Extracto
La activación constitutiva de la vía Wnt conduce a la formación de adenoma, un paso obligado hacia el cáncer intestinal. En vista de la función establecida de Wnt en la regulación de troncalidad, se intentó el aislamiento de células madre del cáncer (CSC) de
Apc CD - y
Apc
/
KRAS
-mutant tumores intestinales. Mientras que células madre cancerosas están presentes en
Apc
/
KRAS
tumores, que parecen ser muy raro (& lt; 10
-6) en el
Apc
adenomas -mutant . Por el contrario, los Lin
-CD24
hiCD29
+ subpoblación de células de adenocarcinoma parece estar enriquecida en células madre cancerosas con el aumento de los niveles de β-catenina activa. Expresión análisis para la descripción de la subpoblación enriquecida-CSC confirmó su actividad Wnt mejorada y reveló la expresión diferencial adicional de otras vías de señalización, proteínas de unión de factores de crecimiento, y los componentes de la matriz extracelular. Como era de esperar, los genes característicos del linaje de células de Paneth (por ejemplo, defensinas) son co-expresada junto con genes de células madre (por ejemplo,
LGR5
) dentro de la subpoblación enriquecida-CSC. Esto es de interés ya que puede indicar un papel nicho de células madre de cáncer de células de Paneth-como derivados del tumor, similar a su papel en el apoyo LGR5
+ células madre en la cripta intestinal normal. En general, nuestros resultados indican que oncogénico
KRAS
de activación en
Apc
impulsada por tumores como resultado la expansión del compartimento de células madre cancerosas mediante el aumento de la estabilización intracelular ®-catenina
Cita.: Ghazvini M, Sonneveld P, Kremer A, Franken P, Sacchetti A, Atlasi Y, et al. (2013) stemness cáncer en
Apc CD - vs
Apc
/
KRAS
impulsada intestinal Tumorigénesis. PLoS ONE 8 (9): e73872. doi: 10.1371 /journal.pone.0073872
Editor: Cara Gottardi, Universidad de Northwestern Feinberg School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Marzo, 2013; Aceptado: July 24, 2013; Publicado: 17 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Ghazvini et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los proveedores de fondos tenido ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Estos estudios fueron apoyados por becas de la Sociedad del Cáncer Holandés (EMCR 2001-2482), la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO /Vici 016.036.636), el programa BSIK (Kennisinfrastructuur) del gobierno holandés de subvención (03038 www.stemcells. nl) y el Instituto Holandés para la Medicina Regenerativa (Nirm; www.nirm.nl), y la Unión Europea FP6 y FP7 consorcios cáncer Migración Stem Cells (programa MSCSP; www.mcscs.eu) y TuMIC (concepto integrado de la metástasis tumoral (http : //itgmv1.fzk.de/www/tumic/tumic_main.htm)
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de colon todavía representa un modelo ideal para estudiar los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a la aparición del tumor y la progresión hacia la malignidad [1], la denominada secuencia de adenoma-carcinoma [2]. en general, las mutaciones de pérdida de función en el
APC gratis (poliposis adenomatosa coli) gen supresor de tumores o mutaciones oncogénicas en β-catenina (
CTNNB1
) conducir a la activación constitutiva de la señalización /β-catenina y representa el tipo más frecuente limitante (adenoma -Formar) eventos entre los pacientes con cáncer de colon. adenoma crecimiento y la progresión suele ir acompañada de alteraciones en
KRAS
o
BRAF
, seguida por la pérdida de la
TP53
y
pensaron SMAD4
supresores tumorales para la base de la transformación maligna en el adenocarcinoma localmente invasivo [1]. Sin embargo, este modelo de evolución genética bien establecida no tiene en cuenta otras características esenciales de los cánceres de colon humano, es decir, su heterogeneidad celular (diferentes linajes celulares a menudo están presentes dentro de la masa primaria) y el posible papel desempeñado por una subpoblación de células tumorales, la células madre de cáncer (CSC), en la conducción de crecimiento del tumor y la determinación de la invasión local en los tejidos circundantes y la metástasis distante [3]. De hecho, aunque el modelo genético anterior podría predecir que todas las células del tumor dentro de un cáncer de colon supuestamente iniciada por un
APC
o mutación β-catenina invariablemente debe destinarse por el sello distintivo de la activación de Wnt constitutiva, a saber, β- nuclear catenina acumulación, esto sólo se observa en una minoría de células que normalmente se encuentra en el frente invasivo de la lesión primaria [4] de donde se desprenden e invaden el estroma circundante [5], [6]. Esta "paradoja de β-catenina" ilustra muy bien cómo la heterogeneidad intra-tumoral y posiblemente stemness tumor sobrevienen en las fases muy iniciales de la secuencia adenoma-carcinoma y conducen a diferentes niveles de señalización Wnt entre diferentes células tumorales linajes que comparten el mismo (
APC
) mutaciones [7]. También indica que la pérdida de
(o la activación oncogénica β-catenina) es presumiblemente necesario APC
función de la aparición de la lesión displásica inicial pero insuficiente para activar completamente la transducción de señales Wnt y promover la transformación maligna en ausencia de adicional ambiental y (epi) factores genéticos.
