Extracto
El cáncer se asocia a menudo con la caquexia, síntomas cardiovasculares y la desregulación autonómica. Hemos probado si el cáncer extracardiac afecta directamente a la inervación del miocardio del ventrículo izquierdo. Los ratones inyectados con células de carcinoma de pulmón de Lewis (grupo tumor, TG) o PBS (grupo de control, CG) se analizaron después de 21 días. Se analizó la función cardiaca (ecocardiografía), los niveles séricos de TNF-α e IL-6 (ELISA), las alteraciones estructurales de los cardiomiocitos y su inervación (estereología basada en el diseño) y niveles de ARNm relacionados con la inervación-(RT-PCR cuantitativa). Los grupos no difieren en varios parámetros funcionales. Los niveles séricos de TNF-α e IL-6 fueron elevados en TG. Se redujo la longitud total de los axones en el ventrículo izquierdo. se redujo el número de vesículas de núcleo denso por perfil axón. Disminución del volumen miofibrilar, el aumento de volumen sarcoplásmico y el aumento de volumen de las gotas de lípidos eran indicativos de alteraciones metabólicas de los cardiomiocitos TG. En el corazón, el nivel de mRNA de factor de crecimiento nervioso se redujo mientras que la de receptor β1-adrenérgicos no tuvo cambios en TG. En el ganglio estrellado de TG, los niveles de mRNA de factor de crecimiento nervioso y el neuropéptido Y se redujeron y la de la tirosina hidroxilasa se incrementó. En resumen, el cáncer induce un estado pro-inflamatoria sistémica, una reducción significativa en la inervación del miocardio y un fenotipo catabólico de los cardiomiocitos en el ratón. La reducción de expresión de factor de crecimiento nervioso puede dar cuenta de la inervación miocárdica reducida
Visto:. Mühlfeld C, Das SK, Heinzel FR, Schmidt, Post H, Schauer S, et al. (2011) Cáncer de cardiomiocitos induce la remodelación y Hypoinnervation en el ventrículo izquierdo del corazón alfombrilla. PLoS ONE 6 (5): e20424. doi: 10.1371 /journal.pone.0020424
Editor: Gian Paolo Fadini, Universidad de Padova, Italia |
Recibido: 10 Febrero, 2011; Aceptado: April 26, 2011; Publicado: 26 de mayo de 2011
Derechos de Autor © 2011 Mühlfeld et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el sistema cardiopulmonar Cluster de Excelencia (WK) y por el Verein zur Förderung der Krebsforschung en Giessen eV (CM). SD fue financiado en parte por el programa de doctorado de Medicina Molecular de la Universidad de Medicina de Graz. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la caquexia por cáncer es un síndrome complejo que se manifiesta clínicamente como pérdida progresiva de peso corporal con o sin disminución de la ingesta de alimentos, y se correlaciona con un mal pronóstico [1]. La implicación patológica del corazón en estas condiciones fue descrito como una nueva entidad por Burch et al. [2] y denominado el "corazón caquéctico". Además de los cambios en el ECG y la disminución de tamaño del corazón en las radiografías de tórax, el corazón caquéctico se caracteriza por la pérdida de grasa epicárdica, aumento de gránulos de lipofuscina y la disminución de los cardiomiocitos área de sección transversal a pesar de la función cardiaca en general normal [3], [4] . Además, la masa proteica disminuye como resultado de un aumento del catabolismo de proteínas [5].
Curiosamente, el cáncer se asocia con alteraciones funcionales del sistema cardiovascular, tales como la disminución de la variabilidad de la frecuencia cardíaca en pacientes con leucemia aguda [6], el aumento de descanso frecuencia cardiaca, disminución de la presión arterial en reposo y el aumento de la caída postural de la presión sanguínea en pacientes con carcinoma bronquial [7], y el aumento de incidencia de la insuficiencia autonómica cardiovascular según la evaluación de una variedad de pruebas electrocardiográficos y clínicos en pacientes con cáncer de mama [8], [9] . Recientemente, un enlace se ha planteado la hipótesis de entre el síndrome de fatiga por cáncer (una combinación de disnea, limitación del ejercicio y debilidad muscular) y la insuficiencia cardíaca clínicamente no abierta, lo que sugiere que los síntomas de fatiga que surgen de la disfunción autonómica [10]. Aunque estos estudios apuntan a una participación de la inervación cardíaca en la caquexia por cáncer claridad, los estudios sistemáticos sobre este tema se carece hasta el momento.
