metástasis
Extracto
Antecedentes
El cáncer es la principal causa principal de recurrencia de la enfermedad y la alta mortalidad en pacientes con cáncer. Por lo tanto, la inhibición de proceso de metástasis o matar las células cancerosas metastásicas mediante la inducción de la apoptosis es de importancia clínica en la mejora de la supervivencia del paciente de cáncer. Estudios previos revelaron que fucoidan, un polisacárido rico en fucosa aislado a partir de alga marina marrón, es un producto natural con actividad significativa prometedor contra el cáncer. Sin embargo, se sabe poco sobre el papel del estrés del retículo endoplasmático (ER) en la apoptosis celular inducida por fucoidan.
Principales conclusiones
Hemos informado que el tratamiento fucoidan inhibe el crecimiento celular e induce la apoptosis en células de cáncer . Fucoidan tratamientos dieron como resultado la baja regulación de la proteína glucosa regulada 78 (GRP78) en las células MDA-MB-231 células de cáncer de mama metastásico, y de la proteína ER 29 (ERp29) en las células de cáncer de colon HCT116 metastásicos. Sin embargo, el tratamiento fucoidan promovido ER Ca
2 + II (CaMKII) de fosforilación, proteína X asociada a Bcl (Bax) y caspasa 12 expresión en células MDA-MB-231, pero no en las células HCT116 dependiente de calmodulina quinasa dependientes. En ambos tipos de células cancerosas, fucoidan activa la fosforilación del factor de iniciación eucariótico 2 alfa (p-eIF2α) \\ CCAAT /potenciador de la proteína homóloga de proteínas (CHOP) en cascada pro-apoptótica de unión y se inhibe la fosforilación de la quinasa inositol-1 requiere (p- IRE-1) \\ proteínas de unión de empalme 1 (XBP-1) en cascada favor de la supervivencia X-box. Por otra parte, CHOP caída evita el daño del ADN y la muerte celular inducida por fucoidan.
Conclusión /Importancia
El fucoidan ejerce su función antitumoral mediante la modulación de las cascadas de estrés ER. Contribución de estrés ER a la apoptosis de las células inducida por fucoidan aumenta nuestra comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a su actividad anti-tumor y proporciona evidencia de la aplicación terapéutica de fucoidan en el cáncer de
Visto:. Chen S, Zhao Y, Y Zhang, Zhang D (2014) Fucoidan induce la apoptosis de células cancerosas mediante la modulación de las cascadas del retículo endoplasmático estrés. PLoS ONE 9 (9): e108157. doi: 10.1371 /journal.pone.0108157
Editor: Jia Yu-Chang, de la Universidad de Medicina de Taipei, Taiwán
Recibido: 18 de abril de 2014; Aceptado: August 17, 2014; Publicado: 18 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81370524). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer es una enfermedad crónica con una alta mortalidad debido a su alta capacidad metastásica y la resistencia a la quimioterapia y la radioterapia. A pesar de los sofisticados estrategia terapéutica para el tratamiento del cáncer, el tratamiento no es 100% eficaz contra el cáncer diseminado /metastásico. Hasta hace poco, la mayoría de los fármacos terapéuticos de destino en las células cancerosas proliferativas para el tratamiento de tumores primarios. Dado que la mayoría de las muertes por cáncer son el resultado de la enfermedad metastásica, la comprensión de los mecanismos de la metástasis del cáncer y el desarrollo de fármacos para el cáncer metastásico son de hecho áreas de la biología de células de cáncer y la terapia del cáncer emergente.
