Extracto
Antecedentes
Las células madre mesenquimales (MSC) promover el crecimiento del tumor mediante la diferenciación en fibroblastos de carcinoma asociado (CAF) y componer el microambiente tumoral. Sin embargo, los mecanismos responsables de la transición de las MSC a los CAF no se conocen bien. Los exosomas regulan las actividades celulares al mediar la comunicación entre células. En este estudio, que tuvo como objetivo investigar si los exosomas derivados de células cancerosas estaban involucrados en la regulación de la diferenciación de las MSC derivada del cordón umbilical humano (hucMSCs) a los CAF.
Metodología /Principales conclusiones
primero demostraron que los exosomas derivados de células de cáncer gástrico induce la expresión de marcadores de CAF en hucMSCs. a continuación, hemos demostrado que los exosomas derivados de células de cáncer gástrico estimularon la fosforilación de Smad-2 en hucMSCs. Además, confirmó que el TGF-β receptor 1 del inhibidor de la quinasa atenuada Smad-2 fosforilación y la expresión de marcadores de la CAF en hucMSCs después de la exposición a los exosomas derivados de células de cáncer gástrico.
Conclusión /Importancia
Nuestros resultados sugieren que las células de cáncer gástrico desencadenan la diferenciación de hucMSCs a CAF por transferencia exosomas mediada por TGF-β y TGF-β /activación de la vía Smad, que puede representar un nuevo mecanismo para MSCs a la transición CAF en el cáncer de
Visto.: Gu J, Qian H, Shen L, Zhang X, Zhu W, Huang L, et al. (2012) Cáncer gástrico exosomas activan la diferenciación de Cordón Umbilical derivan las células madre mesenquimales a los fibroblastos Carcinoma asociado a través de TGF-β /Smad Camino. PLoS ONE 7 (12): e52465. doi: 10.1371 /journal.pone.0052465
Editor: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de junio de 2012; Aceptado: 13 Noviembre 2012; Publicado: December 20, 2012
Derechos de Autor © 2012 Gu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el plan de Investigación Mayor de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (concesión no. 91129718), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (concesión no. 81071421, 31140063), el Programa de Apoyo Científico y Tecnológico de la provincia de Jiangsu (concesión no. BE2010703 ), 333 Proyecto de la provincia de Jiangsu (concesión no. 2009055) y el Equipo de Sci-Tech innovación y el talento de la Universidad de Jiangsu (concesión no. 2008-018-02). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las células tumorales comienzan a moldear su microambiente en la fase temprana de la progresión maligna [1]. informes llevados a cabo han demostrado las interacciones generalizadas entre microambiente del tumor y las células cancerosas, que son críticos para la tumorigénesis y la progresión tumoral [2], [3]. microambiente tumoral podría provocar cambios reversibles en el fenotipo de las células de cáncer y facilitar su diseminación metastásica [4], y cambios en el microambiente del tumor incluso afectar drásticamente la eficacia de la terapia del cáncer. microambiente tumoral se compone de diversos tipos de células, incluyendo fibroblastos de carcinoma asociado (CAF), la infiltración de células inmunes, la sangre y las redes vasculares linfáticos, y las células madre mesenquimales (MSC) [4], [5].
CAF son factores clave en la progresión maligna del crecimiento del cáncer, la vascularización y la metástasis. CAF que expresan la proteína activadora de fibroblastos (FAP) y actina de músculo liso α-(α-SMA) podrían crear un nicho de células cancerosas y promover su motilidad [6], [7]. De hecho, los CAF se someten a un proceso de diferenciación inducida por las células tumorales y desarrollan invasiva y capacidades migratorias [8], [9].
Las células madre mesenquimales son células multipotentes que se pueden aislar a partir de una amplia variedad de tejidos, incluyendo el hueso ósea, tejido adiposo, membrana sinovial, músculo esquelético, hígado, sangre del cordón umbilical, la placenta y del cordón umbilical [10] - [13]. MSCs podrían ser inducidas a diferenciarse en osteocitos, adipocitos, condrocitos y miocitos debido a su capacidad de regeneración y la capacidad multipotentes [14]. MSCs casa para sobrevivir y en los sitios de inflamación y lesión, así como los tumores, lo que contribuye a la formación de estroma asociado al tumor [15]. Los estudios han confirmado que las MSC podrían diferenciarse en miofibroblastos, fibroblastos de carcinoma asociada, fibrocitos o pericitos en las condiciones microambiente tumoral [6], [16], [17]. En nuestros estudios anteriores, hemos demostrado que las MSC de médula ósea y sus exosomas derivados podrían promover el crecimiento del tumor [18], [19]. Sin embargo, sigue siendo en gran medida desconocido el mecanismo responsable de este efecto
.
