Extracto
Antecedentes
cáncer de ovario espontánea en los pollos se asemeja a tumores humanos, tanto histológica y bioquímicamente. El objetivo fue determinar si existen diferencias en el contenido de linfocitos entre los ovarios normales y los tumores ováricos en pollos como base para posteriores estudios para comprender el papel de la inmunidad en la progresión del cáncer de ovario humano.
Métodos
gallinas fueron seleccionados utilizando la escala y Doppler de color gris ultrasonido para determinar si tenían morfología normal o tumor. Las células fueron aisladas de los ovarios (n = 6 gallinas) y el número de linfocitos se determinaron mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos frente a CD4 y CD8 aviar T y células B (Bu1a). secciones de ovario de otro grupo de gallinas (n = 26) fueron evaluados para verificar el tipo y estadio del tumor y para el recuento de CD4, CD8 y Bu1a inmunoti~neron células mediante análisis morfométrico.
Resultados
T y B Las células fueron más numerosas en los tumores de ovario que en los ovarios normales por citometría de flujo e inmunohistoquímica. Había menos células CD4 + que + y CD8 + células Bu1a en los ovarios normales o tumores ováricos. células CD8 + eran la célula T sub-tipo dominante tanto en estroma ovárico y en los folículos ováricos en comparación con las células CD4 +. células Bu1a + se encuentran constantemente en el estroma de ovarios normales y los tumores de ovario, pero no estaban asociados con los folículos. El número de células inmunes fue mayor en los tumores serosos de última fase en comparación con endometrioide y tumores mucinosos.
Conclusiones
Los resultados sugieren que al igual que el cáncer de ovario humano hay células inmunes en comparativamente más ovario de pollo tumores que en ovarios normales, y el contenido de las células inmunes más alta se produce en tumores serosos. Por lo tanto, este estudio establece una base para el estudio adicional de las respuestas inmunes a tumores en un modelo espontáneo de cáncer de ovario que facilitará estudios sobre el papel de la inmunidad en la progresión del cáncer de ovario temprano y el uso de la gallina en los ensayos de vacunas pre-clínicos.
Visto: Bradaric MJ, Penumatsa K, Barua A, Edassery SL, Yu Y, Abramowicz JS, et al. (2013) Las células inmunitarias en el ovario normal y espontánea de ovario Los tumores en la gallina ponedora (
Gallus domesticus
) Modelo de cáncer de ovario humano. PLoS ONE 8 (9): e74147. doi: 10.1371 /journal.pone.0074147
Editor: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos de América
Recibido: Marzo 22, 2013; Aceptado: July 26, 2013; Publicado: 9 de septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Bradaric et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el NIH R01AI055060 (JL), OC073325 DOD (JL), la Fundación Segal (JL) y la Fundación Prevenir el cáncer (AB). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Antecedentes
múltiples elementos están involucrados en el desarrollo y progresión del cáncer incluyendo genética, epigenética, ambientales y factores inmunológicos [1], [2]. Aunque está claro que la inmunidad tiene un importante papel en el cáncer y que el control de las respuestas inmunes a los tumores tiene un potencial significativo para la prevención y el tratamiento del cáncer, la respuesta inmune a los tumores no se entiende bien. Un contenido de tumor más alta de células T CD3 + [3] o CD8 + células T citotóxicas [4] en tumores en fase tardía se asocia con un mejor pronóstico para pacientes con cáncer de ovario, mientras que un mayor contenido relativo de células T reguladoras se asocia con un peor pronóstico [5 ], lo que sugiere el número y tipos de células del sistema inmune son importantes para los resultados clínicos. La evidencia reciente sugiere que las células B CD20 + se encuentran tanto en los tumores de ovario temprano y tardío de la etapa y que los números más altos puede estar relacionado con mejores tasas de supervivencia a cinco años [6]. Sin embargo, hay datos contradictorios con respecto al papel de la inmunidad en la prevención o la progresión del tumor y se ha sugerido que el papel funcional de los cambios de inmunidad durante la progresión tumoral [7].