El desarrollo de productos naturales para la terapia del cáncer es una estrategia prometedora para el tratamiento del cáncer y la prevención. Por ejemplo, el fucoidan, un polisacárido rico en fucosa, está aislado del alga marrón como
Cladosiphon okamuranus
y
Fucus evanescens
[1], [2]. Fucoidan es estructuralmente similar a la heparina, con un porcentaje sustancial de L-fucosa [3], [4]. Estudios recientes han demostrado sus diversas actividades biológicas, incluyendo anti-inflamatorios, anti-coagulante [5], anti-VIH y anti-cáncer [6] - [9] actividades. Significativamente, fucoidan muestra una alta eficacia en el tratamiento de una variedad de cánceres, incluyendo cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, hepatoma y leucemia [7], [8], [10] - [12]. Su actividad anti-tumor se ejerce mediante el control de múltiples vías de señalización en las células cancerosas. Se encontró que el fucoidan puede inducir la apoptosis de células
vía
la activación de la caspasa-cascadas, extracelular regulada por señal quinasa activada por mitógenos proteína quinasa (ERK1 /2 MAPK) y la inactivación de p38MAPK y fosfatidilinositol 3-quinasa ( PI3 K) /proteína cinasa B (Akt) [7], [11], [13]. Además, el fucoidan también inhibe la vía /β-catenina vía para disminuir la expresión de ciclina D1, lo que lleva a la detención del ciclo celular
in vitro
y
in vivo
[7], [14]. Los
in vivo
estudios demostraron que el crecimiento tumoral fucoidan suprimido y ha disminuido significativamente la metástasis de pulmón de células 4T1 cáncer de mama [14] - [16]. En conjunto, estos resultados apoyan el desarrollo potencial de fucoidan como un medicamento contra el cáncer. No obstante esto, los mecanismos de acción que el fucoidan ejerce sobre la apoptosis de las células cancerosas no han sido completamente entendidos. En particular, se sabe poco acerca de la implicación del estrés del retículo endoplasmático (ER), una señalización central que define el destino de la célula, en la actividad antitumoral mediada por fucoidan.
ER desempeña un papel crucial en Ca
2 + homeostasis y la fisiopatología celular. La acumulación de proteínas mal plegadas o no plegadas dentro de la sala de emergencias o Ca
2 + agotamiento tienda induce estrés ER y desencadena la respuesta de la proteína desplegada para mantener la homeostasis ER [17]. En condiciones de reposo, la proteína chaperona ER, la proteína glucosa regulada 78 (GRP78), sella el poro de la translocon en el ER y por lo tanto, reduce ER Ca
2+ fugas [18]. En situaciones de estrés ER, GRP78 se libera de la translocon y desencadena ER Ca
2 + agotamiento [19]. Citosólica de Ca
2 + se une a la calmodulina para activar Ca
2 + \\ dependiente de calmodulina quinasa II (CaMKII) de señalización, lo que lleva a ER apoptosis de las células inducida por el estrés a través de la activación de la vía de la apoptosis mitocondrial [20].
ER estrés también conduce a la disociación de GRP78 de los complejos formados con la parte luminal de las proteínas de membrana ER, ARN proteína quinasa (PKR) -como ER-quinasa (PERK), que requiere inositol-quinasa 1 (IRE1) y la activación del factor de transcripción 6 (ATF6), dando como resultado la autofosforilación del PERK y IRE-1 y translocación de ATF6 al aparato de Golgi para la escisión [21]. Estas alteraciones provocan la activación de sus vías de señalización aguas abajo. Por ejemplo, el PERK activado fosforila eucariótica factor de iniciación 2 alfa (eIF2α) para atenuar la traducción de proteínas y reducir la sobrecarga de proteína ER [22]. estrés ER prolongada también induce ATF4 y CCAAT /proteína de unión a proteína homóloga (CHOP) expresión potenciador, que conduce a la apoptosis [17]. Para hacer frente al estrés ER, que se activa IRE-1 actúa como una endonucleasa de aumentar la proteína de unión 1 (XBP-1) de empalme X-box, lo que conduce a la regulación positiva de genes importantes para la supervivencia celular durante el estrés ER [23]. activación ATF6 se produce después de la escisión proteolítica en el Golgi, seguido de su translocación nuclear de la respuesta de estrés adaptativo [24]. Hasta cierto punto, el estrés ER desempeña un papel crucial en la sintonización estos saldos de señalización para manipular el destino de la célula [17].
