Extracto
Este estudio describe el mecanismo de sensibilización al estrés térmico por inhibidores de la histona deacetilasa (HDACIs) en células de cáncer de pulmón y de muestra que Ku70, en función de su estado de acetilación, media la protección de cáncer de pulmón de hipertermia (42,5 ° C, 1-6 horas). Ku70 regula la apoptosis mediante el secuestro pro-apoptótica Bax. Sin embargo, su papel en la tensión térmica no se entiende completamente. Los resultados demostraron que, cáncer de pulmón de células pre-tratamiento con HDACIs, nicotinamida (NM) o tricostatina A (TSA) o ambos mejorado significativamente la apoptosis dependiente de Bax-hipertermia inducida en células PC-10. Encontramos que la hipertermia induce SIRT-1, Sirtuinas, la regulación positiva pero no HDAC6 o SIRT-3, por lo tanto, la transfección con dominante negativo SIRT-1 (S /H) también eliminó la protección y resultó en más muerte celular por hipertermia, en las células H1299 a través la activación de Bax. La hipertermia solo ceba las células del cáncer de pulmón a la apoptosis sin muerte prominente. Después de hipertermia Bax se reguló, Bcl-2 se downregulated, la relación Bax /Bcl-2 fue invertida y Bax /Bcl-2 heterodímero se disoció. Aunque la hipertermia no afectó el nivel total de expresión de Ku70, Ku70 estimuló desacetilación, que a su vez podría unirse más Bax en las células PC-10. Estos hallazgos sugieren un mecanismo de escape de la activación de Bax hipertermia inducida. Para verificar el papel de Ku70 en este mecanismo de protección, Ku70 fue silenciada por siRNA. Ku70 silenciamiento sensibilizado significativamente las células de cáncer de pulmón a la hipertermia. Las células Ku70 KD se sometieron a la detención en G1 y la caspasa-dependiente de la apoptosis citotóxica cuando se compara con los transfectantes revueltos, que mostró sólo G2 /M detención citostático en las líneas celulares investigadas, lo que sugiere un ciclo celular dependiente de, novela adicional, el papel de Ku70 en la protección de la hipertermia. Tomados en conjunto, nuestros datos muestran un mecanismo de protección Ku70 dependiente de la hipertermia. Orientación de Ku70 y /o su acetilación durante la hipertermia puede representar un enfoque terapéutico prometedor para el cáncer de pulmón
Visto:. Hassan MK, Watari H, Salah-Eldin A-E, Sultan AS, Mohamed Z, Fujioka Y, et al. (2014) Las células de histona deacetilasa inhibidores de cáncer de pulmón Sensibilizar a la hipertermia: La participación de Ku70 /SIRT-1 en Thermo-Protección. PLoS ONE 9 (4): e94213. doi: 10.1371 /journal.pone.0094213
Editor: Sue Cotterill St. Georges, Universidad de Londres, Reino Unido
Recibido: 30 Agosto, 2013; Aceptado: 14 de marzo de 2014; Publicado: 11 Abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Hassan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por una subvención de la ayuda-en-HW para la Investigación Científica (C 22591844 y 20659255) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Un interés en la investigación de muchos años ha sido blanco de los mecanismos específicos responsables del desarrollo de la resistencia de las células cancerosas a diferentes terapias. Orientación de estos mecanismos puede mejorar la destrucción específica de las células cancerosas. La hipertermia es una modalidad utilizada en el ámbito clínico, para el tratamiento de muchos tipos de cáncer; Por lo general, se utiliza en combinación con radioterapia y /o quimioterapia [1], [2]. Sin embargo, un obstáculo importante para la eficacia de la hipertermia es el desarrollo de la resistencia celular, que bloquea la señalización de apoptosis y aumenta la supervivencia celular [3], [4]. Esta resistencia hace que la limitación de la apoptosis después de la hipertermia [5], [6]. Por lo tanto, la identificación de los mecanismos responsables para el desarrollo de termo-resistencia en células de cáncer, puede ayudar a mejorar la orientación específica para mejorar los resultados del tratamiento de la sensibilidad celular a la hipertermia. La resistencia a la apoptosis es una característica común de células de cáncer [3], [7]. La apoptosis es inducida por, vías extrínseca e intrínseca [8]. La unión de ligandos a un receptor de muerte activa la vía extrínseca; la vía intrínseca se activa por el estrés celular, tal como daño del ADN. La familia de proteínas Bcl-2 regula la vía intrínseca; que influye en la permeabilidad de la membrana mitocondrial externa [9]. Los miembros de la familia Bcl-2 se dividen en proteínas proapoptóticos tales como Bax, Bak y Bok, y las proteínas antiapoptóticas incluyendo Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, y MCL-1 [10] - [13].