con anterioridad, mediante el empleo de
in vivo
mutagénesis [8], [9] y la orientación de genes en el ratón [10], [11], que fue demostrado que la pérdida de
Apc
función da como resultado la formación de adenoma en el tracto gastrointestinal superior. Sin embargo, estos adenomas de ratón no pueden progresar a la malignidad y no se acumulan de forma espontánea accesos genéticos adicionales en el endógena de
Kras Opiniones y
TP53
genes [12]. Cabe destacar que, mientras que oncogénico
KRAS
activación por sí solo es incapaz de iniciar la tumorigénesis intestinal si no es con un inicio muy tarde y sólo a golpes somáticas en el
Tp53
de genes [13], compuesto
apc
1638N /+ /
KRAS
ratones V12G se caracterizan por un aumento de 10 veces en el número de tumores y por la progresión del tumor acelerada en comparación con
apc
1638N /+ compañeros de camada, con la gran mayoría de la lesión tumoral que se representan por adenocarcinomas [14]. Otros análisis revelaron que
Apc
y
KRAS
mutaciones son sinérgicos en la promoción de la translocación nuclear β-catenina, mejorando así canónica de transducción de señales Wnt [14]. Este último es probable que el resultado de la capacidad de KRAS activado, a través de quinasas aguas abajo y sin embargo desconocidos, para inducir la fosforilación de tirosina β-catenina lo que conduce a un aumento sustancial de su piscina citoplasmática y su posterior translocación al núcleo, donde actúa como un transcripcional activador de varios genes Wnt objetivo abajo. En consecuencia, los tumores intestinales de
Apc
1638N /+ /
KRAS
ratones V12G muestran un aumento significativo en las células con acumulación nuclear de β-catenina en comparación con
apc
1638N /+ animales [14].
En los últimos años, los CAC se han purificado con éxito de los cánceres de colon humanos mediante el empleo de diferentes marcadores de superficie celular, tales como CD133 [15], [16] , EpCAM, CD44 y CD166 [17], y EphB2 [18]. Sin embargo, a pesar de los antígenos de superficie celular anteriores han sido fundamentales para la identificación de las subpoblaciones de células tumorales con propiedades enriquecidas iniciadoras del tumor cuando se trasplantan en ratones receptores inmunes-incompetentes, nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes stemness cáncer intestinal y del papel desempeñado por los CAC en progresión hacia la malignidad es todavía muy incompleta. Anteriormente, Vermeulen et al. mostró que una alta actividad de Wnt destina células madre cancerosas dentro de las esferas de suspensión derivadas de tumores de colon [19]. Desde esta perspectiva, una serie de cuestiones adicionales deben ser abordados: es la acumulación de β-catenina nuclear marcador funcional de células madre cancerosas intestinales
in vivo
? Son células tumorales con propiedades similares a madre ya presente en las lesiones tempranas, como los adenomas benignos tales? Aquí, nos aprovechamos de la
Apc
1638N /+ y
Apc
1638N /+ /
KRAS
modelos de ratón para V12G intestinal tumorigénesis para identificar prospectivamente las subpoblaciones de células madre tumorales y caracterizar al igual que ellos con respecto a su multipotencia, auto-renovación, el perfil de expresión de todo el genoma, y la actividad de señalización /β-catenina vía.