En este estudio, se investigó si el estrés ER implica la apoptosis celular inducida por fucoidan en el altamente invasiva y metastásicas MDA-MB-231 células de cáncer de mama células [25] y el cáncer de colon HCT116 [26]. Hemos demostrado que el tratamiento fucoidan regula la ER Ca
2 + fosforilación -modulated de CaMKII de una manera dependiente del tipo de célula. Sin embargo, el tratamiento de fucoidan en ambos tipos de células cancerosas activa el p-eIF2 \\ CHOP cascada pro-apoptótica y se inhibe la p-IRE-1 /XBP-1s favor de la supervivencia en cascada. Por lo tanto, el estrés ER contribuye, al menos en parte, a la apoptosis celular inducida por fucoidan.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
humano MDA-MB-231 células de cáncer de mama y las células de cáncer de colon HCT116 se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se cultivaron en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS, Invitrogen, Eugene, OR). Las células se cultivaron a 37 ° C con 5% de CO
2 en un incubador humidificado
Los anticuerpos y reactivos
Los siguientes anticuerpos fueron utilizados en este estudio:. Conejo anti-GRP78 y conejo anti-ERp29 de Novus Productos Biológicos (Littleton, CO); conejo anti-eIF2a, ratón anti-fosfo-eIF2a (S51), de conejo anti-p58
IPK, conejo anti-escindido de PARP, conejo anti empalmado XBP-1 (XBP-1), de conejo anti exfoliados caspasa ratón 3y anti-GADD153 /CHOP de señalización celular Tecnología (Beverly, MA); ratón anti-β-actina de Sigma-Aldrich (St Louis, MO); conejo anti-CaMKII, conejo anti-Bax, conejo anti-caspasa 12 y conejo anti-fosfo-CaMKII (T286) de Abcam (Cambridge, MA).
Fucoidan aislado de
Fucus vesiculosus
se adquirió de Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO). Las completas, comprimidos de cóctel inhibidor de la proteasa libre de EDTA se obtuvieron de Roche Diagnostics (Indianápolis, IN). inhibidores de cóctel de fosfatasa I y II y tapsigargina (TG) fueron de Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania). Lipofectamine 2000 reactivos de transfección fueron suministrados de Invitrogen (Eugene, OR). Salubrinal fue comprado a Tocris Bioscence (Ellisville, MO).
El crecimiento celular y la viabilidad
El crecimiento celular se evaluó mediante la CellTiter96 Una solución acuosa Ensayo de proliferación celular (Promega, Madison, WI). En resumen, las células se sembraron por triplicado en placas de 96 pocillos a una densidad de 5000 células por pocillo en 100 l del medio correspondiente. Al día siguiente, los medios se aspiraron y se reemplazaron con medio fresco que contenía las concentraciones indicadas de fucoidan (0, 10, 50, y 100 mg /ml). Las células se incubaron bajo condiciones de cultivo estándar para un máximo de 4 días, y se evaluaron las células viables. La absorbancia a 492 nm se midió utilizando un lector de microplacas F200 Infinito (TECAN Austria GmbH, Grödig, Austria). tres experimentos se realizaron para cada tratamiento. La viabilidad celular también se examinó usando el ensayo de exclusión de azul de tripano.
apoptosis de la célula
apoptosis de las células fue ensayada mediante el etiquetado final dUTP nick transferasa mediada (TUNEL) ensayo de desoxinucleotidil terminal [27]. Brevemente, las células (2,5 × 10
4 por pocillo) se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos con cubreobjetos y se añadieron 24 h más tarde, 2 ml de medio fresco con fucoidan (conc. 100 g /ml) a cada pocillo . Las células se trataron después durante 3 días, seguido de la tinción de TUNEL utilizando el kit de sistema de DeadEnd fluorométrico TUNEL (Promega, Madison, WI) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los portaobjetos se montaron utilizando antifade líquido de montaje que contiene DAPI. Green (núcleo de la célula apoptótica) y (DAPI, células totales) azules señales fluorescentes fueron capturados utilizando una Olympus Fluoview FV1000 láser confocal de barrido microscopio (Olympus, Japón). El porcentaje de células apoptóticas se expresó como una media de cinco campos seleccionados al azar (300 células por campo). Además, la apoptosis celular también se examinó por inmunotransferencia de la expresión de caspasa 3 escindida y se escindió de poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP).
ARN de interferencia
pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) de orientación CHOP (CHOP siGENOME SmartPool, Dharmacon, Lafayette, CO) y siGENOME no siRNA dirigidos se utilizaron para CHOP desmontables y control, respectivamente. Brevemente, las células fueron cultivadas en placas de 6 pocillos y se transfectaron de forma transitoria a 60-80% de confluencia con siRNA a una concentración final de 25 nM usando Lipofectamine 2000 reactivo de transfección (Invitrogen, Eugene, OR) según las instrucciones del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se incubaron con medio fresco solo o medio con 100 g /ml de fucoidan. Después de 3 días después del tratamiento, las células fueron cosechadas para el análisis de la viabilidad usando el ensayo de exclusión de azul de tripano y la evaluación de los niveles de CHOP y escindidos de PARP mediante inmunotransferencia.