Acumulación de Bcl-2 y Bcl-xL puede proteger las células de la apoptosis, promover la supervivencia celular y acelerar el crecimiento del tumor por el secuestro de pro-apoptótica Bax. Ku70 es otra molécula anti-apoptótica; que, naturalmente, se une Bax, secuestrándolo de la activación o la translocación mitocondrial en las células no estresadas [14], [15]. Ku70 es uno de los componentes del heterodímero Ku70 /Ku80 que está implicado en el daño del ADN de reparación [16]. La acetilación de dos lisinas críticos, en el extremo carboxilo terminal de Ku70, regula la unión /disociación a Bax y esto afecta a la sensibilidad posterior de la célula a los estímulos de apoptosis [14]. Sólo desacetilizado Ku70 se puede unir a Bax. Alta expresión de Ku70 en células de cáncer mejoraría la capacidad de reparación del ADN y reducir la apoptosis mediada por Bax; Por lo tanto, Ku70 podría desempeñar un papel en la resistencia al tratamiento. La actividad relacionada con la apoptosis de Ku70 es independiente de su papel en la reparación del ADN [17]. El ciclo de acetilación /desacetilación Ku70 está regulada por transferasas histona acetil y desacetilasas de histonas (HDAC). Ku70 es un objetivo de algunos miembros de la clase I /II y clase III HDAC HDAC [18], [19]. La familia de las proteínas HDAC se divide en dos categorías: las enzimas dependientes de zinc (HDAC1-11), subdivididos en clase I y clase II que se inhibe por tricostatina A (TSA) y NAD
+ - enzimas dependientes (clase III; SIRT1-7) que es inhibida por nicotinimide (NAM). Más precisamente, SIRT-1, un miembro de la clase III HDACs, juega un papel crucial en Ku70 desacetilación, que mejora la protección de las células de Bax durante la restricción calórica [19]. La mayoría de las células del cáncer sobreexpresan Sirt1 [20]. Por lo tanto, la orientación de la protección Ku70 dependiente de la apoptosis, por los inhibidores de HDAC que inhiben SIRT-1, podría ser una estrategia eficaz para sensibilizar a las células cancerosas a diferentes terapias. En este estudio, nuestro modelo es que las células de cáncer de pulmón mueren de manera significativa por la hipertermia cuando pretratado con HDACIs en comparación con sólo hipertermia. SIRT-1 y su objetivo, Ku70, son fundamentales para el mecanismo por el cual las células de cáncer de pulmón pueden escapar a la muerte térmica inducida. Los cambios en la actividad de Bax, acetilación Ku70 y el ciclo celular se estudiaron durante la exposición a la hipertermia. Además, la eficiencia de la secuencia de dirección específica de Ku70, utilizando siRNA, también se estudiaron con respecto a la sensibilización de las células de cáncer de pulmón a la hipertermia. Ku70 parece desempeñar un papel crucial en la protección de las células de la hipertermia, probablemente mediante el secuestro hasta reguladas Bax.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
Dos humana, no pequeñas líneas de pulmón de células de carcinoma de células PC-10 [21], y H1299, fueron adquiridos (American Type Culture Collection, ATCC) y se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.) que contenía suero bovino fetal al 10% ( Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) (medio completo) en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 a 37 ° C. El medio de cultivo se reemplazó por medio completo fresco cada tres días.
