Extracto
Antecedentes
A través de la regulación negativa de la expresión génica, los microARN (miARN) pueden funcionar en cánceres como oncosuppressors, y pueden mostrar una expresión alterada en diversos tipos de tumores. Aquí hemos investigado tumores de meduloblastoma (MBS), que surgen de una deficiencia temprana de los procesos de desarrollo en el cerebelo, en donde la señalización de Notch está implicada en muchas etapas destino celular de determinación. MBs se producen de forma bimodal, con el pico de incidencia observada entre 3-4 años y de 8-9 años de edad, aunque también puede ocurrir en adultos. Notch regula un subconjunto de las células MB que tienen propiedades de células troncales similar y pueden promover el crecimiento del tumor. Sobre la base de esta evidencia, la hipótesis de que los miRNAs dirigidos a la vía de Notch pueden regulada estos fenómenos, y se pueden utilizar en terapias contra el cáncer.
Metodología /Principales conclusiones
En la proyección de MB líneas celulares, el miARN miR-199b-5p fue visto que es un regulador de la vía de Notch a través de su focalización del HES1 factor de transcripción. Baja regulación de la expresión HES1 por miR-199b-5p regula negativamente la tasa de proliferación y anclaje independiente crecimiento de las células MB. MiR-199b-5p sobreexpresión bloquea la expresión de genes de células madre varias cáncer, afecta el potencial de injerto de las células MB en el cerebelo de ratones atímicos /desnudos, y de particular interés, disminuye el MB de células madre similares (CD133 +) subpoblación de células. En nuestro análisis de 61 pacientes con MB, la expresión de miR-199b-5p en los casos no metastásicos fue significativamente mayor que en los casos de metástasis (p = 0,001). Correlación con la supervivencia de estos pacientes con altos niveles de expresión de miR-199b mostró una tendencia positiva a una mejor supervivencia global de los pacientes de bajo expresar. Estos datos muestran la baja regulación de miR-199b-5p en MB metastásicos sugieren un posible mecanismo de silenciamiento a través de alteraciones epigenéticas o genéticos. Tras la inducción de de-metilación usando 5-aza-desoxicitidina, una menor expresión de miR-199b-5p fue visto en un panel de líneas celulares MB, con el apoyo de un mecanismo epigenético de la regulación. Por otra parte, dos líneas celulares (Med8a y UW228) mostraron importantes sobre regulación de miR-199b-5p tras el tratamiento. La infección con células MB en un modelo de xenoinjerto inducida en el cerebelo de ratón y el uso de un adenovirus que lleva miR-199b-5P indican un beneficio clínico a través de esta influencia negativa de miR-199b-5P sobre el crecimiento tumoral y en el subconjunto de MB stem- células similares a las células, proporcionando una prueba más del concepto.
Conclusiones /Importancia
a pesar de los avances en nuestra comprensión de la patogénesis de la MB, un tercio de estos pacientes siguen siendo incurables y los tratamientos actuales pueden significativamente daños supervivientes a largo plazo. Aquí nos muestran que la expresión de miR-199b-5p se correlaciona con metástasis de propagación, la identificación de un nuevo marcador molecular para una clase de riesgo precario en pacientes con MB. Además, muestran que en un modelo de xenoinjerto, MB carga tumoral puede reducirse, lo que indica el uso de miR199b-5p como una terapia adyuvante después de la cirugía, en combinación con la radiación y la quimioterapia, para la mejora de anti-cáncer terapias MB y la calidad paciente de vida. Hasta la fecha, este es el primer informe que la expresión de los genes miARN puede agotar las células madre tumorales, lo que indica una aproximación terapéutica interesante para la orientación de estas células en los tumores cerebrales
Visto:. Garzia L, Andolfo I, Cusanelli E, Marino N, Petrosino G, De Martino D, et al. (2009) microARN-199b-5p cáncer deteriora las células madre a través de la regulación negativa de HES1 en el meduloblastoma. PLoS ONE 4 (3): e4998. doi: 10.1371 /journal.pone.0004998
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Instituto de Investigaciones Ordway, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Noviembre 2008; Aceptado: 23 de febrero del 2009; Publicado: 24 Marzo 2009
Derechos de Autor © 2009 Garzia et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por tubería FP6-EET LSH-CT-2006 a 037.260 (MZ), FP7-HEALTH-Tumic F2-2008-201662 (MZ), Associazione la Lotta contro al neuroblastoma Italiana "Progetto Pensiero" (AI, MZ), AIRC subvención de 2007 (MZ), Progetto AIRC Tumores Pediatrici 2008 (MZ). Associazione abierto neuroblastoma (AI), a Scuola Europea di Medicina Molecolare (SEMM-CEINGE) Fellowship (CE), y AIRC-firc becas (LG, NM). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los microARN (miRNA) son los ARN de cadena simple de $ ~ $ 22 nucleótidos de longitud, y constituyen una nueva clase de reguladores de genes [1]. En los animales, los miRNAs tienen efectos reguladores a través de su unión a sitios complementarios imperfecto dentro de las regiones 3 'no traducidas (3'UTRs) de mRNA de sus objetivos. La expresión alterada de muchos miRNAs se ve en varios tipos de tumores: por ejemplo, Los linfomas de células B (agrupado miR-17) [2], [3], linfomas malignos (miR-15a, miR-16-1; focalización BCL2) [4], tumores de glioblastoma (miR-21up-regulación) [5] , neoplasia colorrectal (miR-143, miR-145 hacia abajo-regulado) [6], el cáncer de pulmón (miR-29) [7], y el cáncer de mama (miR-10b) [8], con varios tipos más de tumores analizados.