inmunotransferencia análisis
Las células a 70-80% confluencia se trataron con fucoidan a diversas concentraciones (0, 1,0, 5,0, 10, 50 y 100 g /ml, respectivamente) durante 3 días. Ambos se cosecharon las células unidas y en suspensión para la extracción de proteínas. Los lisados celulares se extrajeron con tampón RIPA (1% de Igepal, 1% desoxicolato de sodio, cloruro de sodio 0,15 M, sulfato de sodio 0,01 M, pH 7,2 y EDTA 2 mM), suplementado con inhibidores de la proteasa (Roche Diagnostics) y los inhibidores de cóctel de fosfatasa I y II (1:100, Sigma-Aldrich). Western Blot se llevó a cabo como se describe [28]. Brevemente, las proteínas totales (30 g /carril) se separaron por 10% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con leche desnatada 5% en tampón de solución salina tamponada con Tris con 0,1% de Tween 20 durante 1 h a temperatura ambiente y se sondearon con los anticuerpos primarios indicados. De cabra anti-ratón peroxidasa de rábano picante (HRP; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) o cabra anti-conejo HRP anticuerpo secundario (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) se utilizó como anticuerpos secundarios. La señal quimioluminiscente se desarrolló con Supersignal West Pico Substrato quimioluminiscente (Pierce, Rockford, IL). intensidad de la señal se analizó usando el software GeneTools (Syngene, Frederick, MD). El nivel de β-actina se utilizó como control de carga.
Los análisis estadísticos
Una forma de análisis de varianza (ANOVA) y Estudiantes de
t
pruebas se utilizaron para analizar la significación de las diferencias. p & lt; 0,05 fue considerado como significativo. Todos los experimentos de cultivo de células se realizaron por triplicado. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE) y se suministran en la Tabla S1.
Resultados
induce apoptosis de las células de tratamiento Fucoidan
Estudios previos demostraron una inhibición significativa de la fucidan en metástasis tumorigénesis y cáncer de células [14] - [16]. Para comprender el efecto de fucoidan sobre el crecimiento celular y la apoptosis, tanto los metastásicas MDA-MB-231 células y células HCT116 se trataron con fucoidan a la concentración indicada para un máximo de 4 días y el crecimiento de las células fue ensayada. Como se muestra en la Fig. 1A, el crecimiento celular se inhibió significativamente cuando las células se trataron con & gt; 50 mg /ml en fucoidan día 3 para las células MDA-MB-231 y en el día 2 para las células HCT116, en comparación con sus respectivas células de control. Además, para determinar si la apoptosis de células atribuye a la inhibición del crecimiento celular, ambos tipos de células se trataron con fucoidan (100 mg /ml) durante 3 días y la apoptosis celular se evaluó mediante el examen de la expresión de caspasa 3 escindida y TUNEL. Como se indica en la Figura 1B, el tratamiento de fucoidan a dosis altas (
por ejemplo
., 100 mg /ml) causó una alta expresión de la caspasa 3 escindida en ambos tipos de células. TUNEL análisis también mostró una de aproximadamente & gt; 25% de células sometidas a daño en el ADN en las células tratadas con fucoidan (figura 1C.). Por lo tanto, el tratamiento resultó en fucoidan notable daño del ADN en estas células.