Los anticuerpos y reactivos
Bax anticuerpo policlonal de conejo anti-humana (PAB) y anticuerpo monoclonal de ratón anti-Ku70 humano (MAB) eran adquirido de BD Bioscience (Erembodegem, Bélgica); otro mAb anti-humano de ratón Ku70 para la inmunoprecipitación, HDAC-6 anti-humano y conejo SIRT-3 anti-humana (pAb) fueron adquiridos de Abcam (Cambridge, Reino Unido); anti-humano Ku80 mAb de ratón a partir de Transducción de Señales (EE.UU.), anti SIRT-1 humano y anti pan-K (lisina acetilada) de Upstate (Upstate Biotechnology, Lake Placid, Nueva York, EE.UU.); mAb anti humano Bcl-2 de ratón se adquirió de DAKO (Glostrup, Dinamarca). Detección por inmunotransferencia se llevó a cabo con anticuerpos anti-ratón o anti-conejo secundaria conjugada con HRP (Dako) diluido a 1: 2000. La tinción de inmunofluorescencia se realizó con anti-conejo anticuerpos secundarios conjugados con FITC (Dako) diluido a 1:. 50. inhibidores de histona desacetilasa (HDACIs), nicotinamida (NAM) y tricostatina (TSA) fueron adquiridos de Wako Chemicals, Japón
HDACI
Cada HDACI utilizado se proyectó para su dosis subletales en un experimento piloto. La viabilidad celular se evaluó usando el ensayo de MTT, con o sin solamente DMSO, y la adición de diferentes dosis de cada uno de los HDACIs; 300 nM de TSA y 20 mM de NAM fueron elegidos como dosis no tóxicas y más utilizado en los experimentos posteriores.
Tratamiento térmico
Las células unidas a la parte inferior de las placas de cultivo, eran pre-cultivo durante 48 h, y fueron incubadas en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 en cualquiera de 37.0 ° C (control) o 42,5 ° C durante 1-9 h.
citometría de flujo, el análisis del ciclo celular y la anexina V tinción
Después de la exposición a la hipertermia, las células se volvieron a incubaron a 37 ° C durante 0 h, 24 h, o 48 h. A continuación, se analizaron las fases del ciclo celular. Brevemente, las células se fijaron con 70% de etanol a 4 ° C durante la noche. Después de lavar con Ca
2 + Mg
2 + exento de Dulbecco PBS, las células se trataron con 0,1 mg /ml de RNasa (Tipo IA, Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) y luego se tiñeron con 100 g /ml de yoduro de propidio (PI; Sigma), en la oscuridad, a temperatura ambiente durante 20 min. Después de pasar a través de una malla de nylon 40 nm, las muestras se mantuvieron en hielo hasta que las mediciones. Los datos obtenidos, utilizando el calibrador de FACS, se utilizaron para analizar las proporciones de fase del ciclo celular con el software ModFit. Una fracción de células de ADN, por debajo de la /G1 pico sub-G0, indicó células apoptóticas; Se utilizaron los histogramas de ADN para su estimación.
Para la tinción de Anexina V, las células se tiñeron directamente con PI y Anexina-V Flous (Roche) durante 10 min y después se lavaron con tampón de incubación. Se identificaron las células con un calibrador de FACS después de ajustar la tensión de la utilización de células no tratadas de control de colores. Las células se analizaron utilizando el software Cell Quest y se clasifican en cuatro etapas diferentes: las células vivas no teñidas, las células apoptóticas edad primeros teñidas únicamente con Anexina-V, las células apoptóticas de mediana edad doblemente manchadas, y finales de apoptosis edad y células necróticas teñidas con PI solamente
inmunoprecipitación
Las células (5 × 10
6 /placa) se lavaron con PBS frío, se lisaron en hielo en tampón de lisis RIPA (Tris 50 mM, pH 7, NaCl 150 mM, desoxicolato de sodio 0,5% y 0,1% NP-40) (NP-40; Nacalai Teque, Kyoto, Japón) o tampón CHAPS lisis (NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4, 1% CHAPS) [22] suplementado con una cóctel inhibidor de proteasa (Sigma) durante 1 h, y después se centrifugó a 15.000 rpm durante 10 min. El sobrenadante se mezcló con proteína A-Sepharose (para pAb) o proteína G-Sepharose (por mAb) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EE.UU.), pre-hinchado en PBS y se pre-recubiertas con el anticuerpo deseado contra Bax, Ku70, lisina acetilado o SIRT-1 por agitando suavemente durante 1 hora a 4 ° C y se centrifugó durante 1 min a 3000 rpm. Después de lavar con tampón de lisis, el inmunocomplejo se fraccionó por SDS-PAGE (10-12% de geles) y luego se sometió a análisis de Western blot.