El cáncer de ovario generalmente se diagnostica en etapas avanzadas y tiene una alta tasa de recurrencia y mortalidad ya que no existen métodos estándar de detección temprana. Dado que el cáncer de ovario en estadio temprano es difícil de detectar, la mayoría de los estudios utilizan muestras de etapa tardía y por lo tanto hay relativamente poca información sobre la inmunidad en la iniciación y progresión temprana de cáncer de ovario. Las primeras etapas de cáncer de ovario se estudian más fácilmente en modelos animales y estos modelos representan un enfoque alternativo para elucidar la etiología del tumor y el papel de la inmunidad en el cáncer de ovario. Se necesita un mayor desarrollo de modelos preclínicos de cáncer de ovario para facilitar el desarrollo y el ensayo de vacunas para tratar el cáncer de ovario.
Hay una serie de modelos de roedores de cáncer de ovario en base a los tumores mediante ingeniería genética o inducida químicamente o en la implantación de los tumores humanos en SCID (inmunodeficiencia combinada severa) o RAG (gen activador de recombinación) ratones deficientes [8]. Sin embargo, la mayoría de los modelos de roedores no desarrollan cáncer de ovario de forma espontánea y los que lo hacen a menudo producen solamente un histotype [8], [9], [10], [11], [12]. Aunque estos modelos son útiles para una visión de factores genéticos y ambientales que contribuyen a los cánceres y para el desarrollo de estrategias de quimio-terapéutico, son menos apropiados para la investigación de eventos espontáneos tempranos relacionados con la inmunología tumoral, ya que no está claro si se someten a la misma natural o eventos espontáneos que conducen a los tumores ováricos.
La gallina ponedora (
Gallus domesticus
) llena este vacío, ya que se desarrolla de forma espontánea tumores de ovario, evolutivo con metástasis posteriores etapas y producción de ascitis [13]. Nosotros y otros informaron de que la gallina ponedora es un modelo válido para el estudio del cáncer de ovario humano [14], [15], [16], [17], [18]. tumores de ovario espontáneos en la gallina comparten muchas características de cáncer de ovario humano. La histología y la morfología de la gallina y los tumores de ovario humano son similares; tumores de gallina tienen comúnmente seroso, endometrioide, de células claras y la histología mucinosa comparable a los subtipos epiteliales frecuentes de cáncer de ovario humano [14]. Hemos demostrado anteriormente que los tumores de ovario en las gallinas ponedoras también se pueden detectar por ecografía transvaginal utilizando el tipo de equipo utilizado comúnmente en clínicas [19], [20]. Cuando se combina con agentes de contraste [21], hemos sido capaces de avanzar en la fase en la que se detectaron angiogénesis del tumor de ovario y pequeños focos tumorales microscópicos. Por lo tanto los métodos no invasivos para la selección de las gallinas para los estudios y para el seguimiento de la progresión del tumor están disponibles. Por otra parte, de origen natural mutaciones genéticas tales como p53, RAS y Her2 /neu se encuentran en los tumores de gallina [22], [23], [24]. Del mismo modo, hay una lista creciente de proteínas que se expresan en los tumores de ovario de pollo como CA125 [25], la mesotelina [26], la COX 1 [27], [28], Selenio Binding Protein 1 [29], E-cadherina [30] y VEGF que son alterados de manera similar en los tumores de ovario humano [17], [20], [31]. También llama la atención que la aspirina [32] y la progesterona exógena [33] reducir parcialmente los tumores de ovario similares a los humanos. El cáncer de ovario en la gallina tiene muchas de las facetas de la enfermedad humana y por lo tanto es un modelo válido.
El modelo gallina ponedora es particularmente apropiado para estudios de cáncer de ovario y la inmunidad. La gallina es bien conocido por sus contribuciones seminales a nuestra comprensión de la inmunología, incluyendo la primera evidencia de diferentes linajes de linfocitos T y B [34]. En el ovario, hay un aumento en las células T del folículo asociado, macrófagos y células B durante la maduración ovárica y luego una disminución con el envejecimiento [35], [36], [37], [38]. Además, el suero de las gallinas con tumores de ovario contiene anticuerpos anti-ováricos y anti-tumorales [39] similar a las mujeres [40], [41], [42]. Por lo tanto, el modelo de gallina ponedora representa un modelo viable para estudiar la inmunidad y el cáncer de ovario en estadio temprano.