El crecimiento celular (A). Las células fueron tratadas con fucoidan a la concentración indicada y se evaluaron las células viables usando el One Solution ensayo de proliferación celular CellTiter96 acuosa. (B) de la caspasa 3 de activación. Las células fueron tratadas con fucoidan durante 3 días y la expresión de caspasa 3 escindida se examinó por transferencia de Western. (C) TUNEL. Para el análisis de TUNEL, las células fueron tratadas con fucoidan a 100 g /ml durante 3 días y la apoptosis de las células se analizó usando el ensayo de TUNEL. Las células apoptóticas (verde) se contaron en cinco campos seleccionados al azar (300 células por campo) y presentados como media ± SD de porcentaje de células apoptóticas sobre el total de células (DAPI, azul). Los datos se expresan como media ± SD en los experimentos por triplicado. * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01
Fucoidan tratamiento conduce a la diferente respuesta de ER en MDA-MB-231 y las células HCT116
Para investigar si el estrés ER está implicado en la apoptosis celular inducida por fucoidan , examinamos inicialmente la expresión de marcadores de estrés ER incluyendo GRP78 y ERp29. Curiosamente, a diferencia de las células tratadas con inductor de estrés ER TG ,, la expresión de GRP78 se redujo en las células MDA-MB-231 tratadas con fucoidan sin efecto sobre la expresión ERp29 en estas células, con respecto a las células control (sin tratamiento fucoidan ) (Fig. 2A). En cambio, la expresión de ERp29 se redujo significativamente en las células HCT116 fucoidan tratados, mientras que la expresión de GRP78 se aumentó ligeramente cuando las células fueron tratadas con 5 g /ml, seguido de reducción con altas dosis de los tratamientos (Fig. 2B). GRP78 tiene múltiples funciones en las células cancerosas tales como ser responsable de la proliferación celular, protegiendo las células de la apoptosis y la aceleración de ER-asociado degradación de las proteínas mal plegadas de las proteínas [29]. Estudios recientes también han abordado el papel de ERp29 en la supervivencia de las células cancerosas contra la quimio y la radioterapia [27], [30]. La reducción de la GRP78 o ERp29 en las células tratadas con fucoidan sugiere que fucoidan induce la muerte celular mediante la supresión de la expresión de estas proteínas de supervivencia en las células MDA-MB-231 y HCT116.
Las células a 70-80% de confluencia fueron tratadas con fucoidan a las concentraciones indicadas durante 3 días y se recogieron tanto las células unidas y suspendidas para el análisis de expresión de la proteína. (A) La expresión de GRP78, pero no ERp29, fue inhibida por fucoidan en las células MDA-MB-231; (B) La expresión de ERp29 fue significativamente atenuada por fucoidan en las células HCT116, mientras GRP78 se redujo sólo ligeramente (~ 1,5 veces) en las células tratadas con fucoidan en & gt; 50 mg /ml. Como control positivo, las células fueron tratadas con inductor de estrés ER TG (2,0 M) durante 24 h. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos. * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01
Resultados de tratamiento Fucoidan en la activación de p-CaMKII \\ Bax y caspasa 12 expresión en una célula contexto manera dependiente
Debido a GRP78 se pueden unir con el translocon en la membrana del RE para bloquear Ca
2 + liberación en el citosol [18], el próximo analizó si la reducción de la GRP78 en las células MDA-MB-231 podría inducir Ca
2 + mediada por la activación de CaMKII y la expresión de las proteínas relacionadas con la apoptosis Bax. Como se muestra en la Fig. 3A, la fosforilación relativa de CaMKII (p-CaNKII /CaMKII) se aumentó progresivamente en las células tratadas con fucoidan en comparación con las células control (sin tratamiento fucoidan), lo que indica una activación de
2 + \\ señalización CaMKII Ca. En línea con esto, la expresión de Bax también se incrementó significativamente y se mantiene a un nivel similar en las células tratadas con fucoidan (10-100 mg /ml). En contraste, en comparación con las células de control, la fosforilación relativa de CaMKII (p-CaNKII /CaMKII) fue moderadamente aumentó (~ 1,5 veces) en las células HCT116 tratadas con 10 mg /ml de fucoidan, seguido por reducción en aquellas células tratadas con 100 mg /ml de fucoidan. En general, el tratamiento fucoidan en las células HCT116 no causó un cambio significativo de la fosforilación relativa de CaMKII y la expresión de Bax (Fig. 3B). También se encontró que la expresión de la caspasa 12 fue altamente aumentó con la concentración fucoidan en las células MDA-MB-231, pero no en las células HCT116 (Fig. 3C). Además, no se observó escisión de caspasa 12 cuando sondeo con anticuerpo. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que fucoidan regula Ca
2 + \\ señalización CaMKII y caspasa 12 de una manera dependiente del tipo de célula.