a continuación, nos hemos centrado en el más común de los tumores cerebrales malignos, meduloblastomas (MBS). MBs parecen originarse a partir de células madre y a partir de precursores de gránulos de neuronas en la capa de gránulos externa del cerebelo [9], o alternativamente, a partir de precursores multipotenciales en la zona ventricular del cerebelo [10] - [12]. Desde un punto de vista clínico, los tratamientos multimodales actuales incluyen la resección quirúrgica radical seguida de radiación y la quimioterapia. Mientras estos tratamientos pueden mejorar la tasa de supervivencia, MB permanece incurable en aproximadamente un tercio de estos pacientes. La principal causa de la muerte se asocia con recurrencia diseminación tumoral, momento en el cual las opciones terapéuticas actuales tienen poca eficacia [13]. Estos tratamientos también son tóxicos y pueden dar lugar a discapacidades a largo plazo [14] - [16]. En consecuencia, existe una necesidad sustancial de novela,, terapias de baja toxicidad eficaces para los niños con meduloblastoma.
células MB pueden contener también funcionalmente importantes subconjuntos de células madre con propiedades similares que son únicamente capaces de propagar el crecimiento del tumor [17], [18]. Estudios recientes han demostrado que ambos progenitores y las células madre pueden responder a la vía Hedgehog Sonic-(Shh) y pueden servir como células de origen de los MBs [19].
actividad de Notch se ha demostrado que regulan los gránulos de las células progenitores de la que surgen MBs, con el número de copias de genes Notch2 aumentaron en 15% de los MBs [12], [20]. expresión persistente de
bHLH HES1
, el gen Notch-sensible director, previene tanto la migración de las células progenitoras neurales fuera de la zona ventricular y la expresión de marcadores neuronales [21]. Los ratones que carecen
Hes1
muestran neurogénesis prematura, visto como la regulación de factores de transcripción bHLH neuronales, lo que resulta en grandes defectos del tubo neural [22]; células progenitoras derivadas de estos ratones han deteriorado potencial de auto-renovación, con un compromiso hacia un linaje neuronal [23].
De manera significativa, la expresión de HES1 en MB se ha asociado con un peor resultado clínico [24]. Es de destacar que una interacción con Shh en el desarrollo precursores de células granulares se ha postulado [25], al igual que la diafonía con otras vías, por ejemplo, el gen del grupo Polycomb
IMC-1 | [26].
Nuestro enfoque se inició con una búsqueda de miRNAs (registro miARN) con el objetivo genes implicados en la vía de Notch, y hemos identificado miR199b-5p como la orientación HES1, el efector de Notch. Se demuestra que la expresión de miR-199b-5p se pierde en los pacientes metastásicos y postular un mecanismo de regulación siguiente silenciamiento epigenético de metilación a través de procesos que ocurren durante la carcinogénesis, la identificación de un nuevo marcador molecular para una clase de riesgo precario en pacientes con MB. expresión-5p MiR199b afecta específicamente el tallo de las células del cáncer (CD133 +) de la población, lo que se traduce
in vivo
en el deterioro del desarrollo del tumor MB en el modelo de ratón cerebelo xenoinjerto, proporcionando así una prueba de concepto. Como microRNAs han sido recientemente demostrado ser herramientas útiles para silenciar a los cánceres, que podría ser capaz de llenar este vacío a través de su control de múltiples genes diana. Proporcionamos aquí evidencia para el uso de miRNAs en la clínica, con nuestra terapia antitumoral la orientación de las células madre del cáncer de miR-199b-5p.