resultados
Las células tumorales iniciadoras están presentes en
Apc
1638N /+ /KRAS
V12G
pero son muy raros en
Apc
1638N /+
intestinal tumores
el
Apc
modelo 1638N /+ ratón desarrolla un promedio de 4-5 tumores benignos del tracto digestivo superior (adenomas) en el /6J fondo genético C57BL [10], [11]. Estas lesiones sólo en raras ocasiones (y con la aparición tardía) se convierten en los adenocarcinomas siguiendo la línea marcada por la ausencia de mutaciones somáticas espontáneos que se producen en el
Kras Opiniones y
TP53
genes [12]. Para evaluar la presencia de células iniciadoras del tumor en adenomas
Apc
1638N /+, es decir, células capaces de recapitular la lesión primaria cuando se trasplantan en un animal receptor, tumores intestinales se recogieron de
Apc
1638N /+ animales y disociado mecánicamente y enzimáticamente en suspensiones de células individuales y agotada de células endoteliales y hematopoyéticas (Lin
+) por células activadas por fluorescencia (FACS). A continuación, diferentes multiplicidades de los Lin resultante
- población de células tumorales a granel fueron trasplantadas por vía subcutánea en animales NOD-SCID. Como se muestra en la Tabla 1, no se observó el crecimiento del tumor, incluso después de la inyección de tanto como 0,5-1,0 * 10
6 Lin
-. Células y 6 meses después del trasplante
A continuación, se repitió el ensayo de trasplante con mayor Lin
- las células tumorales de
Apc
KRAS
V12G tumores 1638N /+ /intestinales. Como se informó anteriormente, la mayoría de los tumores intestinales se encuentran en estos animales compuestos de la misma /fondo genético J C57B6 endogámicos son localmente invasivos adenocarcinomas [14]. En agudo contraste con el Lin
- células de
Apc
1638N /+ adenomas, se observó el crecimiento del tumor en 23 de 33 inyecciones con 10
5
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G Lin
- células y, aunque en menor incidencia (3 de cada 48 trasplantes), incluso con un precio tan bajo como 1.500 células (Tabla 1). Al limitar el análisis de dilución (L-Calc ™) la frecuencia de las células iniciadoras de tumores en el Lin
- población de
Apc
1638N /+ /
KRAS
tumores intestinales V12G se estimó en 1 en 72838 (IC del 95% de 109.467 a 48.465). En cuanto a la
Apc
1638N /+ adenomas, las células iniciadoras de tumores tienden a estar presentes, en todo caso, en forma considerable las frecuencias más bajas (& lt; 10
-6). Por lo tanto, la presencia de células iniciadoras de tumores, como se define por ensayos de trasplante, parece estar limitada a los tumores de
Apc
//
KRAS
V12G ratones 1638N + en comparación con los del
Apc
modelo 1638N /+ ratón.