(A) la fosforilación relativa de CaMKII y la expresión de Bax se incrementaron progresivamente por fucoidan en las células MDA-MB-231; (B) la fosforilación relativa de CaMKII fue moderadamente estimulada (~ 1,5 veces) a 10 mg /ml, seguido de la inhibición (~1.4 veces) de fucoidan a 100 mg /ml. Bax expresión no se vio afectada por fucoidan en células HCT116. (C) La caspasa 12 expresión y escote. Fucoidan induce eficazmente la caspasa 12 expresión en células MDA-MB-231, en lugar de en las células HCT116. No escisión de la caspasa 12 se encontró en ambos tipos de células. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos. * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01
inhibe el tratamiento Fucoidan p-IRE-1 \\ XBP-1 empalme
Sobre la base de las conclusiones anteriores que el fucoidan puede modular la respuesta de estrés ER en las células cancerosas , el próximo examinó si el fucoidan regula diferencialmente IRE-1 \\ XBP-1 s, una respuesta de supervivencia celular en cascada definir
a través de
hasta la regulación de la expresión de chaperonas para la capacidad de plegado ER [31], y el PERK \\ P -eIF2α \\ CHOP cascada pro-apoptótica [17]. En comparación con el control, fucoidan inhibió significativamente la expresión de XBP-1 en ambos tipos de células (Fig. 4A, B). Esto fue causado por la fosforilación disminuida de IRE-1 en las células tratadas con fucoidan, debido a que las funciones activadas p-IRE-1 como una endonucleasa que generan empalmados XBP-1 de XBP-1 mRNA no empalmado bajo estrés ER [32]. En contraste con las células tratadas con TG que demuestran una mayor IRE-1 fosforilación y la expresión de XBP-1s (Fig. 4A, B), estos resultados indican un efecto inhibidor de fucoidan en ER relacionada con el estrés cascada de la supervivencia celular. Sin embargo, no se observó un cambio significativo de P58
IPK, uno de los objetivos de abajo de XBP-1 y ATF6 [23], en las células tratadas con fucoidan.
Las células fueron tratadas con fucoidan como se describe en el "Materiales y Métodos" y en la Figura 2. la fosforilación de IRE-1 (p-IRE-1) y XBP-1 de empalme se redujeron notablemente por fucoidan tal como se evaluó mediante inmunotransferencia. Su objetivo abajo, p58
IPK, no se redujo posteriormente. Los datos se expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos. Tenga en cuenta que las células TG-tratada (2,0 M, 24 h) mostró un aumento del p-IRE-1 y XBP-1 en ambas células. * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01
Fucoidan activa la fosforilación eIF2α y regula al alza la expresión CHOP
La fosforilación de eIF2α es un mecanismo clásico para la regulación negativa de la síntesis de proteínas global para hacer frente al estrés ER [33 ]. Sin embargo, el estrés ER excesiva también promueve la muerte celular
a través de la regulación positiva de
ATF4 \\ CHOP en cascada [17]. Por lo tanto, se especula que esta cascada probablemente ya está activado para participar en la apoptosis celular inducida por fucoidan. De hecho, de acuerdo con las células tratadas con TG, se indujeron progresivamente la fosforilación de eIF2α y expresión de CHOP en una forma dependiente de la dosis en ambos tipos de células (Figura 5A & Amp;. B). Por lo tanto, fucoidan puede inducir ER cascada pro-apoptóticos relacionados con el estrés en estas células cancerosas.
Las células fueron tratadas con fucoidan como se describe en los "Materiales y Métodos" y en la Figura 2. La fosforilación relativa de eIF2α (p -eIF2α /eIF2α) y CHOP expresión se incrementaron notablemente por el fucoidan como se evaluó mediante inmunotransferencia. tratamiento TG (2,0 M, 24 h) inducida por la activación de p-eIF2α y CHOP expresión. Los datos se expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos. * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01
salubrinal tratamiento mejora la fosforilación eIF2α fucoidan activado y CHOP expresión
salubrinal es un inhibidor selectivo de eIF2α desfosforilación e induce la hiperfosforilación de eIF2α inhibiendo GADD34-PP1c complejo [34], [35]. Para evaluar si el tratamiento salubrinal facilita ER cascada de estrés inducida por fucoidan, las células MDA-MB-231 y HCT116 se trataron con salubrinal (50 M) solo o en combinación con fucoidan (100 g /ml) durante 48 horas y la expresión de p- eIF2α y CHOP se examinó. Como se indica en la Figura 6, las células tratadas con salubrinal y fucoidan mostraron una mayor expresión de la fosforilación de p-eIF2α y CHOP que las células tratadas con salubrinal o fucoidan solo. Estos datos indican un efecto estimulante de fucoidan en el salubrinal-inducida p- eIF2α \\ CHOP en cascada.
