Extracto
Antecedentes
asesino natural (NK) células juegan un papel importante en la inmunoterapia antitumoral. Pero indicó que las células tumorales afectadas, posiblemente, en las funciones normales de las células NK a través de algunos mecanismos de moléculas en el microambiente tumoral.
Materiales y métodos
Nuestro estudio analizó el cambio sobre las células NK (células superficiales marcadores receptores NK ) a través de inmunofluorescencia, citometría de flujo y la PCR en tiempo real, la función del bazo de ratón muerto de las células NK y la línea de alta /baja humana del cáncer de pulmón de células mediante co-cultivo. Además hemos certificado el resultado anterior en el modelo de cáncer de pulmón de ratón SCID.
Resultados
Nos mostraron que la infiltración de células NK en la periferia del tumor se relaciona con el pronóstico de cáncer de pulmón de los pacientes. Y el número de células NK infiltrarse en el tejido de cáncer de pulmón está estrechamente relacionado con los tipos patológicos, el tamaño del cáncer primario, historia de tabaquismo y el pronóstico de los pacientes con cáncer de pulmón. La expresión de los receptores de las células NK inhibidor aumentó notablemente en microambiente tumoral, en el opuesto, los receptores de la expresión de las células NK activadas disminuyen magníficamente.
Conclusiones
El tiempo de supervivencia de pacientes con cáncer de pulmón fue positiva relacionado con NK grado de infiltración celular en el cáncer de pulmón. Por lo tanto, la baja regulación de NKG2D, Ly49I y la sobre regulación de NKG2A pueden indicar mecanismo de tolerancia inmune y facilitar la metástasis en el ambiente del tumor. Nuestra investigación ofrecerá más la teoría de la estrategia clínica sobre inmunoterapia tumoral
Visto:. Jin S, Deng Y, Hao J-W, Y Li, Liu B, Yu Y, et al. La modulación fenotípica (2014) Células NK en Medio Ambiente del cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (10): e109976. doi: 10.1371 /journal.pone.0109976
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 17 de mayo de 2014; Aceptado: September 13, 2014; Publicado: 9 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Jin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Investigación joven gente de las subvenciones de la National Undécima-Cinco año clave proyectos de trabajo de China (Nº 2006BAI02A01) , el Programa Nacional 973 (n ° 2010CB529405), Programa de Tianjin Ciencia Innovación Sistema (núm 07SYSYSF05000, 07SYSYJC27900), la Fundación China y Suecia Cooperativa (núm 09ZCZDSF04100), la beca de la Fundación Nacional de Ciencia Natural de China (No 81201828), joven Fundación Fundación Popular de la provincia de Heilongjiang de China (n QC2012C013), Departamento de Salud de la provincia de Heilongjiang de China (n 2011-124) y el hospital de cáncer de la Universidad médica de Harbin gran proyecto (n: JJZ-2010-01). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es uno de los tumores malignos más comunes en el mundo, que tiene una alta morbilidad y mortalidad y representa aproximadamente el 25,4% de todos los tumores. Ha habido una tendencia al alza de la tasa de incidencia en los últimos años [1] - [4]. Los datos de la American Cancer Society publicados muestran que 222,520 casos de cáncer respiratorio y 157.300 casos de muerte en el año 2010, que está en el primer lugar de morbilidad y mortalidad de todos los tumores malignos [5]. A estadísticas clínicos de fase IV NSCLC en China mostraron que la tasa de supervivencia de 1, 2, 3, 4 y 5 años fue del 44%, 22%, 13%, 9% y 6%, respectivamente [6]. Actualmente, la resección quirúrgica sigue siendo el método principal para prolongar el tiempo de supervivencia de cáncer de pulmón, pero la invasión y la metástasis de cáncer de pulmón es el mayor obstáculo para mejorar la eficacia de el pronóstico de cáncer de pulmón. Para el estudio en profundidad del comportamiento maligno cáncer de pulmón y se centran en el tratamiento integral del cáncer de pulmón metastásico, es necesario establecer un modelo animal adecuado para estudiar la recurrencia del cáncer de pulmón y metástasis y su terapia integral
.