Resultados
HSA-mir-199b- 5p silencios Hes1 expresión a través de la unión 3'UTR
Nuestro
in silico-
análisis de la base de datos de miRBase objetivos [27] fue dirigido hacia la identificación de miRNAs potencialmente dirigidos HES1, un efector de la vía de Notch , un mecanismo fundamental en la regulación de la proliferación celular MB. MiR-199b-5p y miR-199a-5p fueron los mejores miRNAs de puntuación, y se prevé que obligar a la 3'UTR del ser humano bHLH HES1. Nos centramos en el miR-199b-5p debido a su capacidad para disminuir la expresión transitoria en virtud HES1 sobre-expresión, en comparación con el miR-199a-5p (Texto S1, Fig. S1 A, B). MiR-199b-5p se pierde en los tumores de pulmón [28] y se ha asignado a una región genómica suprimido en el cáncer de vejiga [29]. MiR-199a * (también conocido como miR-199a-5p, y con una secuencia idéntica a miR-199b-5P) también se reduce en el carcinoma hepatocelular [30] - [32]. El análisis de la expresión de miR-199b-5p en líneas celulares de dos MB, el tejido humano adulto y cerebelo de ratón, se muestra en el texto S1, Fig. S1C, D y S2A, B.
Para determinar si HES1 es un objetivo de miR-199b-5p, el HES1 3'UTR fue clonado aguas abajo de un vector gen indicador de luciferasa; pre-miR-199b-5p también se clonó en un vector de expresión de mamíferos (véase el texto S1). células HEK-293 se transfectaron a continuación con la actividad de luciferasa relativa que muestra que el miR-199b-5P co-transfección disminución de la actividad del gen indicador, lo que indica la unión con el 3'UTR y la desestabilización de la traducción productiva de mRNA de luciferasa (Texto S1, Fig. S1E ). Como controles, HES1 3'UTR mutado en el sitio de unión de miR-199b-5P no fue afectada por miR-199b-5P (Texto S1, Fig. S1E), y cuando un oligorribonucleótido 2-O'-metil (2-OM) complementario a madurar miR-199b-5p fue co-transfectadas, que contrarresta los efectos de la transfección de miR-199b-5p, la restauración de la actividad de reportero (Texto S1, Fig. S1E). Se obtuvieron resultados similares en células Daoy MB (Texto S1, Fig. S1F).
Para determinar el papel de miR-199b-5p en biología celular MB, la construcción de expresión de miR-199b-5p se transfectó en Daoy se seleccionaron las células, y varios clones estables que sobre-expresan el miR-199b-5p. El exceso de expresión fue confirmada por PCR en tiempo real (Texto S1, Fig. S1G). Tres clones demostrado un descenso de los niveles de proteína HES1, uno de los cuales (199bSC1) no mostró HES1 detectable. Se seleccionaron los clones 199bSC1 y 199bMC1 para una mayor investigación (Texto S1, Fig. S1H). Estos efectos de miR-199b-5p en la expresión de la proteína HES1 no se limitaron a los clones estables o células Daoy, como células D283MED transfectadas transitoriamente con la construcción de expresión de miR-199b-5p también mostró niveles HES1 reducidas (Texto S1, Fig. S1B ).
para fortalecer estos hallazgos, el clon 199bSC1 se transfectadas con 2-OM antisentido para miR-199b-5p y se utilizó como control negativo (Texto S1, Fig. S1I). Aquí, los niveles HES1 fueron restaurados, lo que sugiere el bloque 2-OM de HES1 represión por parte de miR-199b-5p, que proporciona una confirmación adicional de que los objetivos de miR-199b-5p Hes1 directamente. Otros posibles objetivos de miR-199b-5p también fueron investigados en esta forma (Texto S1, Fig. S2C, D).