el Lin-CD24
hiCD29
+ subpoblación de la
Apc
1638N /+ /KRAS
V12G
intestinal tumores Encompass tumor iniciadoras y los CAC de autorrenovación
con el fin de enriquecer de forma prospectiva y aislar las células iniciadoras de tumores del grueso finalmente Lin
- población de
Apc
1638N /+ /
KRAS
tumores V12G, primero a prueba un panel de previamente establecido (cáncer) que incluyen marcadores de células CD24, CD29 (integrina β1) del tallo, CD44, CD97, y L1CAM por FACSorting y posterior trasplante en ratones NOD-SCID. En contraste con CD44, L1CAM, y CD97 (Tabla S1), el trasplante de Lin
-CD24
+ CD29
+ células reveló un enriquecimiento significativo aún leve en las células iniciadoras de tumores (frecuencia estimada de 1 en 56463 , con CI de 399.211 hasta 7.986) (Tabla 2). Dado que el Lin
-CD24
+ CD29
+ población representa una proporción relativamente grande de las células a granel (~ 80%; datos no mostrados), que a continuación definimos además tres puertas FACS adicionales en base a la relación expresión del antígeno de superficie celular CD24 (CD24
hola, CD24
med, y CD24
bajo) (Figura 1a). Fuera de 30 primaria
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G tumores analizados por FACS, el tamaño medio (expresado en porcentaje de la masa Lin
- fracción ) de cada CD24 /CD29 subpoblación según se determinó: CD24
-CD29
-, 3.4% (dE 2,6); CD24
-CD29
+, 7,8% (SD 4,7); CD24
+ CD29
-, 4,4% (SD 3,4); CD24
loCD29
+ (P1), 7,9% (SD 2,5); CD24
medCD29
+ (P2), el 52,9% (DE 7,4); CD24
hiCD29
+ (P3), 10,0% (DE 4,7). Tenga en cuenta que estos porcentajes no suman 100% simplemente debido a la exclusión deliberada de las células situadas en las separaciones entre las puertas de clasificación (véase la figura 1a).
a. Placa grande: dot gráfico representativo del patrón de tinción obtenido mediante tinción con anticuerpos anti-CD24 APC-conjugados y anti-CD29 conjugado con PE. células positivas de linaje (Lin
+) fueron excluidos (cerrada hacia fuera) por tinción con anticuerpos biotinilados contra marcadores de linaje y estreptavidina-PerCPCy5.5. P1 (Lin
-CD24
lowCD29
+), P2 (Lin
-CD24
medCD29
+) y P3 (Lin
-CD24
hiCD29
+) sup poblaciones se indican en la trama. Pequeños paneles: gráficos de puntos representan las células marcadas con anticuerpos control isotípico (izquierda), Control de compensación sólo se tiñeron con anticuerpos anti CD24-APC (centro), Control de compensación teñidas únicamente con anticuerpos anti-CD29-PE (derecha). segundo. FACS análisis del patrón de CD24 /CD29 de tumores obtenidos mediante el trasplante de células P3 serie de suspensiones de
Apc
KRAS
V12G tumores 1638N /+ /intestinales. Izquierda: el trasplante de primaria. A la derecha: el trasplante de secundaria. do. El análisis inmunohistoquímico de los tumores obtenidos por 3 rondas de trasplante de células P3 serie de suspensiones de
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G tumores intestinales.
la frecuencia de células iniciadoras del tumor dentro de la P1, P2 y P3 subpoblaciones se determinó mediante el trasplante de células de cada 1500 en ratones NOD-SCID. Cabe destacar que, mientras que en esta multiplicidad CD24
medCD29
+ y CD24
loCD29
+ células fallaron consistentemente para formar tumores (sólo 1 de crecimiento de 56 trasplantes), los Lin
-CD24
se encontró hiCD29
+ subpoblación para abarcar un enriquecimiento sustancial de células tumorigénicas (13/28; Tabla 2). Por lo tanto, aunque en este caso no fue posible realizar análisis de dilución limitante por L-Calc ™ (ya que utiliza una multiplicidad fijo de células) los Lin
-CD24
hiCD29
+ subpoblación de tumores parece estar caracterizada por un enriquecimiento relativo significativo de aprox. 20-25 veces en comparación con el total de Lin
- células granel (1 CSC de ~3000 células tumorales frente a 1 en 72838)
La definición de las células madre del cáncer no puede basarse exclusivamente en su capacidad. para formar tumores cuando se trasplantan a baja multiplicidad en ratones inmuno-incompetentes. características igualmente importantes de células madre cancerosas son su capacidad única de auto-renovarse y diferenciarse de combustible y recapitular la composición heterogénea del tumor primario que se derivan de. Con el fin de determinar si las células iniciadoras de tumores comprendidos por los Lin