asesinas naturales (NK ) de células, también conocida como linfocitos granulares grandes, es una célula inmune independiente y no específica. No tiene ninguna restricción de MHC para apuntar el reconocimiento y la destrucción de células, y puede matar directamente las células tumorales y las células diana infectadas por virus sin antígeno pre-sensibilizadas [7], [8]. También se puede producir un gran número de citoquinas inmunes-activa para mejorar o ampliar su efecto anti-tumor, que puede ser considerada como la primera línea del sistema de defensa del huésped [9]. Varias evidencias experimentales demostraron el importante papel de las células NK en la eliminación de células tumorales. Vivier et al informe de que una baja citotoxicidad de las células NK en sangre periférica se correlacionó con un aumento del riesgo de cáncer [10]. Además, las células NK que se infiltran en el tejido tumoral se asoció con buen pronóstico en colorrectal [11], gástrico [12], y el pulmón [13] cánceres.
Con el desarrollo de la formación de tumores, las células tumorales malignas e infiltrando células del sistema inmune interactúan y componen el microambiente tumoral. La mayoría de los estudios publicados demostraron que un gran número de células inmunes que infiltran en el tejido tumoral juega un papel importante en mejorar el pronóstico del tumor [14], [15]. Pero como todos conocemos, el pronóstico de los tumores malignos de pulmón asociado es terrible, a pesar de que hay muchas células inmunes en el pulmón. Queremos saber si hay una composición diferencial de la célula inmune se infiltran en las zonas de tejido de pulmón malignos y no malignos, e incluso podría potencialmente contribuir a este efecto. Esendagli G et.al encontró que en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) de los pacientes, las células NK no fueron casi encuentran en las regiones de tejido maligno, las contrapartes no malignas fueron pobladas selectivamente por las células NK y las células NK mostraron actividad citotóxica fuerte ex vivo [16].
Así que el impacto de la expresión del receptor de las células NK y la función puede ser diferente causada por la interacción entre las células NK y tumor en el micro-entorno de tumor. Mediante la exploración de las células NK en el cuerpo y /o cáncer de pulmón micro-entorno, examinar su distribución, la expresión del receptor, el estado funcional con la invasión del cáncer de pulmón, la metástasis y el pronóstico, aclarar el mecanismo de las células NK implicados en el cáncer de pulmón micro-entorno de la celular y los niveles moleculares.
Materiales y Métodos
las muestras tumorales y Ética Declaración
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. Todas las muestras tumorales utilizados en este estudio se obtuvieron del Instituto del cáncer de pulmón de Tianjin y el departamento de patología en el Hospital General de la Universidad de Tianjin médica. Todos los pacientes proporcionados consentimiento informado por escrito para la recogida de muestras y su posterior análisis. Y el estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Ética del Hospital de la Universidad Médica de Tianjin General.
Las parafinas de muestras y el origen de tejido congelado de cáncer de pulmón
Los pacientes serán elegibles para participar en la fase de inducción de la estudiar si tienen: diagnóstico histológico o citológico del NSCLC (incluyendo el carcinoma epidermoide, adenocarcinoma y carcinoma de células grandes); sin previa quimioterapia sistémica, la radioterapia y la terapia biológica para el cáncer de pulmón antes de la cirugía; sin otros antecedentes de cáncer; y ≤80 años de edad.
Las parafinas muestras de muestras se obtuvieron de 84 pacientes con diagnóstico de cáncer de pulmón entre January1st 2008 y el 31 de enero de 2011 (64 hombres y 20 mujeres). La edad media de los pacientes era de 60,7 ± 7,9 años (rango 40 a 78 años). Hay diferentes tipos de patología: 37 pacientes de carcinoma escamoso, 37 pacientes con adenocarcinoma y 10 pacientes con carcinoma de células grandes. En el momento del diagnóstico, los pacientes fueron evaluados según la AJCC /UICC la sexta edición de clasificación de la siguiente manera: el estadio IIA-1 en pacientes IIB-, etapa 4 pacientes, el estadio IIIA-58 pacientes, etapa IIIB-12 pacientes en estadio IV-9 pacientes. Las muestras fueron aplicadas de la Universidad Médica de Tianjin Departamento de Patología.