Las células se trataron con salubrinal (50 M) solo o en combinación con fucoidan (100 mg /ml) durante 48 h . Los lisados celulares (30 g) se aplicaron para el análisis de la expresión de p-eIF2α y CHOP por inmunoblot. ** P & lt; 0,01; *** P & lt;. 0.001
CHOP silencio inhibe la expresión inducida por fucoidan de PARP escindida
Para evaluar si el CHOP fucoidan inducida en ambos tipos de células de cáncer está vinculado a la apoptosis de las células observado, las células se trataron con siRNA CHOP la orientación para reducir sus niveles endógenos o tratado con scramble siRNA como control. Nuestros estudios preliminares mostraron que ambos tipos de células tratadas con 25 nM de ARNsi durante 48 h podría dar lugar a & gt; 70% represión de la expresión CHOP en comparación con los tratados con el control de siRNA. Estas células se trataron a continuación con fucoidan (a 0 o 100 mg /ml) durante 2 días y cortar expresión y se analizaron los daños del ADN (según la evaluación de exfoliados PARP). Como se muestra en la Fig. 7A, el nivel de CHOP se redujo en 70-90% de los controles en ambos tipos de células después del tratamiento. En las células tratadas previamente con ARNsi de control, el tratamiento fucoidan aumentó notablemente la expresión de CHOP y la escisión de PARP sobre las células sin tratamiento fucoidan. En contraste, el tratamiento fucoidan fue incapaz de inducir la expresión de CHOP y la escisión de PARP en las células CHOP-silenciada, lo que indica que el silenciamiento CHOP es capaz de bloquear la expresión inducida por fucoidan de PARP escindida. Estos datos proporcionan evidencia de que CHOP participa en el daño del ADN inducido por el fucoidan.
(A) CHOP desmontables de siRNA inhibe la expresión inducida por fucoidan de PARP escindida. Las células en el 70-80% de confluencia se trataron con CHOP siRNA o scramble siRNA durante 48 h, seguido de tratamiento fucoidan (0 o 100 mg /ml) durante 2 días. Los niveles de CHOP y PARP escindida se evaluaron mediante inmunotransferencia. (B) El silenciamiento CHOP antagoniza la muerte celular inducida por fucoidan. Las células pre-tratadas con CHOP siRNA o siRNA de control fueron tratadas con fucoidan (0 o 100 mg /ml) durante 2 días y la viabilidad de las células se examinó usando el ensayo de exclusión de azul de tripano. La viabilidad celular se expresó como un porcentaje de las células de control sin tratamiento siRNA fucoidan (columna 3 en las células MDA-MB-231; columna 7 en las células HCT116). Tenga en cuenta que CHOP desmontables sola no afecta a la viabilidad celular en ambos tipos de células (columna 1
vs página 3;.. La columna 5
vs página 7). En su lugar, CHOP desmontables notablemente previene la apoptosis celular inducida por fucoidan a 100 g /ml (columna 2
vs página 4 en las células MDA-MB-231;. La columna 6
vs página 8 en las células HCT116. ). Los resultados se interpretan como media (± DE) de tres experimentos. * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01
represión CHOP antagoniza el fucoidan inducida por apoptosis de las células
Para examinar el efecto de CHOP caída en la apoptosis de las células inducida por fucoidan, la viabilidad celular de estas células tratadas fue examinado. En relación con la viabilidad celular de las células de control siRNA sin tratamiento fucoidan (Fig 7B, la columna 3 en las células MDA-MB-231;. La columna 7 en las células HCT116), la viabilidad celular en las células CHOP-silenciado fue similar a la observada en estas células de control (. la Fig. 7B, columna 1
vs página 3; columna 5
vs página 7.), lo que indica que el silenciamiento CHOP sola no podría afectar a la viabilidad de las células. En las células pre-tratadas con siRNA control, el tratamiento fucoidan condujo a la reducción de aproximadamente el 50-60% de la viabilidad celular en comparación con aquellos sin tratamiento fucoidan (Figura 7B, la columna 4
vs página 3;.. La columna 8
vs
7; p & lt; 0,01). Sin embargo, el tratamiento fucoidan sólo causó aproximadamente un 10-20% de reducción de la viabilidad celular en las células CHOP-silenciada (figura 7B, la columna 2
vs
1;... La columna 6
vs página 5) . Es de destacar que la represión de CHOP en ambos tipos de células dado lugar a un aumento significativo de la viabilidad celular después del tratamiento fucoidan en comparación con las células tratadas con el control de siRNA y fucoidan (Figura 7B, la columna 2
vs página 4;.. La columna . 6
vs página 8; p & lt; 0,05). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que desmontables de CHOP podría proteger las células de la apoptosis celular inducida por fucoidan.