-CD24
hiCD29
+ población también son capaces de auto-renovación y diferenciación, se ha trasplantado experimentos de serie. En primer lugar, 1500 Lin
-CD24
hiCD29
+ células fueron aisladas a partir de
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G tumores intestinales primarias y trasplantado en ratones receptores NOD-SCID. Como era de esperar a partir de nuestros resultados anteriores, este ensayo inicial dio lugar a tumores subcutáneos dentro de 8 a 10 semanas. Los tumores resultantes se extirparon de los animales NOD-SCID receptores y emplearse tanto para FACS y análisis histológico. En cuanto a FACS, los tumores se disociaron en suspensiones de células individuales y se analizaron, ordenadas y se trasplantan en función de sus niveles de CD24 y expresión de CD29. Los tumores secundarios se originó a partir Lin
-CD24
hiCD29
+ células completamente recapitulan el perfil de expresión de CD24 /CD29 por FACS de las lesiones primarias (Figura 1B y Figura S2). Del mismo modo, en el trasplante de 1.500 células de cada uno de los Lin
-CD24CD29 poblaciones obtienen de los tumores secundarios, sólo el Lin
-CD24
hiCD29
+ células eran capaces de formar tumores terciarias. De acuerdo con ello, el perfil de FACS de los tumores terciarias recapitula la de las lesiones primarias (Figura 1b). Notablemente, inmunohistoquímica (IHC) y la tinción enzimática revelaron un aumento progresivo de la presencia relativa de los linajes de diferenciación intestinal, a saber (ácido periódico de Schiff; PAS) células caliciformes, Paneth (lisozima), y entero-endocrinas (sinaptofisina) en los tumores intestinales trasplantados en comparación con el primario
Apc
1638N /+ /
lesiones KRAS
V12G (Figura 1c). Sin embargo, el análisis FACS de los tumores trasplantados en serie mostró que el tamaño relativo de las subpoblaciones CD24 /CD29 individuales no cambió significativamente (Figura S3).
Por lo tanto, los Lin
-CD24
hiCD29
+ subpoblación de células tumorales de
Apc
1638N /+ /
KRAS
adenocarcinomas V12G abarcan
de buena fe con los CAC
iniciadoras del tumor, auto -renewing y capacidades de diferenciación.
Lin-CD24
hiCD29
+ Las células de los
Apc
KRAS V12G
intestinal tumores muestran un aumento de β 1638N /+ /intracelulares catenina acumulación
Hemos propuesto anteriormente que la minoría de las células de cáncer de colon que ofrecen la acumulación de β-catenina nuclear y no aleatoriamente distribuidas a lo largo del frente invasivo, representan los CAC [7]. Cabe destacar que, tanto
Apc
1638N /+ adenomas y
Apc
1638N /+ /
KRAS
carcinomas V12G comparten el mismo "β- catenina paradoja "observado en los cánceres de colon humanos en que, tras el análisis IHC, sólo una minoría de las células tumorales muestran la acumulación de β-catenina nuclear a pesar de que la mayoría, si no todas, comparten los dos éxitos en el
Apc
locus [12], [14] (Figura 2a). Para evaluar si las células madre cancerosas enriquecidos en el Lin
-CD24
hiCD29
+ subpoblación de tumores se caracterizan por un aumento del nivel intracelular de β-catenina, analizamos la expresión de proteínas en las diferentes subpoblaciones de células tumorales FACSorted por dos independientes ensayos, a saber, inmuno-tinción y análisis de transferencia Western. Inmuno-tinción mostró que la mayoría de Lin
-CD24
hiCD29
+ células tumorales intestinales se caracterizan por la acumulación intracelular de β-catenina en comparación con otras poblaciones clasificadas y el mayor (Lin
-) las células tumorales (Figura 2b). Este resultado también se confirmó en una manera más cuantitativa por análisis de Western realizado con anticuerpos específicos para la fracción de señalización competente (es decir, desfosforilado en los residuos Ser37 y Thr41) de la proteína β-catenina (Figura 2C y la figura S4).
inmunohistoquímica (a., b.) y Western blot (c.) el análisis de β-catenina en
Apc
+ adenomas intestinales (a.) y en poblaciones de tumores primarios FACSorted 1638N de
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G tumores intestinales (b. y c.). Las barras de c. representa la cuantificación de las bandas obtenidas con un anti-β-catenina activa Ab (anti-ABC; clon 8E7,#05-665, Millipore) mediante el escaneo y el análisis de la transferencia Western con el escáner Odyssey y después de la normalización con β-actina.