El exceso de expresión de miR-199b-5p reduce la proliferación celular y altera el potencial clonogénico de líneas celulares MB
los clones 199bSC1 y 199bMC1 habían reducido las tasas de proliferación en condiciones normales de cultivo, en comparación con el clon de control. Por lo tanto, buscamos posibles alteraciones del ciclo celular en estos clones. análisis FACS en el clon 199bSC1 mostró una disminución del 31% en las fracciones de la fase S, y un aumento de células en G0-G1 de 15%, en comparación con el clon de vector vacío (Fig. 1A). Esto sugirió que la salida del ciclo celular tiene un papel en la tasa de proliferación reducida de la célula Daoy 199bSC1 clon. En contraste, el clon 199bMC1 no mostró cambios significativos en su ciclo celular. Creemos que estos resultados se deban a una menor eficiencia global de 199bMC1 para reducir los niveles de proteína HES1. Estos fenotipos del ciclo celular se tradujo en tasas de disminución de la proliferación
in vitro
, según lo evaluado por
in vitro
ensayos de proliferación que comparan los clones 199bSC1 y 199bMC1 con un clon de vacío-vector y un transfectante transitorio para 2-OM diseñada contra el miR-199b-5p (fig. 1B). Tanto el 199bMC1 y los 1999SC1 clones mostraron una reducción significativamente las tasas de proliferación. La transfección de este antisentido 2-OM indujo un marcado aumento en la proliferación del clon 199bSC1 estable, de acuerdo con los niveles de expresión restauradas de HES1. Estos resultados sobre la proliferación celular Daoy se confirmaron también con D283 y ONS76 células (Texto S1, Fig. S2F). Los efectos de miR-199b-específica 2-OM también fueron confirmados en las células de tipo salvaje Daoy, donde potencialmente endógena actúa sobre el miR-199b (Texto S1, Fig. S2G).
A) Representante FACS análisis con yoduro de propidio que muestra una disminución en los porcentajes de células en fase S y un aumento en G0-G1 para la estable 199bSC1 clon. La ausencia de señales de hombro con el pico rojo G0-G1 en los clones 199bSC1 y 199bMC1 excluye los procesos de apoptosis. B) Ensayos de proliferación de 3-4,5-dimetiltiazol-2-il-5-3-carboximetoxifenil-2-4-sulfofenilo-2H-tetrazolio sal (MTS), que muestra la disminución de las tasas de proliferación del clon 199bSC1 estable (triángulos rojos) y el clon 199bMC1 (cruces verdes), en comparación con el clon estable con el vector vacío solo (diamante azul). Este efecto de miR-199b-5p sobre-expresión se redujo en un 2-OM transfección (cuadrados de color rosa). Los datos mostrados son la media ± SD de dos experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. C) la expresión Rapresentative ARNm de diferenciación (por ejemplo Mash1, MATH3 y Neurogenina 2) y la proliferación (por ejemplo, c-myc, ciclina D1) marcadores sobre el miR-199b-5p sobre-expresión, según lo revelado por PCR en tiempo real, comparando el 199bSC1 estables y clones 199bMC1 con el clon del vector vacío. D) El clon 199bSC1 estable para miR-199b-5p muestra la formación de colonias alterada en ensayos de agar blando. El gráfico muestra colonias contadas como medias ± SD de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. E) de transferencia de Western usando anticuerpos Representante anti-ciclina D1 anti-c-Myc y muestran estas dos proteínas para ser reguladas por en el clon 199bSC1 estable; véase también el análisis densitométrico en el panel derecho. F) En cuanto a E, que muestra las proteínas GABRA6 y math3 regulados hasta después de la expresión de miR-199b, lo que sugiere la inducción de la diferenciación. Los anticuerpos anti-laminina-beta se utilizaron para la expresión nuclear normalizado proteína c-Myc y ciclina D1. Los anticuerpos anti-β-actina se utilizaron para GABRA6 citoplasmática normalizado y MATH3 proteínas expresión.
Los efectos de la inducción de miR-199b-5p fueron evaluados en marcadores moleculares de la proliferación y diferenciación de una real enfoque de tiempo. Como se ilustra en la Fig. 1C, MAP2, que se expresa principalmente en neuronas maduras [33], fue hasta reguladas en los clones estables 199bSC1 y 199bMC1. Del mismo modo, se han descrito células Daoy expresar GFAP después de la diferenciación con fenilbutirato [34], y en el clon 199bSC1 estable, se aumentaron los niveles de GFAP. En general, la imagen de la expresión génica en nuestra línea celular estable sobre-expresión de miR-199b-5p está de acuerdo con el fenotipo que se ha visto en el cerebro de la
Hes1 - /-
ratón [23]. Entre los otros genes, GABRA6, un marcador de la diferenciación de células granulares del cerebelo, también fue significativamente sobreexpresado en los clones estables (Fig. 1C).