La inervación de los ventrículos predominantemente consta de axones posganglionares simpáticas aunque en un grado menor, también axones parasimpáticos posganglionares y sensoriales están presentes [11], [12]. A nivel microscópico de luz, se necesita inmunohistoquímica para visualizar las fibras nerviosas mielinizadas cardíacos. Cada fibra nerviosa puede consistir en uno o más de los axones, el número de los cuales sólo se pueden determinar mediante microscopía electrónica. Además de la noradrenalina del neurotransmisor clásico, neuronas simpáticas también contienen neuropéptidos que se producen en la perikarya y almacenados en estructuras vesiculares que se denominan vesículas grandes de núcleo denso (LDCV). LDCV se transportan a través de la anterogradely axón y se libera tras la explosión o de alta frecuencia de disparo [13]. En el caso de los axones simpáticos cardíacos, LDCV contiene predominantemente neuropéptido Y (NPY) [14].
Aquí, la hipótesis de que la caquexia del cáncer se asocia con alteraciones estructurales cualitativos y /o cuantitativos de la inervación miocárdica. Con el fin de probar esta hipótesis, se utilizó un modelo de ratón de la caquexia tumoral y examinamos sus características con respecto a los niveles de citoquinas en suero y la función cardíaca. En este modelo, hemos realizado una luz y Análisis de microscopía electrónica detallada del ventrículo izquierdo y empleó métodos estereológicos basadas en el diseño de cuantificar diversas características de los cardiomiocitos y su inervación. Además, los niveles de expresión de ARNm de varias proteínas relacionadas con la inervación cardiaca fueron cuantificados en el corazón y el ganglio estrellado, un ganglio importante suministrar fibras simpáticas al corazón.
Resultados
Animales
Desde el punto de tiempo de la implantación del tumor hasta el final del experimento después de 21 días, los ratones TG perdió 2,32 ± 0,82 g de peso corporal magra, mientras que los ratones en CG ganó 2,11 ± 0,37 g de peso corporal magro (p & lt; 0,001) la validación del modelo de ratón como un modelo de caquexia tumoral. Los tumores mismos tenían un peso promedio de 3,3 ± 0,57 g. No hubo diferencias significativas en el peso del ventrículo izquierdo entre los grupos, sin embargo, la relación entre el ventrículo izquierdo y el peso corporal fue significativamente mayor en TG debido al peso corporal disminuyó (Tabla 1).
ecocardiografía
la Tabla 2 muestra los datos obtenidos mediante ecocardiografía en ratones anestesiados, normothermic. Ninguno de los parámetros varían considerablemente entre los TG y CG que indica una función cardíaca conservada en el grupo del tumor en condiciones de reposo.
TNF-a e IL-6 niveles
Los niveles séricos de TNF-α e IL-6 fueron significativamente elevados en comparación con TG CG (Tabla 3).
RT-PCR cuantitativa
en el corazón, la expresión de la β1-adrenérgicos receptor se mantuvo sin cambios en TG vs CG. Además, la expresión del factor de crecimiento nervioso (NGF) se redujo en los TG en comparación con CG. Los niveles de expresión de ambos receptores de TNF (TNF-R1, TNF-R2) se incrementaron tres veces o más, respectivamente, en TG vs. CG.