Las células tumorales interactúan con microambiente tumoral por la interacción célula-célula y mecanismos paracrinos como la producción de una variedad de factores de crecimiento, quimiocinas, y enzimas que degradan la matriz que mejoran la proliferación y la invasión del tumor [20]. Además de los mecanismos conocidos, un nuevo mecanismo que las células tumorales pueden liberar activamente exosomas está emergiendo. Los exosomas tienen una composición particular, lo que refleja su origen y no puede transferir únicamente componentes de la membrana, sino también de ácido nucleico entre diferentes células [21], [22], haciendo hincapié en su papel en la comunicación intercelular [23]. La acumulación de pruebas ha demostrado la contribución de exosomas a un modo celular de comunicación, que conduce a la transferencia intercelular de moléculas [24]. A pesar de que la función reguladora de los exosomas en el sistema inmunológico y su aplicación como vacuna en la inmunoterapia del cáncer es la promesa [25] - [28]., El resultado después de la interacción entre los exosomas cancerosas y las células del estroma no se entiende bien
maligno células revierten MSC a la CAF que contribuyen a promover la progresión tumoral ha animado investigación sobre los posibles mecanismos para su transición. Los estudios han demostrado que al menos el 20% de los CAF se originan en la médula ósea y se derivan de las células madre mesenquimales en modelos de ratón de en el cáncer gástrico inducida por inflamación [16]. La hipótesis de que las células cancerosas se comunicaban con las MSC mediante la liberación de los exosomas y transferencia de proteínas, por lo tanto, la inducción de la diferenciación de las MSC de CAF. En el presente estudio, hemos demostrado que las MSC adquirió un fenotipo CAF tras la exposición a los exosomas derivados del cáncer y la diferenciación de las MSC de CAF se asoció con la activación de TGF-β vía de señalización /Smad.
Materiales y Métodos
se obtuvieron
cultivo celular
Humanos MSC del cordón umbilical como se describe anteriormente [12], [29]. cordones umbilicales frescas se obtuvieron de las madres informadas, que consienten y se procesan dentro de 6 horas. Las cuerdas se enjuagaron dos veces por solución salina tamponada con fosfato (PBS) en la penicilina y la estreptomicina y, a continuación se eliminaron vasos del cordón. Los cables de lavados se cortan en trozos de 1 a 3 mm
2 de tamaño y flotaba en DMEM que contiene 10% de SFB (Invitrogen, EE.UU.), 1% de penicilina y estreptomicina. Los trozos de cable se incubaron a continuación a 37 ° C en aire húmedo con 5% de CO
2 y el medio se cambió cada 3 días después de que el recubrimiento inicial. Cuando las colonias bien desarrolladas de células similares a fibroblastos alcanzaron el 80% de confluencia, los cultivos se trataron con tripsina y se pasaron en nuevos frascos para una mayor expansión. Las características de hucMSCs aislados incluyendo apariencia morfológica, antígenos de superficie, potencial de diferenciación y la expresión génica se investigaron como se describe anteriormente [12]. Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Jiangsu. Se seleccionaron los hucMSCs desde el paso 2 para los experimentos. las células de cáncer gástrico humano (SGC7901 y HGC27) fueron adquiridos de Banco de Células, Tipo Comité Culture Collection (Academia de Ciencias de China). células epiteliales gástricas (GES-1) se compraron de Cwbiotech Company y se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% FBS.