En general, estos datos confirman que los Lin
-CD24
hiCD29
+ subpoblación de la
Apc
1638N /
KRAS /+
tumores V12G, aquí mostrado ser enriquecido en los CAC, comprende a un nivel significativamente más alto de señalización intracelular y competente β-catenina en comparación con Lin a granel
- y otras subpoblaciones de células tumorales. El aumento de la actividad de señalización Wnt en células madre cancerosas se confirmó posteriormente mediante perfiles de expresión y análisis TaqMan qPCR de los genes diana de Wnt (por ejemplo,
LGR5
,
AXIN2
,
T
, y
Lef1
;. ver aquí abajo)
El patrón de expresión de células madre cancerosas de
Apc
1638N /+ /ARC
SV12G
intestinal tumores es distinta de la de Las células tumorales diferenciadas y granel y abarca tanto el tallo y marcadores de células de Paneth
Para identificar las diferencias moleculares entre las células tumorales y de tallo como más diferenciados (a granel) de
Apc
1638N /+ y
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G tumores intestinales, aislamos ARN total de 10
4 Lin
-CD24
hiCD29
+ (P3), Lin
-CD24
medCD29
+ /Lin
-CD24
loCD29
+ (P1 + P2, puerta fusionada) y Lin
- ( células granel) de tumor de 5 ratones individuales de cada genotipo (
Apc
1638N /+ y
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G). muestras de ARN total, fueron utilizadas para hibridar microarrays de oligonucleótidos (Affymetrix genoma del ratón 430A 2,0 Array) de acuerdo con protocolos convencionales.
En primer lugar, las diferentes poblaciones de células tumorales aisladas de ratones con diferentes genotipos (
Apc
1638N /+ y
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G) se compararon mediante ANOVA (3 vías) con un) conjunto tasa de falso descubrimiento FDR ( en 0,05 para seleccionar los genes con expresión diferencial ≥2 veces. Cabe destacar que el P3 (células madre cancerosas de ambos genotipos) vs. Lin
- (a granel; ambos genotipos) y P3 vs comparaciones P1 + P2 dio lugar a diferencias significativas y en la definición de las dos listas de conjuntos de sonda expresados diferencialmente (n = 1062 [851 no redundante, los genes anotados] y 746 [602, anotado genes no redundantes], respectivamente; Tablas S3 y S4). De esta manera, hemos identificado una lista de 587 conjuntos de sonda expresados diferencialmente a partir de la intersección de la Lin- vs. P3 y P1 + P2 vs. P3. Los conjuntos de sonda identificados corresponden a 482 genes (no redundante) (Tabla S5).
Los perfiles de expresión obtenidos a partir de las subpoblaciones enriquecidas-CSC (Lin
-CD24
hiCD29
+) de ambos genotipos (
Apc
1638N /+ y
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G) difieren de las de más diferenciado (Lin
-CD24
medCD29
+ /CD24
loCD29
+) y de la Lin
- subpoblaciones granel, claramente visible en el agrupamiento jerárquico (HCA) y de componentes principales ( PCA) análisis (Figura 3).
(a.) la agrupación jerárquica y (b.) análisis de componentes Principales (PCA) (ambos implementados en Partek) de Lin
-CD24
hiCD29
+ (P3), Lin
-CD24
medCD29
+ /Lin
-CD24
loCD29
+ (P1 + P2, puerta fusionada) y Lin
- ( células granel) de tumor de 5 ratones individuales de cada genotipo (
Apc
1638N /+ y
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G). Para una mejor visualización se utilizaron colores individuales para cada grupo y en b. elipsoides se elaboraron en torno a las tres poblaciones tumorales
En particular, el
Apc -. y
Apc
KRAS
genotipos -mutant no son /resuelto por la CHA y PCA, posiblemente debido al número relativamente limitado de
Apc
1638N /+ y
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G muestras de tumores (n = 5 para cada grupo) empleadas para la expresión comparativa análisis de perfiles, insuficiente para poner de relieve las diferencias supuestamente más sutiles entre los CAC benignos y malignos.