En los ganglios estrellados de TG, la expresión de NPY se redujo significativamente, mientras la expresión de la tirosina hidroxilasa, la enzima limitante de la velocidad para la síntesis de noradrenalina, se aumentó tres veces. NGF se downregulated significativamente en los ratones portadores de tumores, pero los cambios fueron menos extensos que los cambios en la expresión transmisor. Ambos receptores de TNF se han mejorado significativamente en los TG vs GC (Tabla 4).
cardiomiocitos morfología
A nivel microscópico de luz, apareció el miocardio normal con cardiomiocitos bien conservados, ampliamente capilares abiertos debido a la fijación de perfusión y el tejido conectivo suave en el intersticio. No había signos de atrofia cardiaca o fibrosis intersticial. Esta observación fue apoyada por el volumen total y el número de cardiomiocitos que no difirió significativamente entre los grupos (Figura 1). Al nivel del microscopio electrónico, los dos grupos mostraron diferencias notables con respecto a sus miofibrillas y su sarcoplasma. Tal como se representa por las micrografías representativos y los datos estereológicos, la fracción de volumen de las miofibrillas se redujo significativamente, mientras que la fracción de volumen sarcoplásmico fue significativamente mayor en TG (Figura 2). El volumen absoluto de sarcoplasma se mejoró significativamente, mientras que la disminución en el volumen total de las miofibrillas no alcanzó significación estadística (p = 0,06), probablemente debido a otros factores como el volumen de los cardiomiocitos y el volumen del ventrículo izquierdo introducen una mayor variabilidad en los datos. No se observaron diferencias en la densidad de volumen nuclear y mitocondrial o volumen (datos no mostrados). Además, en TG un mayor número de gotitas de lípidos de mayor tamaño en el sarcoplasma se observaron que se refleja en un volumen total mayor de gotitas de lípidos en el ventrículo izquierdo (Figura 2). Este aumento en las gotas de lípidos, sin embargo, es demasiado baja para explicar el aumento en el volumen total de
sarcoplásmico.
semithin secciones transversales (1 m de espesor) se tiñeron con azul de toluidina no mostraron diferencias en las dimensiones de los cardiomiocitos entre el control (A) y de los ratones portadores de tumor (B). Sin embargo, la organización subcelular de cardiomiocitos apareció menos densa en el grupo de tumor. secciones longitudinales de parafina (espesor de 5-7 micras) teñidas con tricrómico de Masson-Goldner no proporcionan evidencia de una deposición de colágeno mejorada en los ratones portadores de tumor (D) en comparación con los ratones control (C). La barra de escala para A y B = 10 micras. La barra de escala para C y D = 20 micras.
Microscopio electrónico de miocardio de control (A, C, E) y ratones portadores de tumores (B, D, F). A y B demuestran el aumento del volumen de sarcoplasma y la pérdida de miofibrillas en miocitos más o menos seccionadas longitudinalmente. Barra de escala = 5 micras. C y D muestran claramente el aumento de gotas de lípidos tamaño (LD) y el número en el grupo de tumor en los miocitos en diagonal seccionadas. Barra de escala = 1 m. E y F muestran las fibras nerviosas que contienen tres axones (asterisco) cada uno. No hubo diferencias aparentes en la morfología. Los miocitos vecinos son más o menos cortan transversalmente. Abreviaturas: cap. = Capilares, miofibrillas mf, mi = mitocondrias
lipotoxicidad
Los análisis bioquímicos del contenido de triglicéridos confirmaron el aumento de lípidos en los cardiomiocitos. Malondialdehído y otras sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico son compuestos altamente reactivos que se utilizan como marcadores para el estrés oxidativo. El uso de dos pruebas para medir estas sustancias, no hemos encontrado una diferencia significativa entre el GC y TG (Tabla 5). El punto final de la acción tóxica de los lípidos en el corazón es la apoptosis de cardiomiocitos. Sin embargo, la actividad de caspasa no difirió entre los grupos (Tabla 5). Además, no se encontró ninguna evidencia morfológica de apoptosis de cardiomiocitos mediante microscopía electrónica.
Longitud total y la morfología de los axones de miocardio
La figura 3 muestra la morfología de la inervación miocárdica y la estereologico los datos de la caracterización de los axones. La longitud total de los axones se ramifican entre los cardiomiocitos se redujo a menos de un medio de TG en comparación con CG. Sin embargo, la frecuencia relativa de las fibras nerviosas con un número particular de los axones no varió entre los grupos. Tampoco hubo diferencias en el tamaño de los diámetros de las fibras del nervio aunque hubo una tendencia a una mayor incidencia de los axones con diámetros más pequeños en los ratones tumorales. Curiosamente, el número de neuropéptido almacenar LDCV por perfil axón se redujeron en un 50% en comparación con TG CG.