exosoma Aislamiento y purificación
SGC7901, HGC27 y las células epiteliales gástricas (GES-1 ) exosomas derivados fueron aislados y purificados como se describe anteriormente [30], [31]. Brevemente, las células se cultivaron en DMEM suplementado con suero bovino fetal agotado en exosoma 10%. exosomas bovino fetal se separaron por ultracentrifugación durante la noche a 100.000 g durante 16 h usando un rotor de tipo 90 Ti-Angel fijo (Optima L-90K, Beckman Coulter). Los sobrenadantes de cultivos confluentes (3-5 días) se centrifugaron a 2000 g durante 20 min para eliminar las células y los desechos. Y el sobrenadante clarificado se concentra por ultrafiltración a través de una membrana de fibra hueca 100-kDa MWCO (Millipore) a 1000 g durante 30 min. El sobrenadante concentrado se cargó en tubos de centrífuga (Beckman) y underlayed con 30% de sacarosa D
2O cojín /densidad (5 ml) formando una interfase visible y ultracentrifugó a 100.000 g y 4 ° C durante 1 h en un SW-32Ti batientes- cubo del rotor (Optima L-90K, Beckman Coulter). Entonces, tanto los exosomas cojines de densidad de sacarosa (fracción 3) recogidas de los tubos de ultracentrífuga parte inferior y las fracciones nonbanded (fracción 6 y 7), que contienen complejos de proteínas nonmembrane recogidos para su uso como el control exosomas (E-control) se reunieron y se lavaron tres veces a través de un cartucho de fibra hueca en miniatura 100-kDa (Millipore) a 1000 g durante 30 min como se describió anteriormente. El contenido de proteína se midió usando el kit de ensayo BCA (Pierce). Los exosomas se esterilizaron a través de un filtro de 0,22 micras cápsula (Millipore) y se almacenaron a -70 ° C hasta su uso [30].
Electron Microscopy
Una gota de exosomas (aproximadamente 20 l) obtuvieron después de ultracentrifugación diferencial con una pipeta en rejillas revestidas de carbono Formvar y se dejó reposar durante 1 min a temperatura ambiente. Después de retirar el exceso de líquido con una pieza de filtro, la muestra se tiñó con 2% (w /v) de ácido fosfotúngstico (pH 6,8) durante 5 min y estaba bajo una lámpara incandescente eléctrica se secó al aire, y se analizaron con un microscopio electrónico de transmisión (FEI Tecnai 12, Philips).
los exosomas Etiquetado e internalización
exosomas SGC7901 células derivadas y los exosomas control fueron etiquetados con CM-Dil (rojo) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen). Los exosomas de células GES-1 se utilizaron como control células. La suspensión exosome marcado se filtró con una membrana de 100 kDa MWCO de fibra hueca (Millipore) y el flujo a través se utilizó como el control de tinte no unido. HucMSCs (1 × 10
4 /pocillo) se sembraron en placas de 12 pocillos que contienen laminillas y se incubaron a 37 ° C con exosomas marcados (800 mg /ml) durante 4 h antes de la cosecha.
Inmunofluorescencia La tinción
HucMSCs se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 10 min. Se prepararon células marcadas para microscopía de fluorescencia por per-movilización por 3 min con 0,1% Triton-X100, se bloquearon con 5% de BSA y se incubaron con anticuerpo monoclonal de conejo anti-β-actina durante la noche, seguido de incubación con marcado con Cy2 anti-IgG de conejo anticuerpo secundario a 37 ° C durante 45 min (Jackson ImmunoResearch). Los núcleos se contratiñeron con DAPI. Confocal imágenes fueron adquiridas de forma secuencial con TCS sistema SP5 II (Leica) [32].
CAF Diferenciación
HucMSCs se sembraron en placas de 6 pocillos (5 x 10
3 /pocillo) . Doce horas después de la siembra, hucMSCs fueron tratados con exosomas (800 mg /ml) para desencadenar la diferenciación CAF en presencia o ausencia de receptor 1 SD208 TGF-β inhibidor de quinasa (Sigma) o TGF-β humana recombinante (5 ng /ml; Sigma). El medio se cambió cada 3 días durante 14 días. Las células se recogieron entonces y se prepararon para la transferencia Western y análisis de PCR cuantitativa.