muestras de tejido congelado se genera a partir de 66 muestras quirúrgicas de cáncer de pulmón entre January1st 2008 y 2011. Hay January1st incluyendo 52 hombres y 14 mujeres. La edad media de los pacientes fue de 60,5 ± 8,4 años (rango 40 a 78 años). Había que incluye diferentes tipos de patología: 28 pacientes de carcinoma escamoso, 28 pacientes con adenocarcinoma y 10 pacientes con carcinoma de células grandes. Los pacientes fueron evaluados según la AJCC /UICC la sexta edición de clasificación de la siguiente manera: los pacientes en estadio IIA-1, etapa IIB-4 pacientes, IIIA-45 pacientes en estadio, IIIB-9 pacientes en estadio, estadio IV-7 pacientes. Las muestras se aplicaron desde Tianjin pulmón Instituto de Investigación del Cáncer.
inmunofluorescencia
análisis de CD56 y CD16
Inmunofenotipos se realizaron de la siguiente manera. En resumen, las secciones incluidas en parafina fijado en formol (4 M) se calentaron por recipientes durante 45 minutos, a continuación, en deparaffinized xileno y rehidratada clasificado en una serie de soluciones de etanol. Las secciones se sumergieron posteriormente en solución cítrico-citrato de sodio (pH 7) y de microondas a alta fuego por 5 min, bajo fuego por 15 min, y enfriamiento natural hasta temperatura ambiente para recuperar la antigenicidad. La peroxidasa endógena se inactivó con 3% de H
2O
2 para 30 min. Después de lavar con PBS, las secciones se incubaron con 2% de BSA durante 2 horas en la temperatura ambiente y después se incubaron con CD56 y anticuerpos CD16 (Santa Cruz, diluido a 1:100) durante la noche a 4 ° C. Las secciones se incubaron con anti-ratón de cabra y anticuerpo de cabra anti-ratón de fluorescencia (Santa Cruz, diluido a 1:200) durante 35 min y la DAPI durante 5 min. Después de lavar con PBS cuarta vez, las secciones fueron de montaje de glicerol (pH 9,0). La fluorescencia roja expresa CD56
+ núcleo de la célula, la fluorescencia verde expresa CD16
+, la fluorescencia azul expresó. Podemos encontrar el CD56
+ y /o CD16
+ expresar en la célula NK. El software de análisis de imágenes SPOT se utilizó en el proceso de análisis. El porcentaje de células CD56 y /o CD16 positivas se determinó por recuento por sección. El recuento de células NK de campo por visión se puntuó de acuerdo a los siguientes criterios: +, los recuentos de células NK de por visión campo & lt; 10; ++, Los recuentos de células NK de por visión campo & gt; 10, & lt; 20; +++, Los recuentos de células NK de por visión campo & gt; 20. Se calcularon todos los campos por sección en tres experimentos independientes.
La extracción de RNA, síntesis de ADNc, y el aislamiento de ADN
El ARN total se extrajo con el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN total fue digerido con R-Nase libre de D-Nase I (Promega, Madison, EE.UU.) y se utiliza para la síntesis de ADNc con el sistema de la transcriptasa inversa (Takara Biotech, Dalian, China).
cuantitativa en tiempo real PCR
La síntesis de ADNc se realizó como se ha descrito anteriormente. El cebador específico del experimento de RT fueron los siguientes: NK1.1: 5'-TCTCTTGAATAAACACACAGCAT -3 ', NKG2A: 5'-CTGAGAAGGATTTTG -3', NKG2D: 5'-TTCTCACAGTTCCTCT -3 ', LY49I: 5'-TTCTATTCTTGCTTTAG -3 '. El primer pares y GAPDH pares de cebadores fueron utilizados para la Q-PCR con el kit de SYBR Premezcla Ex Taq RT-PCR (Takara, Dalian, China) en un PRISM 7900 del sistema en tiempo real ABI (Bio-Rad) con las siguientes condiciones: 95 ° C durante 30 s, 40 ciclos de amplificación (95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 30 s) y un ciclo de fusión de 60 ° C a 95 ° C. Los datos fueron analizados utilizando el software ABI PRISM 7900 Manager. Todas las reacciones se realizaron con tres repeticiones técnica.