a continuación, a partir de las listas anteriores de diferencialmente expresado sondas entre la P3 y otras poblaciones de células tumorales que validan la expresión de un total de 35 genes por cuantitativa en tiempo real PCR (Tabla S2). La selección de genes validados incluye, además de la parte superior arriba y abajo de los genes regulados, también miembros adicionales de la vía de transducción de señales Wnt canónica, y los genes conocidos por jugar un papel relevante en el cáncer. En general, la gran mayoría de los genes seleccionados (33/35) fueron validados para su expresión diferencial por qPCR (Figura S1).
Gene ontología análisis [20] de la firma intersección pusieron de manifiesto una amplia gama de celulares funciones, estructuras y procesos entre los genes regulados incluyendo la matriz extracelular, adhesión celular, el desarrollo de órganos y la morfogénesis (Tabla S6). En particular, el análisis de los genes expresados diferencialmente en el CD24
hiCD29
+ células de
Apc
1638N /+ y
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G tumores en comparación con el volumen y las células tumorales sean más diferenciadas, revelaron varios procesos biológicos susceptibles de desempeñar roles funcionales en stemness cáncer. En primer lugar, como se muestra también por la acumulación intracelular de β-catenina activa, varios objetivos y los miembros de la cascada de señalización Wnt se expresan diferencialmente en la firma P3 incluyendo
LGR5
,
MMP2
y
MMP7
,
Dkk2
,
PLA2G2A
,
Prox1
,
Sox17
,
T gratis (brachyury),
WIF1
, y
Fzd5
. La presencia de
LGR5
entre los genes upregulated es de interés, ya que indica que este marcador conocido de las células madre ciclo normal en el intestino de ratón [21] puede también representar un marcador CSC útil en tumores intestinales de ratón como ha demostrado recientemente por el linaje de rastreo [22]. Además, el factor de transcripción
Prox1
, un objetivo directo y dependiente de la dosis de la vía de señalización Wnt /β-catenina, se upregulated en la población P3.
Prox1
se había demostrado que la promoción de la displasia de adenomas de colon y la progresión del cáncer colorrectal [23]. Sin embargo, no se encontró ninguna diferencia significativa entre los
Prox1
niveles de expresión entre
Apc
1638N /+ y
Apc
1638N /+ /
células KRAS
tumorales V12G tanto en los microarrays de datos originales y sobre la validación qPCR (Figura S1). Esta observación refleja una falta más general de diferencias significativas entre las poblaciones de P3
Apc
1638N /+ y
Apc
1638N /+ /
KRAS
tumores V12G, siguiendo la línea marcada por la agrupación jerárquica y análisis PCA (Figura 3a y b, respectivamente). En nuestro estudio anterior [14], de perfiles de expresión de los tumores a granel de
Apc
1638N /+ y
Apc
1638N /+ /
KRAS
ratones V12G también no resolvieron los dos genotipos. De hecho, sólo el número relativo de células tumorales con β-catenina nuclear podría distinguir significativamente entre los
Apc
1638N /+ de
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G tumores intestinales [14].
Además de Wnt, vías de señalización adicionales están representados por los genes regulados diferencialmente como se muestra por la expresión diferencial de los
Bmp7
y
Bmper gratis (señalización de BMP),
Fgfbp1
,
FGFRL1
, y
ETV5 gratis (factor de crecimiento de fibroblastos receptores, proteínas y factores de transcripción vinculante), y
IGF1
,
IGFBP1
,
IGFBP5
, y
IGFBP7
(factores de crecimiento similares a la insulina y las proteínas de unión).
En general, estos resultados muestran que las CSC de
Apc CD - y
Apc
/
KRAS
tumores -mutant tienen distintos perfiles de expresión de otras poblaciones de células tumorales y se caracterizan por una mayor actividad de señalización Wnt , de acuerdo con sus niveles mejorados de intracelular β-catenina, junto con otros pathays señalización (BMP, IGF), y por la expresión de genes específicos de células de Paneth.