Western blot
Después de la SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). La membrana se bloqueó a 4 ° C durante la noche con tampón de bloqueo. La membrana se incubó durante 1 h a temperatura ambiente con el Ab deseado. Después de lavar tres veces con TPBS, las membranas se incubaron durante 1 h con Ab secundario, a temperatura ambiente, seguido por tres lavados con TPBS. La membrana se desarrolló usando reactivos ECL (Amersham). La quimioluminiscencia se visualizó con una cámara polaroid (Amersham Pharmacia) y se cuantificó usando densitometría.
diseño siRNA y transfección
oligómeros siRNA contra Ku70 mRNA (Ku70-siRNA) y una secuencia de control que no lo hicieron coincidir con cualquier secuencia de genes (Cont-siRNA) se adquirieron como una validado (Ambion, EE.UU.; Ku70-siRNA-2 y cont-siRNA-2, respectivamente) o diseñado por los investigadores y luego sintetizada por Ambion de acuerdo con la siguiente secuencia : Ku-siRNA, 5_UUCUCUUGGUAACUUUCCCdTdT_3 (Ku70-siRNA-1) y 3_dTdTAAGAGAACCAUUGAAAGGG_5; Cont-siRNA, 5_GCG CGC GGA UUU GUA NVND GdTdT_3 y 3_dTdTCGCGCG AAA AAG CAU CCU C_5 (cont-siRNA-1). Esta secuencia de dirección fue validado [23]. oligómeros siRNA contra Bax mRNA (Bax-Si) se adquirió de Qiagene (Cat No. SI04948202). El Bax-si, el Ku70-siRNAs o CONT-siRNAs fueron transfectadas en las células de cáncer de pulmón (10
5 células /60 mm placa) usando SIPORT
Neofex gratis (Ambion, EE.UU.) a una final concentración de 200 nM, dos veces. Un día después de la última transfección, las células se tripsinizaron y se sembraron en placas de 60 mm (50.000 células por placa), por triplicado. Después de la unión celular, las células se expusieron a la hipertermia en los intervalos de tiempo indicados de acuerdo con el diseño experimental. Cada experimento se repitió al menos tres veces independientes para la reproducibilidad y el cálculo estadístico.
Evaluación estadística
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Minitab Release (Ver.12). Los datos se expresan como la media ± S.E.M. Se utilizó análisis de varianza de una sola vía (ANOVA) para evaluar la significación estadística entre las medias. Las diferencias entre las medias se consideraron significativos los valores de p inferior a 0,05.
Resultados
HDACIs muerte celular facilitado significativamente con la hipertermia
Como un hecho, SIRT-1, un ser humano deacetilasa, se dirige específicamente por pequeñas moléculas conocidas como HDACIs, por ejemplo NAM. Por otra parte, Ku70 desacetilación fue inhibida por inhibidores de moléculas que se dirigen a la clase I /II HDAC; por ejemplo TSA. En primer lugar, pre-tratamos las células PC-10 con diferentes HDACIs, NAM (20 mM), TSA (300 nM) o ambos, durante 4 h justo antes de la exposición a la hipertermia. Este tratamiento combinado aumentó significativamente la apoptosis, más de dos pliegues, en comparación con el tratamiento de la hipertermia por sí sola, como se observa por microscopía de contraste de fases (Figura. 1A) y Anexina V tinción (Figura. 1B). El patrón de expresión de Bax se analizó en los lisados de células enteras de PC-10 células tratadas y no tratadas. la expresión de Bax (21 kDa) se incrementó por hipertermia. Curiosamente, HDACIs (NAM y TSA) Aumento de la producción de 18 kDa Bax, que se sabe que es una forma truncada N-terminal de Bax. Dado que la activación de Bax es inducida ya sea por la exposición N-terminal por el cambio conformacional (cambio reversible) o truncamiento N-terminal (cambio irreversible), estos hallazgos sugieren que la apoptosis mejorada sostenible con la hipertermia y HDACIs es Bax-dependiente y esta apoptosis puede depender en la regulación positiva de Bax o la liberación de la proteína Bax desde (s) antiapoptótico para promover la apoptosis (Figura. 1C). Es importante destacar que el tratamiento de células de cáncer de pulmón con HDACIs, sólo a dosis seleccionadas, no tuvo ningún efecto tóxico apreciable. Se observaron efectos similares de HDACIs en las células H1299 (Figura. S1 y S2). Inesperadamente, la triple combinación de NAM, TSA y la hipertermia fue menos eficaz en H1299 de combinación doble. Aunque el mecanismo molecular exacto de este fenómeno sigue siendo oscuro, una razón posible es que el triple combinación puede mejorar la división de las células supervivientes escapado el reto de tratamiento triple, que puede producir la producción de nuevas células hijas dentro de los 48 horas post tratamiento ( antes de la detección de tinción con anexina V) y causar la reducción del porcentaje de tinción de anexina V finalmente. Para verificar que Bax desempeña el papel principal en la apoptosis inducida por la hipertermia después de la orientación Ku70 desacetilación, Bax fue blanco de siRNA en células PC-10 (ver materiales y métodos). Bax era susceptible de siRNA transfección (Bax-Si) en comparación con el control revueltos oligo siRNA (cont-Si) como se detectó por Western blot análisis (Figura 1D;. Panel superior). De nuevo, cuando golpeado Bax-down PC-10 células fueron tratadas con hipertermia para 6 h en presencia de HDACIs, la muerte celular hipertermia inducida se inhibió significativamente (Figura 1D;. Panel inferior). Mientras tanto, la muerte celular no estaba completamente bloqueada bajo tratamiento de hipertermia sola (Figura 1D;. Panel inferior y la Figura S3.). Este resultado puede indicar la participación de otras moléculas pro-apoptóticas en la muerte celular inducida por hipertermia limitada.