Cell
Las altas y bajas de metástasis de pulmón de células grandes líneas celulares de cáncer L9981-Luc y NL9980-Luc de Tianjin Instituto de Cáncer de pulmón [17], [ ,,,0],18] se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Hyclone, América) que contiene suero bovino fetal al 10% (FBS), 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (Hyclone, América) en un incubador completamente humidificado (Nuaire, US Autoflow) a 37 ° C con 5% de CO
2. Las células se mantuvieron en una fase de crecimiento exponencial durante los experimentos.
modelo SCID
(grave inmunodeficiencia combinada) ratones SCID comprados de la Academia China de Ciencias Médicas instituciones animales fueron alojados en animales libres de patógenos instalaciones. Los ratones hembra utilizados fueron de 5-7 semanas de edad al inicio del experimento. ratones SCID hembra (16 animales para cada grupo experimental) se inocularon por vía subcutánea en el derecho inguen con 2 * 10
6 células suspendidas en 150 ul de PBS. Nueve animales del grupo de control no tenían la inoculación. tamaños de los tumores se midieron cada 7 días y su intensidad de fluorescencia se midieron con verdadera esencia de América del sistema de imágenes de la vida (Xenogen IVIS200). Después de 6 semanas de observación, la disección se realizó y explantados tumores, los pulmones y el bazo se retiraron para el análisis ulterior. Estos experimentos se repitieron al menos dos veces para confirmar los resultados. Los protocolos experimentales con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal y los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las Directrices para la experimentación con animales en la Universidad Médica de Tianjin Centro de Investigación del Cáncer.
Linfocitos recoger y citometría de flujo detectan
Los pulmones y los bazos fueron pulidos en pedazos. A continuación, los linfocitos recogen se extrajeron con la separación de linfocitos Medium (Shenzhen, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los porcentajes de células NK se evaluaron y se separaron con citometría de flujo utilizando anticuerpos monoclonales (MoAbs) anti-CD3
- FITC /NK1.1
+ PE (BD Phamingen, San Di ego, CA). Durante el análisis, el CD3
- se determinó /NK1.1
+ Población. Para determinar la expresión en la superficie de los ligandos de células NK en células NK, las células fueron teñidas con el anticuerpo de cabra anti-ratón-FITC NK1.1, CD3- Alexa Fluor 647, NKG2A-FITC, NKG2D-PE, Ly49I-PE (BD Phamingen, San Di ego, CA) durante 30 min a 37 ° C en la oscuridad. El análisis se realizó en el FACS Sort (Becton Dickinson, Mountain View, CA) usando el software Cell Quest (Becton Dickinson) y la expresión de la superficie celular se cuantificó por el valor de las intensidades de fluorescencia medias obtenidas con los mAbs específicos.
co-cultivo
purificada NK1.1
+ /CD3
- células NK (activado con 100 U /ml de IL-2 durante 2 h) a partir de bazo de ratón fueron co-cultivadas con cáncer de pulmón línea celular L9981-Luc /NL9980-Luc como (a) 0.25:1, (B) 0.5:1, (C) 01:01 y (D) 02:01 durante 24, 48, 72 horas. Después de co-cultivo, la intensidad de fluorescencia de las células NK se midió con la verdadera esencia de la vida sistema de imagen de los Estados Unidos.
Cuantitativo PCR en tiempo real
Se aisló ARN de tumores explantados a través de Trizol y inversa transcrito usando cebado especial (Invitrogen). RT-PCR cuantitativa se realizó en un instrumento ABI PRISM 7900, utilizando SYBR ensayos verdes. Los cebadores específicos se enumeran en la siguiente (Tabla 1). La amplificación se realizó como sigue. Después del paso de desnaturalización inicial a 95 ° C durante 30 segundos, las plantillas se desnaturalizaron a 95 ° C durante 5 segundos, los cebadores se hibridaron y extensión de ADN se realizó a 60 ° C durante 30 segundos (cada ciclo se repitió 40 veces). La expresión de los genes diana fue compensada mediante la expresión de GAPDH y presentado por la relación entre la expresión de células de control no tratadas y células tratadas.
El análisis estadístico
Los experimentos se llevaron a cabo tres veces. Los datos se presentan como valores medios ± SD. La evaluación estadística se realizó mediante pruebas de ANOVA de una sola vía o la suma de rangos cuando los datos de medición es distribución de Gauss con el sistema SPSS Software, versión 17.0. Si los datos son datos de enumeración, se utilizó la prueba de Chi-cuadrado.
Los valores P Red de menos de 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. En general la tasa de supervivencia se comparó mediante curva de supervivencia de Kaplan-Meier, log-rank test de suma de rangos utilizado entre los grupos.