Una cascada afinado de factores de transcripción bHLH positivos y negativos es central para la neurogénesis, con los genes, como
Mash1
,
MATH3
y la neurogénesis
Ngn2
la inducción, y los ratones mutantes que muestran HES1-regulación de estos bHLHs de tipo activador [ ,,,0],35]. Ambos clones estables de miR-199b-5p mostraron aumentos en la expresión de pro-bHLH neuronal. De acuerdo con su reducción en la tasa de proliferación, los marcadores de proliferación c-myc y ciclina D1 se redujeron. De los dos clones analizados, 199bSC1 mostró el fenotipo más consistente; explicamos estos resultados por el silenciamiento HES1 más eficiente en este clon.
Desde el clon estable 199bSC1 miR-199b-5p mostró un fenotipo más fuerte y consistente, el próximo examinó en un ensayo clonogénico estándar, para determinar si el crecimiento independiente de anclaje se vio afectada por el miR-199b-5p. Aquí, hubo una reducción del 80% en el potencial de la formación de colonias, en comparación con el clon de vacío-vector (Fig. 1D). De acuerdo con esta reducción en la tasa de proliferación, los marcadores de proliferación c-Myc y la ciclina D1 se redujo (Fig. 1E). Se confirmó también a nivel de proteínas que GABRA6 y MATH3 fueron reguladas en el clon 199bSC1 (figura 1F.); este último es conocido por ser reprimida directamente por HES1 [35].
miR-199b-5p agota el compartimento lateral de la población en la línea celular Daoy, y regula negativamente tumorales poblaciones de células madre MB
la vía de Notch se ha relacionado con la fracción de células tumorales MB que albergan los marcadores de células madre precursoras [36], y HES1 tiene un papel en la auto-renovación de las células progenitoras multipotentes [23]. Esta población lateral (SP) de las células tumorales tiene un papel en el injerto de un tumor en modelos animales [37]. por tanto, hemos examinado la influencia de miR-199b-5p en la población de células tumorales que excluyen el colorante Hoechst 33342, una estrategia para identificar estas células SP. Esto se determinó mediante citometría de flujo en la línea celular Daoy, el SP de las cuales es responsable de hasta el 4,9% de las células, en comparación con las células tratadas con verapamilo (el control negativo) (Texto S1, Fig. S3 A, B). Este tratamiento verapamil se basa en la inhibición de la verapamil ion-bombas responsable de Hoechst 33342 exclusión del colorante, lo que permite que las células SP para ser visto [38]. La tinción de las células 199bSC1 y 199bMC1 indicó que el SP se realizó ablación, ya que había cerca de diferencias entre la muestra tratada con Hoechst y la Hoechst más muestras de verapamilo (Texto S1, Fig. S3C-F).
también se sabe que las células madre tumorales del sistema nervioso central expresan el antígeno CD133, y que estas células son las únicas capaces de la formación de tumores en ratones NOD-SCID [18], [39]. Además, la vía de Notch tiene un papel central en el proceso de auto-renovación, con su inhibición conduce a la depleción de las células CD133 positivas (CD133 +) Daoy través de la inducción de la apoptosis de las células progenitoras como [36]. Recientemente se demostró que las células CD133 + Daoy promover el crecimiento del tumor en el flanco de ratones desnudos, mientras que las células CD133- no [40]. Por estas razones, se evaluó la positividad de las células CD133 Daoy en comparación con los 199bSC1 estables y 199bMC1 clones (Fig. 2). En este caso, las células de tipo salvaje fueron CD133 + 14,8%, mientras que en los clones estables 199bSC1 y 199bMC1 se redujo hasta el 2,4% y el 6,5% CD133 +, respectivamente (Fig. 2C-F). Así pues, esto demuestra un papel de miR-199b-5p en la regulación negativa de esta fracción de las células iniciadoras de tumores.
A-F) analiza Representante de la FACS 199bSC1 estable (D) y 199bMC1 clones (F) mostraron una disminución en el porcentaje de células que fueron positivas para el marcador de células madre CD133 (B); A, C y E son los controles negativos (sin anticuerpos).