Sin embargo, no se conocen los tipos y el contenido de las células inmunes en las gallinas con tumores ováricos y los cambios en comparación con ovarios normales. Por lo tanto, el objetivo de este estudio transversal fue describir y cuantificar las células T y B asociados con tumores ováricos en la gallina ponedora con el fin de establecer una base para el estudio de mecanismos de inmunidad en el cáncer de ovario humano.
Materiales y Métodos
Cuidado de Animales y de selección
gallinas leghorn blancas (3 años de edad, cepa W96) fueron alojados en la Universidad de Illinois en Urbana-granja avícola Champaign en el Departamento de Ciencia Animal . Se proporcionaron alimentos y agua
ad libitum Opiniones y gallinas se mantuvieron en un 17:7 horas (luz: oscuridad) horario. la morfología ovárica y la angiogénesis se evaluó mediante ecografía transvaginal como se describe anteriormente [19] y los datos se utilizaron para seleccionar las gallinas con ovarios normales o tumores ováricos. Para citometría de flujo, se prepararon células de todo el ovario sin más evaluación histológica. Para los estudios inmunohistoquímicos, se seleccionaron de manera similar gallinas. etapa de la histología tumoral y normal o tumoral se verifica y se determinó el tipo de tumor utilizando hematoxilina y eosina (H & amp; E) secciones teñidas de ovario como se describe anteriormente [14]. Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por los Comités de Cuidado y Uso de Animales institucional en el Rush University Medical Center (número 08-011) y la Universidad de Illinois (número 05147).
Citometría de Flujo
La citometría de flujo se utilizado para linfocitos de fenotipo en los ovarios de gallina (n = 6) y el bazo (n = 2). Se detectaron células T con las células B CD4-FITC y CD8-PE (Southern Biotech, Birmingham, AL) y se detectaron con anti-Bu1a (Abcam, Cambridge, MA) conjugado con aloficocianina (APC) (sistema de etiquetado Zenon, Invitrogen, Carlsbad CA) según las instrucciones del fabricante. Los linfocitos de ovario se detectaron utilizando un solo paso de citometría de flujo [43]. Los controles positivos consisten en los linfocitos de los bazos y los controles negativos incluyeron la sustitución de los anticuerpos del mismo isotipo de anticuerpos primarios (datos no mostrados). El número total de células inmunes se calcula entonces de la citometría de flujo de datos y los recuentos de células totales se obtuvieron a partir del extracto de tejido.
ovarios enteros se cortaron en piezas de 2-3 cm y las células fueron liberadas por digestión enzimática utilizando colagenasa (2.000 UI /1 g de tejido; Worthington, Lakewood, NJ), DNasa I (200 mg; STEMCELL Technologies, Vancouver, BC), y medios DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) (40 ° C, 2 horas con agitación). Los tubos se centrifugaron (100 xg, 5 minutos). El sedimento celular se suspendió en solución salina tamponada con fosfato fría (PBS) que contiene EDTA 1 mM (1 ml, 2 minutos), se centrifugó (100 x g; 5 minutos) y el sedimento se suspendió en solución salina equilibrada de 10 ml Hank (HBSS) que contiene 2 % de suero bovino fetal (FBS). Las células se contaron con un contador Coulter fijado para 5-11 micras. Las células (6 × 10
6) se marcaron y se fijaron en paraformaldehído al 2% y el 5 × 10
5 células /muestra se analizó utilizando un FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA). Los datos se analizaron con el software CellQuest 1 (BD Biosciences, San Jose, CA).