Resultados
localización de las células NK y la morfología característica en cáncer de pulmón microambiente
las células NK infiltrado en el tejido de cáncer de pulmón se concentraron principalmente en el estroma tumoral, que constituye el microambiente del tumor (Figura 1). En los tejidos de NSCLC, CD56
+ NK células con 1, 2 y 3 grado de infiltración fueron 44,0%, 22,6%, 33,3%, CD16
+ células NK fueron 45,2%, 22,6%, 32,1%, y CD56
+ CD16
+ células NK fueron 45,2%, 23,8%, 31,0%, respectivamente. No se observó diferencia significativa (
p
& gt; 0,05). entre las células NK con CD56 solo positivo, CD16 positivo y solo CD56CD16 doble positivo en el tejido de cáncer de pulmón (Tabla 1)
El infiltrado las células NK en el tejido de cáncer de pulmón se concentraron principalmente en el estroma del tumor. Las células NK CD56 positivo muestra con solo (fluorescencia verde), CD16 positivo sola (fluorescencia roja) y CD56CD16 doble positivo (fluorescencia amarilla) en el tejido del estroma del cáncer de pulmón.
NK infiltración de células pulmonares y pacientes con cáncer patología clínica característica fisiológica
El grado 1, 2 y 3 con CD56
+ CD16
+ infiltración de células NK fueron 24,3%, 32,4%, 43,2% de los carcinomas de células escamosas, y el 62,2%, 16,2 %, 21,6% en el adenocarcinoma y el 50,0%, 10,0%, 40,0% en el cáncer de pulmón de células grandes, respectivamente. No hubo diferencia significativa de CD56
+ CD16
+ NK grado de infiltración celular entre diferentes tipos patológicos de cáncer de pulmón (
p = 0,019
) (Figura 2, Tabla 2). La expresión de las células NK en el carcinoma de células escamosas fue significativamente mayor que en el adenocarcinoma y carcinoma de células grandes. El grado 1, 2 y 3 con la infiltración de células NK fueron 48,1%, 3,7%, 48,1% en pacientes con cáncer de pulmón sin antecedentes de tabaquismo, fueron 42,1%, 31,7% y 26,3% en los pacientes con antecedentes de tabaquismo. historia de tabaquismo de los pacientes con cáncer de pulmón está relacionado con NK grado de infiltración celular (
p = 0,011
). El grado 1, 2 y 3 con la infiltración de células NK eran 60,6%, 18,4%, 21,1% en el cáncer de T1-T2, y 42,1%, 31,7%, 43,5% en el cáncer de T3-T4, respectivamente. Se encontró una diferencia significativa de NK grado de infiltración celular entre diferentes tamaño del tumor (
p = 0,019
) (Tabla 3).
A. carcinoma escamoso de pulmón; adenocarcinoma de pulmón B.; C. cáncer de pulmón de células grandes de. La expresión de las células NK en el carcinoma de células escamosas fue significativamente mayor que en el adenocarcinoma y el carcinoma de células grandes.
NK infiltración de células pulmonares y pacientes con cáncer de pronóstico
La el tiempo de supervivencia del paciente con cáncer de pulmón está positivamente relacionada con la infiltración de células NK grado en el cáncer de pulmón. Cuanto más la infiltración de las células NK se existía, más largo será el tiempo de supervivencia de los pacientes hizo (
p
= 0,030) (figura 3, Tabla 4).
El tiempo de supervivencia de pacientes con cáncer de pulmón se relaciona positivamente con el grado de infiltración de células NK en el cáncer de pulmón. Cuanto más la infiltración de las células NK se existía, más largo será el tiempo de supervivencia de los pacientes lo hizo. Los pacientes en el nivel 3 del grupo tienen el tiempo de supervivencia más larga. Entre tres grupos de significación estadística son la salida. (
p = 0,030
)
-PCR en tiempo real NK confirmar el grado de infiltración celular en el cáncer de pulmón
Las diferencias de receptores de células NK CD56 y CD16 la expresión de ARNm entre diferentes tipos patológicos de cáncer de pulmón fue detectado y verificado por PCR en tiempo real. Encontramos que las células NK fenotipo de ARNm en diferentes tipos histológicos de cáncer de pulmón tener significación estadística (Fig.4). Esto está de acuerdo con los resultados de la histología.