Ni el volumen de los cardiomiocitos (a, círculos abiertos), ni el volumen del espacio intersticial (A, cuadrados rellenos) fue diferente entre los grupos. Además, el número de cardiomiocitos fue similar entre los grupos (B). El volumen de sarcoplasma (C, cuadrados rellenos), fue significativamente superior en el grupo de tumor mientras que el volumen de las miofibrillas (C, círculos abiertos) tendía a ser más pequeño. Un mayor volumen de gotas de lípidos se encontró en los cardiomiocitos de tumor-cojinete que de los ratones de control (D). Tenga en cuenta la escala logarítmica en el eje y (D). La longitud total de los axones se redujo a aproximadamente un medio en el grupo de tumor (E), mientras que la frecuencia relativa de las fibras nerviosas con un cierto número de axones no difirió entre los grupos (F). El número de LDVC por perfil axón se redujo en el grupo de tumor (G) mientras que el diámetro de los axones fue similar en ambos grupos (H). Cada círculo o cuadrado representa los datos de un animal individual. Las barras horizontales demuestran significa el grupo.
Discusión
El presente estudio examinó la hipótesis de que la exposición crónica a un gran tumor extracardiac provoca alteraciones estructurales y funcionales de la inervación miocárdica en ratones. La hipótesis se basó en varios informes sobre los cambios funcionales del corazón en pacientes que sufren de una variedad de formas de cáncer [6] - [9] y la observación de las lesiones estructurales degenerativas de los cardiomiocitos en la caquexia por cáncer [2]. De acuerdo con nuestra hipótesis, se observó una marcada reducción de la longitud total de los axones que inervan dejó cardiomiocitos ventriculares y el número de orgánulos de almacenamiento de neuropéptidos, LDCV, en estos axones. Asimismo, se observó una disminución del volumen miofibrilar pero aumentamos sarcoplasma y gotas de lípidos volumen en el interior cardiomiocitos. Las alteraciones estructurales fueron acompañados por la reducción de los niveles de expresión de NGF en el corazón y ganglio estrellado, la reducción de expresión de NPY ganglionar pero mejorado tirosina hidroxilasa expresión.
El modelo de ratón de carcinoma de pulmón de Lewis utilizado en este estudio ha sido bien establecida para muchos años [15] y se sabe que causa una caquexia tumoral significativa [16]. En este estudio, el tiempo entre la implantación de las células tumorales y el sacrificio de los animales fue de 21 días; esta duración era suficiente para inducir una carga tumoral de 12 a 15% del peso total del cuerpo y una condición caquéctico simulando el escenario clínico de la caquexia por cáncer. A pesar de los cambios en la masa corporal de los corazones de los ratones TG tenían una masa húmeda similar a los de los ratones CG que contrasta con otros estudios usando tumores sólidos [17]. Estas diferencias pueden ser debido a la menor carga tumoral, la duración del experimento, cepa de ratón o tumor tipo de célula. Como se discute a continuación, los resultados indican claramente estereológicos un fenotipo catabólico de los cardiomiocitos aunque atrofia cardiaca en el sentido de la masa reducida no se produjo. El rendimiento funcional del corazón se evaluó mediante parámetros ecocardiográficos en condiciones de reposo. En general, la función del corazón no difirió entre el GC y TG. Esto está en contraste con un estudio reciente en ratones inoculados con células de colon-26 adenocarcinoma por Tian y compañeros de trabajo [17] que informó de una disminución significativa en la fracción de acortamiento en ratones portadores de tumores en comparación con los ratones control. Sin embargo, su estudio también mostró una morfología diferente infarto incluyendo la fibrosis y la desorganización de las crestas mitocondriales que no se observó en el presente estudio. Por lo tanto, no parecen existir diferencias generales en los modelos animales entre su y nuestro estudio. De acuerdo con otros estudios utilizando el carcinoma pulmonar de Lewis [18], se observó una condición pro-inflamatoria sistémica tal como se caracteriza por elevados niveles séricos de IL-6 y TNF-α. En la caquexia del cáncer humano, una variedad de los niveles de citoquinas se eleva con TNF-α es la citoquina clave [19]. El exceso de citocinas se pueden originar tanto a partir de células tumorales y de células inmunes ser estimulado por señales directas o indirectas del tumor [19]. Las citoquinas pro-inflamatorias, particularmente TNF-α, se sabe que interactúan con el sistema nervioso y por lo tanto pueden influir en el metabolismo neuronal y la supervivencia [20] - [22], sin embargo, nuestros datos no proporcionan una relación de causa-efecto entre la inflamación y la fenotipo neuronal como otros eventos fisiopatológicos están presentes en el modelo de caquexia tumoral que pudiera afectar a la inervación miocárdica (por ejemplo, pérdida de peso).