HES1 sobreexpresión rescata el fenotipo clon de miR-199b-5p
Para confirmar que el fenotipo celular se correlaciona directamente con la baja regulación de HES1, se realizó un
in vitro de células
experimentos de rescate en. Hemos elegido para rescatar el fenotipo más consistente, que se muestra por el clon 199bSC1 estable. Cuando de longitud completa HES1 cDNA se clonó y se transfectó en el establo de células Daoy 199bSC1 clon, la expresión HES1 fue restaurada, evaluado por inmunotransferencia (Fig. 3A). También notamos la re-expresión de ciclina D1, que se había reducido regulado en el clon 199bSC1 estable. expresión HES1 restaurado también revirtió los efectos de miR-199b-5p sobre la proliferación celular (Fig. 3B). Al mismo tiempo, la transfección de HES1 cDNA en el clon 199bSC1 disminuyó la inducción de bHLHs pro-neuronales y marcadores de diferenciación, y el aumento de los niveles de genes de proliferación (Fig. 3C). Además, la transfección transitoria de HES1 cDNA en el clon estable 199bSC1 condujo a un aumento en el porcentaje de células en fase S, y una eliminación del bloque en la fase G0-G1 (Fig. 3D). Esto fue contrario a los efectos observados en el clon 199bSC1 estable sobre-expresión de miR-199b-5P (véase la Fig. 1C y la Fig. 3C). También se evaluaron los efectos de la expresión restaurada de HES1 en el SP del clon 199bSC1 estable. Cuando se evaluaron las células transfectadas HES1 (GFP positivo) por su capacidad para excluir colorante Hoechst, mostraron un aumento mínimo en SP, de hasta 1,3%. Aunque mayor que la medida para los clones estables 199b (Fig. 3E-H), esto todavía estaba por debajo del nivel de células SP para las células de tipo salvaje (Texto S1, Fig. S3). Esto es probablemente debido al corto tiempo de re-expresión de HES1 después de la transfección transitoria, lo que podría no ser suficiente para permitir el rescate fenotipo completo. a continuación, tratamos de rescatar a los efectos sobre el compartimento de CD133; Sin embargo, la transfección transitoria de HES1 en el clon 199bSC1 no resultó en un aumento significativo en las células CD133 +. Creemos que esto es debido al corto tiempo de transfección transitoria, que no permite una reorganización de la jerarquía de células Daoy.
A) de transferencia de Western Representante y análisis densitométrico muestra que el rescate de la expresión HES1 por exceso expresión de ADNc HES1 en el establo 199bSC1 clon restaura la expresión de ciclina D1. B) Ensayo de proliferación por 3-4,5-dimetiltiazol-2-il-5-3-carboximetoxifenil-2-4-sulfofenilo-2H-tetrazolio sal (MTS) que muestra aumentó la tasa de proliferación del clon 199bSC1 estable con la expresión HES1 (oscuro cuadrados azules), en comparación con el clon estable 199bSC1 solo (diamantes de color azul claro). Los datos mostrados son la media ± SD de dos experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. C) la expresión Rapresentative ARNm de diferenciación (por ejemplo Mash1, MATH3 y Neurogenina 2) y la proliferación (por ejemplo, c-myc, ciclina D1) marcadores sobre células-rescate con HES1 en el establo 199bSC1 clon, en comparación con las células de tipo salvaje, como lo revela PCR en tiempo real. La expresión de GABRA 6 y MAP2 son las reguladas en el experimento de rescate. D) análisis FACS Representante del clon 199bSC1 estable HES1 que expresan muestra un aumento en la fracción de células en fase S, y una disminución en G1, con respecto al clon 199bSC1 estable solo. E-H) El efecto de la expresión de miR-199b-5p en el SP de las células Daoy se invierte por HES1 reexpresión. 199bSC1 clon estable se transfectadas con ADNc HES1 y un plásmido GFP-codificación, después se trató después de 48 horas con Hoechst y verapamilo (E-F) o Hoechst sola (G-H) y se analizaron por FACS. Las células positivas para GFP (puerta P5), Panel de E y G, se analizaron para la presencia de colorante con exclusión de las células (F-H, puerta P6). Las células no transfectadas (GFP negativas puerta P3), no han sido analizados con.