Las células NK CD56 y CD16 receptores fenotipo ARNm en diferentes tipos histológicos de cáncer de pulmón tienen significación estadística.
metástasis de pulmón trasplantado tumores modelos establecidos
modelos de metástasis de tumores-pulmón trasplantado se establecieron con éxito en ratones SCID con grandes líneas celulares de cáncer de pulmón de células metastásicas humanas alta (L9981) /baja (NL9980). La metástasis a distancia del tumor de xenoinjerto se detectó mediante fluorescencia de formación de imágenes in vitro (figura 5A). En comparación con el grupo de bajo metastásico (6,84 × 10
6 ± 3,26 × 10
6), la metástasis pulmonar valor de fluorescencia de los ratones del grupo de alto metastásico (30,97 × 10
6 ± 14,3 × 10
6) era notablemente mayor que en el grupo de bajo metastásico (
p = 0,035
) (Figura 5B, C, D)
a:. Living detectar imágenes de fluorescencia modelo de ratón ( la izquierda es la derecha inguen tumor por vía subcutánea durante 1 semana y el medio es de 6 semanas después de la inyección, el derecho es que los tumores metástasis pulmonares en seis semanas después de la inoculación), B:. curva de crecimiento del tumor trasplante por vía subcutánea en ratones SCID, C: metástasis pulmonares de imágenes de luminiscencia del ratón portador de un tumor in vitro, D:. La comparación del valor de luminiscencia entre las metástasis tumorales y de los pulmones trasplantados de alta (L9981) /baja (NL9980) grandes líneas celulares de cáncer de pulmón de células metastásicas humanas
NK modulación fenotípica de células en el cáncer de pulmón micro-entorno
NK1.1
+ CD3
- las células NK en los pulmones de grupo de alta metastásico (3,40 ± 0,90) fueron significativamente más alta que la en el bazo (0,10 ± 0,06) (
p
= 0,003). NK1.1
+ CD3
- las células NK en el bazo del grupo de alto metástasis (0,10 ± 0,06) fueron significativamente más bajos que en el grupo de bajo metástasis (1,66 ± 0,82) y el grupo control (3,80 ± 2,05) (
p = 0,017
,
p = 0,025
) (figura 6)
NK1.1
+ CD3
-. células NK en los pulmones de alta grupo -metastatic eran significativamente más alta que en el bazo (
p
= 0,003). NK1.1
+ CD3
- las células NK en el bazo del grupo de alto metástasis (0,10 ± 0,06) fueron significativamente más bajos que en el grupo de bajo metástasis (
p = 0,017
) y el control grupo (
p = 0,025
).
nivel de expresión de NKG2D de células NK de bazo en el grupo de alto metástasis (4,17 ± 0,85) fueron notablemente más baja que en el grupo control (7,80 ± 2,67) (
p = 0,034
) y el grupo bajo la metástasis (6,00 ± 0,96) (
p = 0,040
) (figura 7B)
A:. NKG2A nivel de expresión de las células NK de pulmón en el grupo de alta metastásico L9981 fueron significativamente más alta que en bajo metastásico grupo y el grupo control NL9980 (
p
= 0,000). Ly49I nivel de expresión desde el pulmón en el grupo de L9981 y el grupo NL9980 fue significativamente mayor que en el grupo control (
p
= 0,000) B: nivel de expresión NKG2D de células NK de bazo en el grupo L9981 (4,17 ± 0,85) eran notablemente menor que en el grupo control (
p = 0,034
) y el grupo NL9980 (
p = 0,040
). nivel de expresión Ly49I en grupo NL9980 fue notablemente mayor que en el grupo L9981 (
p
= 0,010) y el grupo control (
p
= 0,004). C: nivel de expresión NKG2A de las células NK de pulmón fue significativamente mayor que la de bazo en el grupo de alta metastásico L9981 (
p
= 0,007) y el nivel de expresión Ly49I de pulmón fue notablemente hasta reguladas de aquel en el bazo (
p = 0,003
) D: No hubo diferencias significativas de todo el nivel de expresión de los receptores de las células NK fue existía en el grupo bajo la metástasis NL9980. E: El nivel de expresión Ly49I de las células NK de los pulmones era significativamente mayor que la del bazo en el grupo de control (
p
= 0,033)
nivel de expresión NKG2A de las células NK. de pulmón (5,13 ± 2,36) fue significativamente mayor que la de bazo (1,47 ± 0,68) en el grupo de alta metastásico (
p
= 0,007) (figura 7C). NKG2A nivel de expresión de las células NK de pulmón en el grupo de alta metastásico (5,13 ± 2,36) fueron significativamente mayores que en el grupo de bajo metastásico (4,70 ± 1,96) y el grupo control (0,73 ± 0,26) (
p =
0,000) (figura 7A).
