Yekebas y el Dr. M. Bockhorn (Departamento de Cirugía) del Centro Médico Universitario Hamburg Eppendorf y el Dr. U. Wahlländer -Danek (neurofibromatosis Clínica, Munich, Alemania), para proporcionar el material tumoral.