Western Blotting
se recogieron y se lisaron con tampón RIPA (Tris 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1 mM células EGTA, 0,1% de SDS, NaF 1 mM, 1 mM Na
3Vo
4, mM PMSF 1, 1 mg /ml de aprotinina, 1 mg /ml de leupeptina). Las alícuotas que contienen cantidades idénticas de proteína se fraccionaron y después se transfirieron a membranas de PVDF de metanol pre-activado (Millipore, EE.UU.). Después de la incubación secuencial con el anticuerpo primario y secundario, la señal se visualizó utilizando el sustrato HRP (Millipore, EE.UU.) y se analizó por MD Image Quant Software. Fuentes y factores de dilución de anticuerpos primarios fueron: policlonal de conejo anti-CD9 (1:1000; Bioworld), anti-CD81 (1:1000; Epitomics), anti-TGF-β (1:1000; Bioworld), anti-FAP ( 1:1000, Abcam), monoclonal de ratón anti-α-SMA (1:1000; Santa Cruz), anti-VEGF (1:1000; Santa Cruz) y anti-vimentina (1:2000; Santa Cruz), anti-N -cadherin (1:1,000; Bioworld), anti-e-cadherina (1:500; SAB), y monoclonal de ratón anti-GAPDH. (1:5000; Kangcheng)
RT-PCR cuantitativa
el ARN total se extrajo con el reactivo Trizol (Invitrogen) y el cDNA se sintetizó usando un kit de transcripción inversa (Toyobo, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores se produjeron por Invitrogen Company (Shanghai, China). Real-time RT-PCR se realizó para detectar el cambio de FAP, a-SMA, N-cadherina y IL-6 expresión génica (Rotor-Gene 6000, Australia). Para compensar las variaciones de ARN de entrada y la eficiencia de la transcripción inversa, un gen endógeno 'limpieza' (β-actina) también se cuantificó para normalizar los resultados. Todas las muestras se realizaron por triplicado, y todas las reacciones se repitieron 3 veces de forma independiente para asegurar la reproducibilidad.
Migración de ensayo
HucMSCs (8 × 10
4 en 200 l) suspendido en el suero medio exento se carga en el compartimiento superior y medio libre de suero 500 l (SFM) que contiene 800 mg exosomas /ml en la presencia o ausencia de TGF-β receptor 1 quinasa inhibidor SD208 (2 M) se añadió a la parte inferior de la transwell (Corning). Después del cultivo a 37 ° C durante 6 horas, las células de la membrana superior se limpian con un paño de algodón. Las células que habían migrado a través de la membrana se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con cristal violeta. Las células se observaron bajo microscopía y por lo menos 10 campos de células se sometieron a ensayo para cada grupo.
TGF-β Neutralización
HucMSCs fueron tratados con exosomas tumorales (800 mg /ml) para activar la diferenciación CAF en presencia o ausencia de anticuerpo TGF-β (R & amp; D). Antes de los experimentos, el anticuerpo anti-TGF-β (20 mg /ml) se incubó con exosomas a 37 ° C durante 2 horas.
Análisis estadístico
Todos los datos se expresan como media ± DAKOTA DEL SUR. software SPSS se utilizó para analizar los datos. Los medios de diferentes grupos de tratamiento se compararon mediante la prueba de dos vías ANOVA o t-test de Student. P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Los exosomas Caracterización e internalización
Se aislaron e identificaron los exosomas en función de su tamaño y densidad único.. Como se muestra en la Fig. 1A-a, los exosomas tenían una característica forma de platillo como limitado por una bicapa lipídica con un diámetro varió de 40 a 100 nm. Se confirmó la expresión abundante de marcadores exosomal CD9 y CD81 en nuestros exosomas aislados por transferencia Western (Fig. 1A-B). Siguiendo nuestros estudios anteriores, las MSC derivadas de cordón umbilical humano se prepararon y caracterizaron (datos no mostrados). Para investigar la internalización de los exosomas por hucMSCs, etiquetamos los exosomas con CM-Dil. Como se muestra en la Figura 1B, se internalizan SGC7901 células exosomas derivados y acumulan en hucMSCs después de la incubación durante 4 horas mientras que el control exosomas mostró un efecto mínimo. En comparación con el grupo SGC7901, menos GES-1 exosomas derivados fueron tomadas por hucMSCs.
A. La morfología de los exosomas y la expresión de marcadores exosomal. (A) El análisis morfológico de los exosomas derivados de cáncer gástrico. Barra de escala = 100 nm. (B) CD9 y la expresión de CD81 en exosomas. B. Los exosomas fueron especialmente captado por hucMSCs. Los exosomas marcados con CM-Dil (rojo) a 37 ° C durante 1 h, se añadieron en hucMSCs y se incubaron durante 4 h. El efluente de una suspensión filtrada de exosomas-marcadas con Dil CM (control) y la fracción exosomas retirado marcado con CM-Dil (e-exos) se utilizaron como controles. Las células se fijaron y se tiñeron para citoplasma (cy2-actina, verde) y núcleos (DAPI, azul). Barra de escala = 20 micras.