Un
. fotografías de contraste de fase de células PC-10, dos días después del tratamiento con hipertermia HDACIs el entonces durante 6 h. La imagen mostró número limitado de células recuperadas, así como las células apoptóticas redondeadas y flotando en las colonias pre-tratados con HDACIs a continuación, la hipertermia.
B Opiniones. Pre-tratamiento de las células PC-10 con HDACIs aumentó significativamente la apoptosis hipertermia inducida. citogramas comparativos muestran Anexina V tinción después de la hipertermia en las células PC-10 pre-tratados con nictotinamide (20 mM), tricostatina A (300 nM) o ambos (panel superior). Resumen de los resultados promedio de la anexina V se llegó a la conclusión (panel inferior).
C
. los niveles de expresión de Bax, por análisis Western, en células PC-10 después de hipertermia (6 h) pre-tratados con diferentes HDACIs. banda inferior (18 kDa) indica truncado, activo, Bax sólo aumentó cuando las células tratadas con la combinación de HDACIs e hipertermia.
D
. Un western blot muestra representativa de la modificación de Bax para el siRNA específico utilizado. las células PC-10 fueron transfectadas con cualquiera de Bax-si-si cont o dos veces. inmunoblot actina se utilizó como control de carga (panel superior). Reducción significativa de la tinción con anexina V después de la hipertermia y HDACIs en células Bax KD comparación con el control (s) que indica que Bax es el jugador proapoptótico clave en la apoptosis inducida por el tratamiento doble (panel inferior). Cada punto de datos representa la media de tres experimentos; bares denotan SD; ** Indica diferencias de transfectante de control en P & lt; 0,01
Efecto de la hipertermia en la expresión de las proteínas relacionadas con la apoptosis en células PC-10
Para investigar el efecto de la hipertermia en Bax y. sus principales moléculas de unión, algunas de las proteínas relacionadas con la apoptosis (Bax, Bcl-2, Ku70 y Ku80) se estudiaron mediante análisis de transferencia Western en una línea celular representativo, PC-10. Debido a que la mayor parte de los genes de limpieza son sensibles a la hipertermia, se utilizó tanto Ponceau S tinción para mostrar el control de carga. La hipertermia (42,5 ° C) durante 1-9 h indujo cambios cuantitativos en Bax y Bcl-2 expresión, sin cambios observables en la Bcl-XL, Ku70 y Ku80 (Figura. 2A) la expresión de Bax fue ligeramente hasta reguladas, mientras que Bcl-2 la expresión se había reducido regulado en el PC-10 células. La relación de Bax /Bcl-2 aumentó gradualmente después de tratamiento de hipertermia (Figura. 2B, panel superior). El análisis de Western blot de Bax y Bcl-2, con diferentes cantidades de carga de proteína (20 mg, 40 mg y 60 mg /carril), después de 0 h y 6 h de tratamiento de hipertermia confirmaron un aumento de la relación de Bax /Bc-L2 (Figura. 2B , panel inferior) que se han verificado denstimetrically (utilizando el software Scion Image). Observaciones similares se obtuvieron también en las células H1299 (Figura. S4). Por lo tanto, hemos tenido mucho interés para responder a la pregunta de por qué las células cancerosas, de tipo salvaje Bax, que fue upregulated, no mostraron apoptosis prominentes después de la hipertermia a menos que se añaden DHACIs. Notablemente, por inmunocitoquímica Bax y Bcl-2 mostraron localización principalmente citosólica en las líneas celulares estudiadas (Figura. S5). Por lo tanto, pasamos a estudiar la dimerización Bax.