las principales conclusiones de este estudio son la reducción de la inervación miocárdica y una disminución en LDCV por perfil axón a aproximadamente 50% de los valores de control. Estos datos morfológicos están bien apoyados y complementados por el QRT-PCR análisis que demuestra una disminución en la expresión de NPY en las neuronas del ganglio estrellado, mientras que los niveles de ARNm de la tirosina hidroxilasa se han mejorado en TG. Además, los niveles de expresión de ARNm de NGF se redujeron en el corazón y el ganglio estrellado. La disminución de la longitud total de los axones se ramifican entre los cardiomiocitos es indicativo de cambios atróficos en el sistema nervioso autónomo del corazón. Este nuevo hallazgo confirma nuestra hipótesis y apoya firmemente la participación del sistema nervioso autónomo cardíaco en la enfermedad del cáncer. Una reducción en la longitud total de los axones puede originarse i) a partir de una pérdida de neuronas en el ganglio, ii) desde una pérdida de arborización de cada neurona o iii) a partir de la pérdida de la longitud del axón individual. Nuestro estudio muestra que la reducción de la longitud total del axón se debe principalmente a una disminución de la densidad de la fibra nerviosa, no debido a un número reducido de los axones por la fibra nerviosa. Sin embargo, se observó la disminución de la densidad de la fibra nerviosa a través de todo el ventrículo sin manchas de denervación completa. Por lo tanto, el resultado puede originarse ya sea desde un proceso degenerativo que comienza en la periferia de las ramas de los axones o se basa en un afecto estructural y /o metabólica del cuerpo de la célula nerviosa. Los estudios en ratones homocigotos con mutaciones nulas en el NGF o el gen de la tirosina quinasa del receptor de NGF han demostrado que el mantenimiento de las neuronas y su arborización en el sistema nervioso simpático depende de la alimentación con NGF a partir de los tejidos diana [23]. La expresión reducida de NGF en el corazón y del ganglio estrellado hace que sea muy probable que una falta de NGF juega un papel causal en la reducción de la inervación miocárdica. Curiosamente, también hay pruebas de que las funciones metabólicas de las neuronas son perturbados como se indica por la reducción en el número de LDCV y la expresión de NPY mRNA reducida. En contraste con que contiene catecolaminas pequeñas vesículas, éstas LDCV contienen neuropéptidos que se sintetizan en el soma de las neuronas y se transportan anterogradely a la periferia de los axones. En el corazón, LDCV contienen principalmente NPY que tiene efectos vasoconstrictores y sirve funciones tróficas en cardiomiocitos [24]. Se induce la síntesis de proteínas de los cardiomiocitos [25] y estimula la hipertrofia [26]. La reducción de LDCV contienen NPY puede ser al menos parcialmente responsable del contenido reducido de miofibrillas dentro de los cardiomiocitos. Curiosamente, a pesar NPY se cree que desempeñan un papel importante en la anorexia y la caquexia en base a su reducción central en estas condiciones [16], las mediciones de los niveles plasmáticos de NPY en los pacientes de control y de cáncer humano no revelaron diferencias [27]. Sin embargo, todavía se debate si influyen en este sistema puede atenuar la caquexia por cáncer [28]. El principal neurotransmisor de las neuronas simpáticas (noradrenalina) se sintetiza a partir de la tirosina a través de varios pasos que son catalizadas enzimáticamente. La enzima limitante de la velocidad, la tirosina hidroxilasa, se encontró que estaba aumentada en el ganglio estrellado en TG, que parece ser un mecanismo contra-reguladora a la disminución de la inervación del miocardio. La reducción de las ramas de los axones en el ventrículo izquierdo, por tanto, puede ser contrarrestado por la producción de catecolaminas mejorada y, por tanto, puede explicar por qué no se detectaron diferencias funcionales bajo condiciones de reposo. Por otro lado, un corazón completamente denervado presenta una frecuencia de batido muy constante, pero sin deterioro funcional bajo resto [29] lo que los cambios que funcionales asociados con la pérdida de o inervación miocárdica alterada pueden más bien ser evidentes en condiciones de estrés o por análisis de los parámetros específicos tales como la variabilidad de la frecuencia cardíaca. Por desgracia, debido a la complejidad del modelo (atrofia de los cardiomiocitos, esquelético atrofia muscular, anemia) es casi imposible de realizar una prueba de esfuerzo que distinguir claramente entre los cambios en la inervación miocárdica y otros elementos característicos que cita extracardiacas.