Ly49I nivel de expresión de las células NK de pulmón en el grupo de alto metastásico (4,82 ± 1,78) fue notablemente hasta reguladas que en el bazo (1,50 ± 0,10) (
p
= 0,003) (figura 7C). El nivel de expresión Ly49I de las células NK de los pulmones (2,79 ± 0,40) fue significativamente mayor que la del bazo (1,13 ± 0,40) en el grupo control (
p
= 0,033) (Fig.7E). Ly49I nivel de expresión de las células NK de los pulmones en el grupo de alta metastásico (4,82 ± 1,78) y el grupo de bajo metastásico (6,11 ± 2,23) fue significativamente mayor que en el grupo control (2,79 ± 0,40) (
p
= 0,000) (figura 7A). Ly49I nivel de expresión de las células NK de bazo en bajo metastásico grupo (3,40 ± 1,00) fue notablemente mayor que en el grupo de alta metastásico (1,50 ± 0,10) (
p
= 0,010) y el grupo control (1,13 ± 0,40) (
p
= 0,004) (figura 7B).
células NK efecto letal en el cáncer de pulmón microambiente
NK1.1
+ CD3
- las células NK activadas por IL-2 in vitro tienen actividad citotóxica significativa a las células de alta /baja de cáncer de pulmón metastásico de gran tamaño. Se observó una diferencia significativa entre las diferentes relaciones de efector-diana (
p = 0,005
,
p = 0,017
). Las células NK tenían mayor actividad citotóxica para NL9980 que eso para L9981 en la misma proporción efector-diana (
p = 0,035
) (Tabla 5).
ARNm del receptor de células NK que expresan en subcutánea del tumor trasplantado de ratón
en los tumores trasplantados de grupo portador de un tumor, el nivel de expresión de NKG2D de células NK en el grupo de alto metástasis fue significativamente mayor que en el grupo de bajo metástasis (
p
= 0,018), y el nivel de expresión Ly49I de las células NK en el grupo de alto metástasis también era notablemente mayor que en el grupo de bajo metástasis (
p
= 0,001). Sin embargo, se existía ninguna diferencia significativa del nivel de expresión NK1.1 y NKG2A de las células NK entre el grupo de alta y baja metástasis (
p
& gt; 0,05) (figura 8)
NKG2D. nivel de expresión de las células NK en el grupo de alta L9981 metástasis fue significativamente mayor que en el grupo de bajo NL9980 metástasis (
p
= 0,018), y el nivel de expresión Ly49I de las células NK en el grupo L9981 también fue notablemente mayor que NL9980 grupo (
p
= 0,001). No hay diferencia significativa del nivel de expresión NK1.1 y NKG2A de las células NK fue existía entre el grupo de alta y baja metástasis.
Discusión
Este estudio reveló que las células NK y la infiltración de células NK receptor de expresión cambio en el ambiente de tumor de NSCLC. A partir de nuestra investigación, encontramos que las células NK se infiltraron principalmente en el estroma tumoral, que constituye el microambiente tumoral. Estas observaciones están de acuerdo con las observaciones previas que demuestran que el tumor de pulmón microambiente [16]. Además, nos dieron la sorpresa de que el número de células NK infiltrarse en el tejido de cáncer de pulmón está estrechamente relacionado con los tipos patológicos, tamaño del tumor primario, historia de tabaquismo y el pronóstico de los pacientes con cáncer de pulmón.