Un
extractos celulares se prepararon a .Whole períodos indicados después de 42,5 ° C hipertermia y Bax, Ku70, Ku80 y Bcl-2 se analizaron por inmunotransferencia . Ligero aumento de Bax sólo después de 6 y 9 h hipertermia y la activación de Bax limitada después de 9 h son observables. La hipertermia redujo Bcl-2, mientras que Bcl-XL y Ku70 no habían sido claramente afectado. Anaysis se realizó de la misma transferencia de manera que cada proteína trabajó como control de carga para la otra. Un representante Ponceau S tinción de la membrana se muestra para verificar la normalización porque la mayoría de los genes de mantenimiento de la casa básicas (por ejemplo: de actina y de tubulina) están respondiendo a la hipertermia.
B Opiniones. Los análisis cuantitativos de expresión de la proteína Bcl-2 y Bax durante la hipertermia. Cada banda se cuantificó densitimetrically. Se muestra un conjunto representativo de la relación de Bax /Bcl-2. El análisis de Western con diferente cantidad de carga de PC-10 células lisados después de 6 h hipertermia verifica el cambio en la relación de Bax /Bcl-2, mientras que la expresión de Bcl-xL se utilizó como control de carga de mismo blot.
Alteración de Bax heterodimerización por hipertermia
En las células no estresadas, Bax heterodimeriza con muchos, anti-apoptóticos, moléculas asociadas; que homodimerizes bajo estrés para inducir la apoptosis. Para estudiar el efecto de la hipertermia en Bax dimerización, Bax se inmunoprecipitó a partir del lisado de células PC-10 después de 6 h de exposición a la hipertermia. Figure.3A, espectáculos disminuyeron la formación de heterodímeros Bax /Bcl-2; el heterodímero Bax /Bcl-xL no fue afectada por la hipertermia, de acuerdo con los resultados del análisis de transferencia de Western. De nota, fue que la cantidad de Ku70 unido a Bax se incrementó con el aumento de tiempo de exposición a la hipertermia. La inmunoprecipitación Ku70 confirmó mejorada Bax /Ku70 unión después de 6 h de exposición a la hipertermia, mientras que Ku70 /Ku80 unión no mostró ningún cambio (Figura. 3B). Se detectó observación similar cuando se utilizó tampón CHAPS para los experimentos de inmunoprecipitación (Figura. S6)
Un
. las células PC-10 se incubaron a 42,5 ° C durante 0, 1, 3 y 6 h. Bax fue co-inmunoprecipitó a partir de la proteína total de 2 mg y Bcl-xL, Bcl-2 y Ku70 se detectaron en el immunoprecipitant por el análisis occidental. La hipertermia induce Bax sobre regulación de Bax y la disociación de Bcl2 y mejora la asociación entre Bax y Ku70, mientras que ningún efecto sobre la asociación de Bax /Bcl-XL. Por el contrario, Ku70 fue co-inmunoprecipitó a partir de lisados de células similares. Bax y Ku80 se muestran en la immunoprecipitant.
B Opiniones. Después de la hipertermia, los niveles totales de Ku70 no mostraron cambios, pero se mejoró asociación entre Ku70 y Bax.
La hipertermia reduce Ku70 acetilación en las células PC-10
La acetilación del bien K539 o K542 en el enlazador Ku70 C-terminal es suficiente para bloquear completamente Ku70 supresión de la apoptosis mediada por Bax [14]. Por tanto, los efectos de la hipertermia en el estado de acetilación Ku70 fueron investigados por sondeo de la transferencia de Ku70 immunoprecipitant con lisina antiacetylated Ab (Figura 4A.); los resultados muestran una reducción significativa en Ku70 acetilación después de 6 h de exposición a la hipertermia en las células PC-10. Además, la cantidad de Ku70 detectado, en el immunoprecipitant proteína acetilado, disminuyó de una manera dependiente del tiempo (Figura. 4B).
Un
. Ku70 se inmunoprecipitó a partir de cantidades iguales de proteína (3 mg) de PC-10 lysat celular después de la hipertermia en el momento indicado. Ku70 y acetil lisina se detectaron en el immunoprecipitant. Ku70 total no mostró ningún cambio después de 6 h hipertermia (en venta) pero acetilado Ku70 se redujo.
B Opiniones. Todas las proteínas se inmunoprecipitaron acetilados, fraccionado, borrados y Ku70 se detectó en la transferencia. Bandas indicadas acetilados Ku70 se hizo más débil a medida que aumenta el tiempo de hipertermia.