El cardiomiocitos compartimento en los ratones de tumor se caracteriza principalmente por una reducción de las miofibrillas, y un aumento en sarcoplasma y lípidos gotitas. Las investigaciones de la patología de miocardio humano, obtenida a partir de corazones de pacientes que habían muerto a causa de la caquexia por cáncer, había demostrado disminución de área de sección transversal de los cardiomiocitos y un aumento en gránulos de lipofuscina [2], [3]. En parte debido a las diferencias entre especies, estos resultados difieren de los obtenidos en el presente estudio. Por ejemplo, en contraste con los seres humanos, donde la edad está relacionada con un volumen cada vez mayor de la lipofuscina, esto no se produce en gran medida en los cardiomiocitos murinos, probablemente debido a la corta vida de los ratones. La disminución del área de sección transversal de los cardiomiocitos como se describe por Burch et al. [2] es indicativo de la atrofia cardiaca. Sin embargo, en nuestro modelo no hubo disminución en el volumen total o el número de los cardiomiocitos. Esto puede ser debido a un estado de enfermedad más avanzada en los corazones humanos, para el transcurso de tiempo entre la enfermedad comienza y análisis (21 días en ratones frente a meses o años en los seres humanos) y por supuesto debido a diferencias en la complejidad de la enfermedad (sin metástasis en el ratón, solamente caquexia leve). En conejos sometidos a la caquexia por cáncer, no hubo cardiomiocitos apoptóticos en contraste con otros órganos en los que una gran cantidad de células sufrió apoptosis [30]. A nivel ultraestructural, sin embargo, se observó una pérdida de miofibrillas que fue acompañado por un aumento del volumen sarcoplásmico. La disminución de miofibrillas es indicativo de un desequilibrio entre la degradación de proteínas y la síntesis de favorecer el catabolismo de proteínas [5]. Debido al volumen sin cambios de los cardiomiocitos de los cambios en el volumen miofibrilar /sarcoplásmico no pueden ser inducidos por edema celular. Una observación interesante estructural fue el aumento de las gotitas de lípidos que se confirmó por mediciones bioquímicas de los triglicéridos. En la caquexia tumoral, los ácidos grasos se liberan de tejido adiposo y se acumulan en otros tipos de células en los que pueden causar efectos lipotóxico [31], [32]. lipotoxicidad cardiaca implica la generación de especies reactivas de oxígeno y la aparición de las vías de apoptosis [33]. En el presente análisis, la peroxidación de lípidos se evaluó mediante la medición de malondialdehído y compuestos asociados, y la apoptosis se evaluó mediante un ensayo de actividad de la caspasa y la evaluación morfológica. Dado que ninguno de estos parámetros fue significativamente diferente entre TG y CG, llegamos a la conclusión de que las observaciones de este estudio no están relacionados con la lipotoxicidad. Aunque la importancia funcional exacta de las alteraciones ultraestructurales observados de los cardiomiocitos queda por investigar, es muy probable que estos cambios están en relación directa a la falta de estímulo NPY trófica a través del receptor NPY Y5 [34] y puede convertirse funcionalmente relevante si la demanda metabólica del corazón aumenta. Debido a la relativamente grande plasticidad cardiaca estos cambios no necesariamente puede conducir a un deterioro significativo de la función cardíaca [35].