El crecimiento del tumor se reduce en xenoinjertos derivados del clon estable 199SC1
Los resultados aquí indican que el miR-199b- 5p es un inhibidor potencial de la formación de tumores. Por lo tanto, para investigar el papel de miR-199b-5p en un
in vivo
modelo de tumor en, estabilizamos la 199bSC1 y controlar Daoy clones con un vector de expresión que lleva el ADNc de la luciferasa. Los clones obtenidos se ensayaron para determinar los niveles de expresión de luciferasa y también validados para la retención del fenotipo de los padres, en términos tanto de HES1 y la expresión de miR-199b-5P (véase el texto S1, Fig. S4A-D). Estos clones 199b-Luc1 y Ctl-Luc-4 Daoy estables se inyectan a continuación en los flancos izquierdo y derecho, respectivamente, de cinco ratones desnudos /desnudos atímicos. El crecimiento del tumor fue evaluada por semanal
in vivo
bioluminiscencia de imágenes (BLI) de los ratones inyectados. A las ocho semanas, todos los ratones mostraron masas visibles en cada flanco de mando, mientras que sólo tres flancos inyectados con 199b-Luc1 mostró injerto tumor. En general, se observó una diferencia significativa en los volúmenes tumorales entre los flancos de control y los flancos miR-199b-5P (Fig. 4A). Las mediciones de bioluminiscencia mostraron reducciones significativas en la emisión para los lados miR-199b-5P durante el crecimiento del tumor, en comparación con los lados de control (por ejemplo, ratón#4, Fig. 4B). Después de nueve semanas, cuatro de los cinco ratones mostraron diferencias estadísticamente significativas en estas señales de bioluminiscencia entre los lados de control y los lados de contador de miR-199b-5p (Fig. 4C). Tomados en conjunto, estos datos muestran que el miR-199b-5p puede poner en peligro la formación de tumores
in vivo en ratones desnudos
/desnudos atímicos. Los xenoinjertos de tumores de ratón#5 y#4 de ratón fueron explantados y se analizó el miR-199b-5p y expresión HES1 y evaluados por histopatología (Texto S1, Fig. S4E-H).
A) experimento xenoinjerto más de nueve semanas, después de sc inyección de cinco ratones con células de control (Daoy secundarios CTR) y células Daoy sobre-expresión de miR-199b-5p (lado 199b). Con células CTR, los tumores fueron detectables macroscópicamente en 5/5 ratones; con sobre-expresión de las células, en 3/5 ratones. Diferencia de volumen del tumor entre el CTR y 199b inyecta lados después de nueve semanas de crecimiento fue estadísticamente significativa, tal como se indica (medias ± SD). B) la emisión de fotones de ratón#4 después de nueve semanas de crecimiento del tumor. El lado 199b (199bLuc-1) tuvo una emisión de fotones consistentemente más baja que el lado de control (CTL-Luc-4). También se muestran las comparaciones de las dimensiones del tumor. C) Cuando la emisión de fotones (ver B) se convirtió en el número de células; uno de cinco ratones no mostraron diferencias significativas (media ± SD) (no pareada de dos colas
t
de prueba). D) por emisión de fotón de 3 ratones inyectados en el cuarto ventrículo con, respectivamente: 199bLuc-1, Ctl-Luc-4 infectados con el simulacro AdV5, y Ctl-Luc-4 infectado con un miR-199b-5p AdV5. E) cerebro entero del animal y sitio de inyección (flecha blanca). tinción con hematoxilina /eosina de cerebelo; flecha negro, el sitio de iniciación de la tumorigénesis. F) BLI de ratones inyectados como para D, después de un mes de crecimiento del tumor. Las diferencias entre los grupos son estadísticamente significativas. G) BLI de dos ratones seleccionados que muestran el desarrollo de la carga tumoral con Ctl-luc4-AdV5-Mock#7, y reducción con Ctl-luc4-AdV5-199b#3 en el tiempo (0-8 semanas). H) tinción de hematoxilina-eosina de cerebelo de AdV5-Mock#2 y#3 AdV5-199b animales a las 10 semanas después de la inyección ortotópico, mostrando células tumorales circundantes capa granular externa y dentro del ventrículo IV (estrella blanca). En azul, tinción DAPY, junto con la detección de GFP. Magnificación como se indica.