Discusión
las mutaciones en Bligoo
APC
gen supresor de tumores representan el iniciador principal y caso limitante de la velocidad en la secuencia adenoma-carcinoma que conduce a cáncer de colon en el hombre [1]. La pérdida de
APC
función conduce a la activación constitutiva de la vía de señalización de Wnt /β-catenina canónica sabe que juega un papel crucial en la regulación de la autorrenovación y diferenciación en un amplio espectro de nichos de células madre específicas de tejido incluyendo la cripta intestinal y, en consecuencia, en la aparición de muchos tipos de cáncer [24]. Constitutiva de activación de señalización de Wnt en el epitelio intestinal desencadena la formación de adenoma y representa un paso necesario, aunque insuficiente, para la transformación maligna. Las mutaciones somáticas en
KRAS
,
BRAF
,
TP53
, y
SMAD4
normalmente subyacen a la progresión del tumor benigno en el adenocarcinoma localmente invasivo y metástasis en los sitios de órganos distantes [1]. Las mutaciones en el ratón endógena de
Apc
gen también conducen a la formación de pólipos intestinales, aunque está ubicado principalmente en el tracto gastrointestinal superior. En particular, ratón
Apc
impulsada adenomas intestinales no se acumulan de forma espontánea
Kras
o
TP53
mutaciones somáticas y, en consecuencia, muy raramente progresar a adenocarcinomas [12].
en nuestro laboratorio, hemos generado el
Apc
1638N /+ ratón modelo de codificación para un hypomorphic
Apc
mutación que resulta en pocos (5-6) adenomas del tracto gastrointestinal superior , una supervivencia más larga y una mayor probabilidad de transformación maligna espontánea aunque sólo en animales mayores de 1 año [10], [11], [12]. Por el contrario, el compuesto heterocigótico
Apc
1638N /+ /
KRAS
ratones V12G se caracterizan por el aumento de número de tumores (~ 10 veces) y aceleran la progresión maligna con la mayoría de lesiones siendo localmente adenocarcinomas invasivos [14]. En particular, la activación oncogénica de
KRAS
/
Kras
por sí solo es insuficiente para iniciar la tumorigénesis intestinal [25], si no con aparición tardía y tras la inactivación somática de la
Tp53
gen [13]. Por lo tanto, las diferencias fenotípicas dramáticos provocados por la activación oncogénica de los
KRAS
de genes en el compuesto
Apc
KRAS
V12G resultados 1638N /+ /ratones de su acción sinérgica en la promoción de la señalización de Wnt canónica, como se muestra por el aumento de la actividad de reportero TOP-flash y en el número de células tumorales destinados por la acumulación de β-catenina nuclear [14].
el aumento relativo observado en el número de
Apc
1638N /+ /
KRAS
células tumorales V12G destinados por β-catenina nuclear es de importancia en vista de la llamada "β-catenina paradoja "[7]: a pesar de que la pérdida de
APC
función es común a todas las células tumorales y se prevé que resultará en la intracelular y la acumulación nuclear de β-catenina, esto se observó sólo en una minoría de las células de cáncer sometidos a una transición epitelio-mesenquimal (EMT) y no al azar distribuido en el frente invasivo de la masa tumoral [4], [5] (véase también la Fig. 2a). Esta observación dio lugar a la hipótesis según la cual las células pinta β-catenina nuclear madre-como intestinales tumorales con actividad de señalización de Wnt mayor capaces de desprenderse de la masa primaria y eficaz difusión y el hogar en distal, órganos vitales [6], [19], [26].
a continuación, se intentó la purificación prospectivo de las células madre del cáncer (CSC) de
Apc
1638N /+ /
KRAS
V12G tumores intestinales. En particular, la presencia de células iniciadoras del tumor, no se ha demostrado en los tumores
Apc
1638N /+. De acuerdo con la definición operativa de CSC, es decir, su capacidad para formar tumores en limitar la dilución del trasplante en ratones receptores,
de buena fe
CSC están ausentes o extremadamente raros (& gt; 10
-6) en las lesiones intestinales característico de los ratones
Apc
1638N /+. a 4 ° C.
una. segundo.