En resumen, este estudio por primera vez demuestra que la caquexia por cáncer se asocia con marcadas alteraciones estructurales de la inervación autónoma del corazón, incluyendo tanto el deterioro de la integridad estructural de la neurona (disminuido longitud total axón) y la pérdida de orgánulo. Al mismo tiempo, la cantidad de lípidos y el número y volumen de las gotas de lípidos aumentaron en los cardiomiocitos y el volumen miofibrilar disminuyeron, lo cual está en línea con el concepto de un soporte trófico continua de los cardiomiocitos por las neuronas autonómicas.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo (GZ 66.010 /0085-II /10b /2009), fue aprobado por el comité de Austria sobre la ética de los experimentos con animales (Bundesministerium für Wissenschaft und Forschung).
Animales
hembra C57BL /6J se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad regular (12 h de luz, 12 h oscuridad) y se mantuvieron en una dieta estándar de laboratorio chow (4,5% w /w de grasa). Los ratones utilizados para la inyección de las células tumorales, así como animales de control fueron 8-9 semanas de edad. Durante la ingesta de alimentos experimentos, así como el peso corporal se controlaron diariamente
Tumor implantación
Los ratones se dividieron al azar en dos grupos:. Los ratones de control no tumoral-cojinete (CG, n = 18) y los ratones que fueron inyectados con células de carcinoma de pulmón de Lewis (TG, n = 18). células de carcinoma se mantuvieron en cultivo celular en medio DMEM rico en glucosa suplementado con 10% (v /v) FBS, 2 mM L-glutamina y 1% de penicilina-estreptomicina. Posteriormente, 2 × 10
6 células LLC, obtenidas de un cultivo celular exponencialmente la proliferación, se inyectaron por vía subcutánea a continuación el cuello del animal. ratones de hermanos fueron inyectados con PBS en el mismo lugar para servir como controles simulados. Tanto los ratones de control y portadores de tumores fueron sacrificados después de 21 días. En conjuntos separados de experimentos, los ratones se usan (i) para la ecocardiografía (n = 4 en el grupo de tumores, n = 5 en el grupo control) y estereología (n = 5 en el grupo de tumores, n = 6 en el grupo control), (ii ) para medir el contenido cardiaca de lípidos, la actividad de caspasa, la peroxidación de lípidos y los niveles de citoquinas en suero (n = 6 en cada grupo), y (iii) para el cuerpo, del ventrículo izquierdo y el peso del tumor y para la reacción en cadena de polimerasa de ventrículo izquierdo y ganglio estrellado de medición ( n = 6 en cada grupo). Las diferencias en el número de animales utilizados para la ecocardiografía y la estereología son causados por la exclusión de los animales que dejó de respirar espontáneamente durante la anestesia (ecocardiografía) o que no se fijaron por perfusión vascular adecuadamente (estereología).
Ecocardiografía
2D guiada ecos en modo M (30 MHz) se obtuvieron a partir de puntos de vista a corto y largo de ejes en el plano de la más grande LV-770 de diámetro utilizando un sistema VS-VEVO Imágenes de alta Resolución (VisualSonics, Toronto, Canadá) equipado con un 30 MHz RMV (en tiempo real microvisualization) cabezal de escaneo. Los ratones fueron ligeramente anestesiados con 2% de isoflurano y se les permitió respirar espontáneamente. El pecho se afeitó, se aplicó gel de acoplamiento acústico, y una almohadilla de calentamiento se utiliza para mantener la normotermia. Los ratones fueron imágenes en una posición de decúbito lateral izquierdo. dimensiones telediastólico y telesistólico del ventrículo izquierdo se midieron a partir de los trazados originales mediante el uso de las convenciones de borde de ataque de la Sociedad Americana de Ecocardiografía. ciento del ventrículo izquierdo fracción de acortamiento se calculó como se describe anteriormente [36].