C
. La hipertermia mejorado tanto la expresión de Ku70 y Ku70 /SIRT-1 vinculante. SIRT-1 se inmunoprecipitó a partir PC-10 después de hipertermia (0-6 h). Blot indica SIRT-1 sobre regulación (en venta; panel inferior) y una mayor unión a Ku70, en la misma mancha, fue hasta reguladas (paneles superiores).
D
. tratamiento de hipertermia similares en H1299. Ku70 total se precipitó. Ku70 y SIRT-1 se detectaron en el immunoprecipitant por análisis de Western. SIRT-1 /Ku70 vinculante se incrementó, lo que indica un aumento de desacetilación Ku70 en células de cáncer de pulmón por hipertermia.
SIRT-1 media citoprotección Ku70 dependiente de la hipertermia
Es bien sabido que Ku70 acetilación se invierte específicamente por SIRT-1, un desacetilasa humana, bajo estrés leve (tales como, la restricción calórica); En tales condiciones, Ku70 secuestra más Bax y protege las células de la apoptosis mediada por Bax [19]. Para investigar la inhibición de la acetilación de si, con la exposición a la hipertermia, se debió a la activación de SIRT-1, analizamos la expresión SIRT-1 después de la exposición a la hipertermia (0-6 h). Western blot reveló que SIRT-1 de expresión fue inducida por la hipertermia en el PC-10 células (Figura 4C).. Además, SIRT-1 se inmunoprecipitó a partir de PC-10 lisados de células enteras y después se sometió a análisis de transferencia de Western. La cantidad de Ku70 inmunoprecipitaron con SIRT-1 se ha mejorado por la exposición a la hipertermia (Figura. 4C). Del mismo modo, la cantidad de SIRT-1 inmunoprecipitaron con Ku70 también se ve reforzada por la exposición a la hipertermia (0-6 h) confirmando que Ku70 /SIRT-1 vinculante se mejoró por hipertermia en el PC-10 células (Figure.4D). Especulamos que hasta reguladas SIRT-1, en condiciones de hipertermia, se une a Ku70 y lo cambia de acetilado a la forma desacetilada, que permite Ku70 para secuestrar más Bax, ya sea liberado de Bcl2 o recién inducida bajo hipertermia, para inhibir la hipertermia inducida apoptosis finalmente. Estos resultados explican, al menos en parte, la razón por HDACIs, como NAM, pueden potenciar la apoptosis por hipertermia, probablemente por la orientación algunos HDAC como SIRT-1. Cabe destacar que otras histona desacetilasas incluyendo HDAC6 y SIRT-3, no mostraron cambios significativos en el perfil de expresión después de la exposición a la hipertermia (Figura. S7). Para confirmar los resultados anteriores, las células H1299 (con relativamente alta eficiencia de la transfección, & gt; 50% según se determinó por transfección Beta gal) se transfectaron transitoriamente o bien con el tipo salvaje SIRT-1 o dominante negativo H363Y /SIRT-1. apoptosis hipertermia inducida fue significativamente mayor en las células H363Y /transfectadas con SIRT-1 en comparación con el control de los transfectantes del vector (Figura 5A;. P & lt; 0,01). Es importante destacar que los de tipo salvaje células transfectadas con SIRT-1 mostraron una ligera pero significativa (P & lt; 0,05) la protección de la hipertermia en las células de la prueba, lo que indica que el efecto anti-apoptótica de la exógena SIRT-1 es significativo pero limitado. Esto fue probablemente debido a que el endógeno SIRT-1 había provocado la mayor parte de la protección espontánea de hyerthermia como se indica por los experimentos de contenido de ADN (Figura 5A).. Resultados similares se obtuvieron a partir de la tinción con anexina V; H363Y /SIRT-1 transfección en células H1299 mejora de forma significativa la apoptosis después de la exposición a la hipertermia en comparación con el vector vacío transfectante (Figura. 5B). En particular, ni de tipo salvaje SIRT-1 ni el dominante negativo H363Y /SIRT-1 transfección individualmente mostraron cambios apreciables en el ciclo celular.
Un
. SIRT-1 está implicada en la citoprotección de hipertermia. Western blot muestra la sobre-expresado SIRT-1. El análisis FACS de células H1299 después de la transfección transitoria o bien con el tipo de ancho SIRT-1, dominante negativo SIRT-1 o la expresión del indicador del vector. H363Y /SIRT-1 mejorado significativamente la muerte celular inducida por hipertermia mientras que el tipo de ancho SIRT-1 no tuvo efecto significativo (panel superior).