Los exosomas tumorales derivadas Promover hucMSCs diferenciación para los CAF
La hipótesis de que los exosomas derivados del tumor podrían inducir la diferenciación de hucMSCs a los CAF
in vitro
. CAF se definieron como la mayor expresión de FAP y proteínas α-SMA. HucMSCs monocapa se cultivan en un medio que contenía 800 mg /mL exosomas SGC7901 y GES-1 exosomas. Los análisis de RT-PCR cuantitativa mostró que SGC7901 exosomas pero no GES-1-exosomas promueven la expresión de marcadores de CAF en MSCs a las 36 h (Fig. 2A) y 14 d (Fig. 2B) después de la inducción, respectivamente. En comparación con el grupo no tratado, tumor exosomas tratamiento dio lugar a aumentos de FAP, α-SMA, N-cadherina, y los niveles de proteína vimentina (Fig. 2C). En conjunto, estos resultados indican que se someten a hucMSCs CAF diferenciación en respuesta a tumor exosomas exposición.
A.Quantitative análisis de la FAP, IL-6 y la expresión de α-SMA mRNA en hucMSCs. HucMSCs fueron tratados con varias concentraciones de SGC7901 exosomas o GES-1 exosomas durante 36 horas. B. análisis cuantitativo de la expresión de FAP, IL-6 y N-cadherina en hucMSCs. HucMSCs fueron tratados con varias concentraciones de SGC7901 exosomas o GES-1 exosomas para 14 días. blotting C. Los análisis por Western de la expresión de la proteína FAP, α-SMA, N-cadherina y vimentina en hucMSCs tratados con SGC7901 exosomas (800 g /ml) para diferentes tiempos. (A-d) análisis de la densidad de las bandas de transferencia de Western. * P & lt; 0,05 y#P & lt; 0,01, comparado con el grupo control relativo (n = 3) guía empresas
Los exosomas tumorales derivadas Promover hucMSCs Migración
Para analizar si la capacidad migratoria. de hucMSCs se vio afectada por exosomas tumorales, hucMSCs se cultivaron en el transwell y inducidas a migrar por exosomas tumorales. Como se muestra en las figuras 3A y 3B, a las 6 horas después de la incubación, los exosomas tumorales promueven la migración de hucMSCs más eficientemente que los exosomas derivados de células normales. También puso de manifiesto que el aumento de la migración de hucMSCs por exosomas tumorales fue bloqueada por el tratamiento simultáneo con un inhibidor de TGF-β R1, SD208. Además, se analizó el efecto de SGC7901 exosomas en la migración de hucMSCs mediante el uso de ensayo de cero. Los resultados fueron consistentes con la de ensayo de migración transwell, que muestra una distancia de separación reducida en tumor grupo exosome tratados (Fig. S1). Tomados en conjunto, estos resultados indican que los exosomas tumorales pueden promover la migración de hucMSCs
in vitro
.
A. HucMSCs fueron tratados con células gástricas cáncer o exosomas derivados de células epiteliales gástricas normales (800 mg /ml) en presencia o ausencia de SD208 (2 M) durante 6 h. ensayo de migración Transwell se realizó para analizar la capacidad migratoria de las células. B. El número de células migradas anteriormente se evaluó. Estos experimentos se repitieron tres veces. * P & lt; 0,05 y#P & lt; 0,01, n = 3. Barra de escala = 50 micras
Tumor derivado de exosomas Activar Smad2 /3 y p38 en hucMSCs
TGF-β. se ha demostrado que estar presente en la superficie de exosomas [33] y crítica para CAF diferenciación. a continuación, se investigó si la vía de TGF-β fue responsable de la inducción de la transición a las MSC CAF por exosomas tumorales. En primer lugar, demostramos la presencia de TGF-β en exosomas tumorales (Fig. 4A). En comparación con los exosomas tumorales, exosomas derivados de células normales mostraron menor nivel de expresión de TGF-β. Para evaluar si la diferenciación de hucMSCs a los CAF se asocia con la activación de la vía de TGF-β, se analizó el estado de fosforilados Smad 2/3 después de tumor exosomas tratamiento. Los resultados mostraron que Smad 2/3 fosforilación se incrementó en exosomas tumorales en 15 min después del tratamiento y alcanzó el nivel más alto en 60 min después del tratamiento, mientras que el total Smad 2/3 niveles de proteína no fueron afectados. También se determinó el nivel de p38 fosforilada y encontramos que la fosforilación de p38 también se incrementó en exosomas tumorales (Fig. 4B). Por el contrario, GES-1 exosomas derivados no podían activar Smad2 /3 y p38 (Fig. 4C). Tomados en conjunto, estos resultados indican que los exosomas tumorales activan específicamente Smad2 /3 y p38 en hucMSCs.