Discusión
Fucoidan se ha demostrado ser un agente terapéutico para el tratamiento del cáncer. Estudios mecanicistas revelaron que fucoidan puede suprimir la supervivencia de células de cáncer, tumorigénesis y metástasis mediante la modulación de múltiples vías de señalización [5], [7], [11] - [14]. En el presente estudio, hemos demostrado que el fucoidan modula cascadas de estrés ER en las células cancerosas y la expresión CHOP activado es responsable de la apoptosis celular inducida por fucoidan.
ER estrés desencadena una serie de procesos necesarios para la apoptosis. Uno de ellos es la liberación de ER Ca
2 + tiendas en el citosol para activar el Ca
2 + -señal CaMKII transductor, lo que lleva a la apoptosis a través de: la activación de c-Jun (
i
) N terminal quinasa (JNK) para inducir la muerte del receptor Fas (11); (
ii
) estimulación de Ca
2 + captación por las mitocondrias y la liberación de apoptogens [36]. Por lo tanto, la activación de CaMKII por ER Ca
2 + fuga juega un papel crucial en la apoptosis. Sin embargo, se observó que el tratamiento fucoidan indujo la activación de p-CaMKII en células MDA-MB-231 en lugar de en las células HCT116. Consistentemente, la proteína Bax mitocondrial de apoptosis y la caspasa ER-asociado 12 se incrementaron significativamente en las células MDA-MB-231 tratadas con fucoidan. Teniendo en cuenta que GRP78 se une a ER Ca
2 + y translocon en la membrana del RE para bloquear ER Ca
2+ fugas [18], esto se puede explicar por el hecho de que el tratamiento de fucoidan en las células MDA-MB-231 , no en las células HCT116, causada reducción de la GRP78 citoprotector, lo que conduce a ER Ca
2+ filtrarse en citosol para activar la fosforilación CaMKII. En contraste, no hubo ningún cambio significativo de la fosforilación de CaMKII y Bax y caspasa 12 expresión en las células HCT116 tratadas con fucoidan, aunque la fosforilación CaMKII fue moderadamente reforzada por fucoidan a 10 mg /ml y se inhibe a 100 mg /ml. Esto es probablemente consistente con la observación de que la expresión de GRP78 no se vio afectada significativamente por fucoidan en células HCT116. Sin embargo, el efecto de la regulación a la baja inducida por fucoidan de ERp29 en la reducción moderada de la fosforilación CaMKII en las células HCT116 no debe ser excluida. Además, se ha informado de que el ER-asociado, Ca
2 + inducida por la caspasa 12 de activación también está implicado en ER estrés inducido por la apoptosis [37], la activación sin embargo, no hemos observado de pro-caspasa 12 ( la escisión de la caspasa 12) en las células tratadas con fucoidan, sugiriendo que esta cascada de caspasas no puede ser activado. Debido GRP78 y ERp29 son proteínas ER esenciales en el mantenimiento de la homeostasis y funciones tales como el plegado y la secreción de las proteínas y la degradación de las proteínas mal plegadas ER [29], [38], es plausible que el fucoidan potencia daño en la función de ER a través de la atenuación de la expresión de GRP78 o ERp29 de una manera dependiente del contexto celular, donde los mecanismos precisos es necesario explorar más
ER estrés mediada por vías de señalización están acoplados a dos cascadas principales:. células relacionadas con la muerte-PERK \\ P-eIF2α \\ CHOP cascada y células relacionadas con la supervivencia AFT6 (IRE-1) \\ XBP-1 empalme en cascada [17]. Para hacer frente al estrés ER, XBP-1 mRNA se empalma por las activadas p-IRE-1 para generar XBP-1 [32]. XBP-1 es un factor de transcripción altamente activo y es uno de los reguladores clave de la capacidad de plegado ER [31]. Estudios recientes han demostrado que la prolongación del IRE-1 de señalización durante el estrés ER puede promover la supervivencia de las células [39]. Por lo tanto, la atenuación de esta cascada podría desencadenar la apoptosis celular. De hecho, nuestros estudios demostraron que el tratamiento fucoidan significativamente impedido XBP-1 de empalme a través de la inhibición de la IRE-1 fosforilación.