Anterior literatura implicó que algunas moléculas que expresan en el tumor y algunos medios liberados de tumor comúnmente llevaron a mecanismos de escape tumoral de las células NK vigilancia inmunológica [19], [20]. Hay altos niveles de HLA molecular no clásico MHC I - E y HLA - G en la superficie de células tumorales. Eran NK CD94 de activación de células /NKG2A receptor de la superficie celular y la inmunoglobulina transcripción muestra molecular 2 (ILT2) ligando inhibidor, que puede contener NK función de daño celular [21] - [23]. Al mismo tiempo, las células tumorales pueden secretar algunos factores supresores de la inhibición de tumores de la función de las células NK, tales como IL-10 [24] y TGF-β [25]. Que rodea el tumor infiltrante de células NK, algunos cambios especiales en algunos otros tumores humanos habían sido investigados. En el cáncer de riñón, la célula NK dentro tumor solamente fue activada por IL-2 estimulación podría tener la función de solución de células objetivo. Y para los mismos pacientes hubo diferencias significativas entre el fenotipo de las células NK en sangre periférica con tumor [26] - [28]. El receptor de superficie celular NK DNAM-1, 2B4, la expresión CD16 reduce en cáncer de ovario, lo que puede dar lugar a la función de activación de las células NK fueron gravemente dañados [29].
Nuestro símbolo del resultado de la investigación que el receptor activado de NK las células se redujeron regulado y receptor inhibidor de las células NK está regulado en el tumor trasplantado y las lesiones metastásicas distantes de líneas celulares de cáncer de pulmón de células grandes humanos, lo que podría ser la razón principal que conduce a la capacidad de matar células NK disminuido.
NKG2D es un receptor de moléculas relacionadas con la cadena de MHC-clase I a y B, que se expresan con frecuencia por los cánceres epiteliales. La ligación de NKG2D induce funciones efectoras anti-tumorales tanto en células NK y T. reconocimiento NKG2D juega un papel importante en la vigilancia inmune del tumor [30] y que NKG2D actúa principalmente para desencadenar la apoptosis mediada por perforina [31]. Nuestra investigación se verifica que el nivel de expresión de NKG2D de células NK de bazo en el grupo de alto metástasis fueron notablemente más baja que en el grupo control (
p = 0,034
) y el grupo de bajo metástasis (
p =
0,040). En los tumores trasplantados de grupo portador de un tumor, NKG2D mRNA nivel de expresión de las células NK en el grupo de alta metástasis fue significativamente mayor que en el grupo de baja metástasis (
p
= 0,018).
NKG2A es un receptor de NK inhibidora que se ha descrito la formación de heterodímeros ligados por disulfuro con CD94 invariante. El ligando NKG2A ha sido identificado como HLA-E, un MHC de clase I b molécula no clásica que se encuentra ampliamente distribuido entre diversos tejidos, exposiciones expresión superficial relativamente baja, y ha polimorfismo [32] limitado. El CD94 receptor inhibidor /NKG2A juega un papel importante en la lisis NK mediada por células de CD4 activado
+ células T [33]. NKG2A nivel de expresión de las células NK de pulmón fue significativamente mayor que la de bazo en el grupo de alta metastásico (
p
= 0,007). NKG2A nivel de expresión de las células NK de pulmón en el grupo de alta metastásico fueron significativamente mayores que en el grupo de bajo metastásico grupo y control (
p
= 0,000). Por lo tanto, la baja regulación de NKG2D y la sobre regulación de NKG2A pueden indicar mecanismo de tolerancia inmune y facilitar la metástasis en el ambiente del tumor.
Interacción de MHC de clase I con los receptores Ly49 prevenir la activación de las células NK y de ese modo la lisis de la célula diana. Por lo tanto, las células NK utilizan los receptores Ly49 diferenciar 'auto' de 'falta de auto-'. La pérdida de moléculas de MHC de clase I en las células diana alivia la célula NK de la inhibición mediada por Ly49, permitiendo así que las células NK para mediar la citotoxicidad [34]. El nivel de expresión Ly49I de las células NK de los pulmones era significativamente mayor que la del bazo en el grupo de control (
p
= 0,033). Ly49I nivel de expresión de las células NK de los pulmones en el grupo de alta metastásico grupo y de bajo metastásico fue significativamente mayor que en el grupo control (
p
= 0,000). En los tumores trasplantados de grupo portador de un tumor, el nivel de expresión de ARNm Ly49I de las células NK en el grupo de alto metástasis también era notablemente mayor que en el grupo de bajo metástasis (
p
= 0,001).
Además, una mayor resistencia a la actividad citotóxica de las células NK existen en la gran línea humana de alta metastásico de pulmón de células de células de cáncer L9981, que es mucho mayor que en la línea celular de cáncer de pulmón de células grandes bajo metastásico NL9980. Además, es posible que otros receptores de células NK cambiaron en el ambiente del tumor.