A. Western Blot análisis de la expresión de TGF-β en células de cáncer gástrico (SGC7901) y de células epiteliales gástricas normales (GES-1) exosomas derivados. B. HucMSCs fueron tratados con exosomas SGC7901 derivado (800 g /ml) para diferentes tiempos como se indica. Los niveles de p-Smad2 /3, t-Smad2 /3, p-p38and t-p38 se analizaron por transferencia Western. TGF-β sirvió como control positivo. C. HucMSCs fueron tratados con GES-1 exosomas derivados (800 g /ml) para diferentes tiempos como se indica. Los niveles de p-Smad2 /3, t-Smad2 /3, p-p38 y t-p38 se analizaron por transferencia Western.
inducida por exosomas TGF-beta Pathway inhibición Blocks Tumor Smad2 /3 la activación de p38 y
para demostrar si la activación de Smad2 /3 y p38 es específico para la señalización de TGF-β activado por exosomas tumorales, bloqueamos la vía TGF-β con R1inhibitor señalización de TGF-β y se detectaron los niveles de fosforilados Smad2 /3 y p38. Como se muestra en la Fig. 5A, el aumento de la fosforilación de Smad2 /3 y p38 siguiente tumor exosomas tratamiento se invirtió por el inhibidor de TGF-β R1, SD208, de una manera dependiente de la dosis. Para demostrar aún más TGF-β de exosomas tumorales que activa hucMSCs, que neutralizado TGF-β en exosomas tumorales utilizando un anticuerpo anti-TGF-β. Consistente con los resultados de TGF-β inhibidor de R1, el aumento de la fosforilación de Smad2 /3 y p38 en hucMSCs también se invirtieron por el anticuerpo TGF-β (Fig. 5B). En resumen, estos datos sugieren que el TGF-β de exosomas tumorales interactúa con el receptor de TGF-β en hucMSCs, dando lugar a la activación secuencial de Smad2 /3 y p38 en hucMSCs.
A. HucMSCs fueron tratados con exosomas SGC7901 derivado (800 g /ml) en presencia o ausencia de SD208 (2 M) durante 1 hora. Los niveles de fosforilados Smad2 y p38 se examinaron mediante transferencia Western. celulares de cáncer gástrico B. (SGC7901) derivado exosomas se pre-incubaron con anticuerpo anti-TGF-β (20 mg /ml) durante 2 h, y luego se añaden a hucMSCs. Seis horas más tarde, se recogieron las células y los niveles de proteínas fosforilados Smad2 y p38 fueron examinados por Western Blot.
inducida por TGF-β exosomas Camino La inhibición del tumor revierte hucMSCs diferenciación para los CAF
para demostrar TGF-β interacción /TGF-β R1 es responsable de la diferenciación de hucMSCs a CAF inducidos por exosomas tumorales, bloqueamos señalización con SD208 y el anticuerpo de neutralización del TGF-β seguido de tumor TGF-β exosomas tratamiento. Como se muestra en la Figura 6A-a, el tratamiento con SD208 (2 M) durante 14 días invertido fuertemente la expresión inducida por exosomas tumorales de marcadores CAF incluyendo FAP, α-SMA, N-cadherina y vimentina en hucMSCs. También confirmó este efecto mediante el uso de exosomas de HGC-27 células de cáncer gástrico (Fig. 6A-B). Además, el tratamiento con anticuerpo anti-TGF-β condujo a los efectos similares a la observada en inhibidor de TGF-β R1 (Fig. 6B). En resumen, estos datos demuestran que los exosomas tumorales median la diferenciación de hucMSCs a CAF a través de la activación de la vía de señalización de TGF-β /Smad.