Para investigar más a fondo la capacidad de miR-199b-5p para regular el crecimiento MB, inyectamos el clon estable 199bSC1 ortotópica en el cuarto ventrículo de ratones desnudos de 5 semanas de edad (Fig . 4D, E). Después de cuatro semanas de
vivo
no invasivo de monitorización de tumores de crecimiento en por BLI, en ratones inyectados con la 199bSC1 clonar el crecimiento del tumor fue considerablemente menor que la observada en el control (CTL) lado -Cells-inyectado. Como una confirmación adicional de estos efectos, también inyectamos las células CTL infectadas con un adenovirus que codifica para miR-199b-5P: de acuerdo con los hallazgos anteriores, estos ratones también mostraron una reducción BLI después de 4 semanas (Fig 4F.). Más adquisiciones BLI después de 8 semanas desde la implantación de las células se muestran en la Figura 4G. En este momento, dos ratones se sacrificaron y se analizaron adicionalmente para histopatología. tinción de hematoxilina-eosina de tejidos congelados mostró masa del tumor en el cerebelo de AdV5-Mock#2 y#3 AdV5-199b inyectaron animales. Serial secciones histológicas congeladas paralelas fueron examinadas por microscopía de fluorescencia de la proteína fluorescente verde endógena (GFP) expresada por las células infectadas por adenovirus. A continuación, se evaluó la expresión de proteínas por tinción inmunohistoquímica HES1 de otros tejidos embebidos en parafina, utilizando un anticuerpo anti-HES1. En general, se evaluaron los niveles de persistencia de la expresión de adenovirus en las células infectadas, ya que la baja regulación de la expresión HES1 debido a miR199b que lleva la expresión de adenovirus, siguiendo así el crecimiento del tumor con el tiempo por BLI ver Figura 4G-H, y los anticuerpos tinción Figura S4L -M (Hes1, Ki67, GABRA6, nestina, Matemáticas-3, ver detalles en el texto información S1). Entonces, dos ratones desnudos adicionales (AdV5-Mock#7; AdV5-199b#5) se sometieron a estudios de PET-CT en 12 semanas después de la inyección, para evaluar la actividad proliferativa del tumor (Fig. 5A, B). Datos adicionales de BLI junto con dos películas (Película S1 y S2) de la película que muestran la reconstrucción 3D del injerto ortotópico se describen en el texto Información S1 y mostró en la Figura S6. Estos análisis mostraron una reducción significativa de la masa tumoral en el AdV5-199b#5 animales, en comparación con los ratones de control#7 AdV5-Mock, con PET-CT análisis también proporcionar volúmenes tumorales (0.024 cm
3 frente a 0,044 cm
3, respectivamente), como se describe en el texto S1. En general, estos datos indican un efecto beneficioso de la sobre-expresión de miR199b-5p, como un regulador negativo del crecimiento tumoral de las células MB en este xenoinjerto ortotópico modelo de desnudos-ratón.
Imágenes de fusión PET-CT de AdV5- Mock#7 (a) y#5 ratones AdV5-199b (B) a las 12 semanas de la cirugía y la inyección, con la representación de volumen 3D y visualización simultánea de las zonas de captación de FLT (azul-verde, flechas blancas). Un defecto óseo más amplia en la parte occipito-parietal del cráneo es evidente en la AdV5-Mock#7 ratón. Abajo:. Tabla de medidas (cm
3) de la masa tumoral llevado a cabo con la adquisición de PET-CT (como se describe en el texto S1) guía empresas
La expresión de miR-199b-5p en los tumores de meduloblastoma humanos
para determinar si miR-199b-5p se expresa de manera efectiva en salud pediátrica cerebelo humano, hemos utilizado 13 muestras de control obtenidos del NICHD cerebro y Banco de Tejidos de trastornos del desarrollo, de la Universidad de Maryland, EE.UU.. Se midió la expresión de miR-199b-5p, comparando cinco muestras de cerebelo obtenidas de niños de 0-1 años de edad, con seis de los niños 13-16 años de edad (Fig. 6A). MiR-199b-5p mostró una mayor expresión en los explantes de los controles sanos más jóvenes (prueba de Mann-Whitney,
P
= 0,006).
A) Box-plot de los niveles de expresión de miR 199b-5p en el cerebelo humano sano en los dos rangos de edad indicada. MiR-199b-5p mostró una mayor expresión en explantes de controles más jóvenes (prueba de Mann-Whitney,
P
= 0,006). B) miR-199b-5p altamente expresando casos son en su mayoría M0
P = 0,001
(prueba de chi-cuadrado de Pearson). estimaciones C) de Kaplan-Meier de supervivencia que comparan pacientes con bajos
frente
alta (con respecto a la mediana) los niveles de expresión de miR-199b-5p (45 pacientes con datos de seguimiento disponibles). D) la expresión de miR-199b-5p por PCR en tiempo real en un panel de líneas celulares de cinco MB no tratados o tratados con 5-Aza-C (DAC - /+); Como se muestra en la Fig.