B Opiniones. Resultados de la anexina V tinción de las células H1299, desde experimento similar, lo que confirma que la muerte celular H363Y /inducida por SIRT-1 es la apoptosis (panel inferior).
Orientación de Ku70 de siRNA mejorado la muerte celular inducida por la hipertermia
Para examinar si Ku70 era un mediador clave en la protección mencionada anteriormente de las células de la hipertermia, Ku70 ARNm fue blanco de secuencia específica Ku70-siRNA-1, -2. Ku70 mRNA era susceptible de KU7-siRNA-1 (diseño del cliente) y, posteriormente, el nivel de expresión de la proteína se redujo significativamente (dosis; 200 nM) en PC-10 células (Figura 6A.). El control de siRNA (cont-siRNA-1) transfección no afectó la expresión de Ku70. Además, Ku70-siRNA-2 transfección (ver materiales y métodos) se confirmó de manera eficiente para derribar Ku70 (Figura. 6A, panel inferior). A continuación, tanto la caída Ku70 (KD) y células de control fueron desafiados con la exposición a la hipertermia. Las células PC-10 KD Ku70 mostraron una mayor muerte celular después de la exposición hipertermia de una manera dependiente del tiempo (Figura. 6B, C) en comparación con el transfectante cont-siRNA, dos días después del tratamiento, como se indica por el análisis FACS (usando Ku70- siRNA-1). Se obtuvieron resultados similares con el uso de células H1299 (utilizando Ku70-siRNA-2 y cont-siRNA-2 (Figura. S8)). Estos resultados sugieren que Ku70 media la citoprotección de la exposición hipertermia y probablemente juega un papel clave en la apoptosis inducida por hipertermia.
Un
. Un western blot muestra representativa de la modificación de Ku70 tanto para los siRNAs utilizados. PC 10 células y las células H1299 se transfectaron por uno siRNA dos veces. El resultado muestra significativa occidental derribar por Ku70-siRNA-1, -2 comparación con el cont-siRNA-1, -2, respectivamente. inmunoblot actina se utilizó como control de carga. El experimento se repitió tres veces independientes para la reproducibilidad. las células PC-10 fueron transfectadas con siRNA-Ku70-1 o cont-siRNA-1 (200 nM) dos veces. 24 h después de la última transfección, el número de células iguales se subcultivaron durante otras 24 h, y luego tratados con hipertermia para los intervalos de tiempo indicados, y luego re-cultivadas a 37 ° C durante 24 h (B) o 48 h fueron adquiridas (C) Células por el analizador FACS para el análisis del ciclo celular. Los resultados mostrados son una un representante de, al menos, tres experimentos independientes para cada punto de tiempo (24 horas y 48 horas).
D
. Ku70 se requiere para la detención citostático por hipertermia. Los histogramas muestran la acumulación diferencial de poblaciones de células en G2 /M fases en las células con o sin Ku70, uno y dos días después de tratamiento de hipertermia h 0, 1, 3 y 6. Las poblaciones en diferentes fases del ciclo celular, G1, S y G2 /M fases, se calcularon utilizando equipo después de tratamiento de hipertermia. Los resultados mostrados son la media de tres experimentos independientes.
E
. aumento significativo de la tinción con anexina V después de la hipertermia en las células Ku70 KD comparación con el control que indica que Ku70 basados en el silenciamiento de la muerte celular por apoptosis es la hipertermia. Cada punto de datos representa la media de tres experimentos; bares denotan SD; * Indica diferencias de transfectante de control en P & lt;. 0.001
Ku70 mediada por hipertermia inducida G2 /M acumulación
experimentos de pulso-etiquetado con bromodesoxiuridina (BrdU; 20 mM) en PC- 10 células indicaron que la exposición a la hipertermia inducida detención citostático pero no citotóxico (datos no presentados). La alteración del ciclo celular hipertermia inducida se analizó 24 h y 48 h después de 1-6 h exposiciones a la hipertermia. subpoblaciones G2 /M se incrementaron significativamente las 24 h después de la exposición a la hipertermia y poco a poco se redujo a subpoblaciones normales 48 h después de la exposición a la hipertermia (Figura. 6D). Al mismo tiempo, el porcentaje de G1 y fase S subpoblaciones disminuyó gradualmente 24 h después de la exposición a la hipertermia y se recuperó 48 h después de la hipertermia eliminación. Figura. Figura.