A. HucMSCs fueron tratados con exosomas de células de cáncer gástrico derivados en presencia o ausencia de SD208 (2 M) durante 2 semanas. La expresión de FAP, α-SMA, vimentina y las proteínas N-cadherina se determinó por transferencia Western. (A) SGC7901; (B) HGC27. B. HucMSCs fueron tratados con células de cáncer gástrico (SGC7901) exosomas derivados en presencia o ausencia de anticuerpo TGF-β (20 mg /ml) durante 2 semanas. IgG de conejo se utilizó como control. La expresión de proteínas FAP y α-SMA se determinó mediante Western Blot.
Discusión
En este estudio, hemos identificado un nuevo mecanismo por el cual las células tumorales inducen la diferenciación de las MSC a los CAF. Nuestros datos indican que: (1) celular de cáncer gástrico exosomas derivados son internalizados por hucMSCs; (2) exosomas de células de cáncer gástrico derivados desencadenan hucMSCs diferenciación a CAF y (3) vía /Smad TGF-β media la transición de hucMSCs a CAF. Nuestros hallazgos sugieren que el TGF-β en exosomas tumorales puede interactuar con el TGF-β en R1 hucMSCs, resultando en la activación de la vía Smad en hucMSCs y la posterior diferenciación de hucMSCs a CAF.
Aunque se ha informado que los exosomas tumorales pueden mejorar la actividad metastásica de las células tumorales [34], el papel de los exosomas tumorales en MSCs no se ha revelado aún. Nuestros resultados demuestran que las células tumorales pueden regular la movilidad de los MSCs, lo que sugiere que las células tumorales podría reclutar MSC de la médula ósea u otros tejidos hasta el microambiente tumoral por el mecanismo de exosoma mediada.
La exposición a exosomas tumorales aumenta la expresión de marcadores de CAF en las MSC, lo que sugiere que los exosomas tumorales induce el interruptor del fenotipo de las MSC de CAF. Si bien este documento se estaba preparando, Cho et al. informaron que los exosomas de mama y células de cáncer ovárico podrían inducir el tejido adiposo MSCs derivadas de adquirir las características fisiológicas y funcionales de miofibroblastos de soporte de tumores [35], [36]. Nuestro trabajo está en consonancia con sus hallazgos y demuestra además que este proceso es Smad-dependientes.
En el estudio actual, se presenta la evidencia de que los exosomas tumorales ofrecen una plataforma eficiente para la transmisión de mensajes específicos a las MSC, la promoción transición MSC-CAF. Varios estudios anteriores han demostrado que el TGF-β se expresa por exosomas derivados de células de cáncer y esta forma de TGF-β es biológicamente activo en el impulso de señalización Smad dependiente de [33], [37]. TGF-β es un regulador clave de la renovación de células madre y la diferenciación [38]. Se verificó la presencia de TGF-β en exosomas derivados celulares de cáncer gástrico y confirmó la interacción de TGF-β /TGF-β R1 mediada por la activación de Smad2 /3 y diferenciación CAF en hucMSCs.
Se ha demostrado que las MSC podría promover la metástasis del cáncer [4], [39]. Nos han informado también de que el MSC humanas derivadas medio condicionado y exosomas mejorar el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en las células tumorales y promover el crecimiento del tumor
in vivo
[18], [19]. Ya sea que los exosomas de las MSC podrían desempeñar un papel en la metástasis del cáncer no se ha abordado. Hemos observado que los exosomas MSC promueven la transición epitelio-mesénquima (EMT) en células de cáncer gástrico, pero los mecanismos subyacentes todavía tiene que ser investigado en los estudios futuros.
En conclusión, hemos demostrado en este estudio que los exosomas de células de cáncer gástrico derivados tienen la capacidad de inducir la diferenciación de las MSCs a CAF y la activación de la vía /Smad TGF-β por exosomas tumorales contribuye a la transición de las MSC a los CAF. Nuestros resultados proporcionan un nuevo mecanismo por el cual las células tumorales inducen a las MSC se diferencian en células del estroma tumoral y participa en la formación del microambiente tumoral.
Apoyo a la Información
Figura S1. exosomas derivados de células de cáncer gástrico
promover la migración hucMSCs. HucMSCs fueron tratados con células gástricas del cáncer (SGC7901) exosomas derivados (800 mg /ml). array arañazos se realizó para analizar la capacidad de migración de las células. (A-c) hucMSCs no tratadas; (D-f) SGC7901-exosomas hucMSCs tratados. Barra de escala = 50 micras
doi:. 10.1371 /journal.pone.0052465.s001 gratis (TIF)