TNF-α e IL-6 ELISA
Las muestras de sangre fueron tomadas de control de anestesiado y ratones portadores de tumores por retro-orbital punción. El suero se congeló a -20 ° C. Los niveles séricos de TNF-α e IL-6 se midieron utilizando ELISA de TNF-a ReadySETGo (88-7324, eBiosciences, San Diego, EE.UU.) y ratón Il-6 ELISA ReadySETGo (88-7064), eBiosciences, San Diego, EE.UU.) . La placa fue finalmente leer a 450 nm.
medición de triglicéridos
Los triglicéridos fueron extraídos de los tejidos cardíacos de control y ratones utilizando hexane:isopropanol portadores de tumores y se saponifica usando 1% de Triton x-disolvió en cloroformo. Los disolventes orgánicos se evaporaron usando N
2 de gas y el contenido de triglicéridos se midió usando triglicéridos FS kit (Diasys, Alemania) de acuerdo con el manual del proveedor. Los niveles de triglicéridos se normalizaron al peso del tejido.
Medición de la peroxidación lipídica y la actividad caspasa
Para evaluar la presencia de efectos lipotóxico en cardiomiocitos, la peroxidación lipídica se determinó midiendo el malondialdehído y la apoptosis se determinó mediante la medición de la actividad de caspasa
.
tejido cardíaco se lavó a fondo con solución de heparina-PBS que contenía EDTA 1 mM y se homogeneizaron en 500 l de tampón de homogeneización (sacarosa 0,25 M, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, 1 mM deferoxamina mesilato , PMSF 1 mM) a 4 ° C. La concentración de proteína se determinó a través de ensayo de proteínas RC-DC (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) a partir del sobrenadante. La peroxidación lipídica se midió en el sobrenadante utilizando el kit ELISA Oxiselect MDA aducto (STA-332, celulares Biolabs, San Diego, CA, EE.UU.) y el ensayo TBARS (STA-330, celulares Biolabs) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Para la medición de la caspasa 3/7 actividad, 15 a 25 mg de tejido cardiaco se homogeneizaron en 300 l de tampón de homogeneización (25 mM Hepes pH 7,5, 5 mM EGTA, 1 mM Pefabloc SC, 1% de cóctel inhibidor de la proteasa [v /v ]) (P8340, Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) a 4 ° C. El lisado se centrifugó a 13.000 g durante 20 min a 4 ° C. Se recogió el sobrenadante y el contenido de proteína se midió usando el ensayo de proteínas DC (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). la actividad de caspasa se determinó mediante la incubación de proteína de 50 mg en 100 l de la caspasa-Glo®3 /7 reactivo (Promega, Madison, WI, EE.UU.) durante 1,5 horas a 20 ° C y la luminiscencia se determinó usando un luminómetro (BMG LUMIstar Optima Labtec, Offenburg, Alemania).
RT-PCR cuantitativa
ARN total fue extraído de los corazones y las estrelladas ganglios de control y ratones portadores de tumores (n = 6 cada uno) por el reactivo Trizol (Invitrogen , Carlsbad, California, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Un microgramo de ARN total fue transcrito inversamente en cDNA utilizando los ADNc de alta capacidad de revertir kit de transcripción (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (QRT-PCR) se realizó usando cebadores específicos de genes adquiridos de MWG-Biotech (Ebersberg, Alemania) (Tabla 6). 18 s RNA se utilizó como control interno. Todas las reacciones se llevaron a cabo por triplicado. RT-PCR cuantitativa se realizó en un sistema de PCR estándar 7900T rea-ltime (Applied Biosystems) utilizando SYBR verde como el fluoróforo de detección. Los resultados se presentan como niveles relativos de expresión después del cálculo basado en el delta del delta C
T método [37].
fijación del tejido, toma de muestras y procesamiento
Después de ecocardiografía, ratones fueron anticoagulada con heparina 500 IE ip, anestesiados con isoflurano y se sacrificaron por dislocación cervical 3 minutos más tarde. a continuación, se extirpó el corazón, montado en un aparato de Langendorff, perfundidos con paraformaldehído al 4% en tampón fosfato retrógradamente a través de la aorta durante 10 min y se mantiene en paraformaldehído al 4 ° C hasta su posterior procesamiento. Barra de escala = 50 micras.