Preparación de tejidos para histología e inmunohistoquímica
Los ovarios fueron fijadas en formol al 10% tamponado con PBS y se incluyeron en parafina. H & amp; secciones E manchadas de ovario fueron analizados por un patólogo certificado por el consejo en el Rush University para el tipo de tumor y la etapa basada en similitudes con la morfología humana como se describe anteriormente [14]
fue también incrustado Una porción de cada ovario. en compuesto OCT (Tissue Tek, Sakura, Torrence, CA), se congelaron rápidamente en metanol enfriado con hielo seco y almacenados a -80 ° C. Veinticuatro horas antes de seccionar en un criostato Leicha, los tejidos fueron llevados a -20 ° C y se adhirieron a una etapa de metal con octubre compuesto de inclusión. Los tejidos se seccionaron (10 micras), se fijaron en acetona fría (4 ° C, 20 minutos), a temperatura ambiente (30 minutos) y se almacena a -80 ° C hasta su uso se secó al aire.
Inmunohistoquímica
se detectaron células inmunitarias con anticuerpos contra marcadores de células T CD4 gallina, las células T CD8 (Southern Biotech, Birmingham, AL) y células B (Bu1a /chB6) (Abcam, Cambridge, MA). Las secciones se inmunotiñeron utilizando un kit con diaminobencidina (DAB) como sustrato (Vector Labs, Burlingame, CA). Las secciones se lavaron (15 minutos), se contratiñeron con hematoxilina (Fisher Scientific, Rockford, IL), se deshidrataron, aplicadas a portaobjetos y se secaron (37 ° C, 16 horas). La microscopía se realizó en un microscopio Nikon Microphot FXA.
Análisis morfométrico de las células inmunes
secciones de ovario fueron teñidas con anticuerpos contra CD4, CD8, y Bu1a y se examinaron con un microscopio óptico (Olympus BX -41; Olympus America Inc., Center Valley, PA). immunopositive células se contaron usando MicroSuite Cinco software (Olympus America Inc.). En pocas palabras, un mínimo de tres secciones de cada ovario de veintiséis gallinas se contó por marcador de células inmunes (CD4, CD8 y Bu1a) para un total de 243 diapositivas (3 diapositivas × 27 × ovarios 3 marcadores).
células inmunes totales se contaron en cada sección. Para cada sección, 5 a 20 campos al azar se contaron con un aumento de 20x (o 84000 m
2) dependiendo del tamaño de la muestra. Los recuentos de células se promediaron para cada sección para normalizar los datos desde un número diferente de los campos se contaron en diferentes secciones de tamaño. Tres secciones se promediaron para cada gallina para cada marcador. Los valores para cada grupo (, temprano, y tumores finales de los normales) se promediaron y expresaron entonces como el número medio de células en 8,4 × 10
4 m
2 de tejido ovárico. denominaciones de grupo (cáncer normales, temprana y tardía etapa) se basan en la evaluación histológica de H & amp;. E manchadas secciones siguientes se han definido previamente clasificación para el cáncer de ovario de gallina [14]
Además, el número de células en los folículos de las mismas secciones se contó y se expresaron como el número de células inmunes por 2 × 10
5 m
2 de la zona de folículo. Se evitaron las células inmunes en los folículos (moribundos) atretic [44], ya que se sabe que contienen una afluencia de linfocitos presumiblemente en respuesta a la apoptosis [45], [46].
Análisis estadísticos
Las pruebas estadísticas se realizaron con SPSS (Chicago, IL). Se utilizó la prueba U de Mann Whitney para determinar si las diferencias de medias fueron significativas con p & lt; 0,5 consideró significativo
Resultados
Selección de la gallina y de ovario Morfología
Las gallinas fueron seleccionados en grupos. con y sin tumores de ovario mediante ecografía Doppler color y morfología general del ovario. Como se describió anteriormente, los ovarios normales contienen múltiples folículos en desarrollo (Figura 1A y 1D) y los vasos sanguíneos discretas (Figura 1A) en el estroma que rodea los folículos ováricos. En el cáncer de ovario en estadio temprano, el ovario contiene un menor número de folículos en desarrollo, y más vasos sanguíneos que en los ovarios normales (Figura 1B y 1E). En el cáncer de ovario en etapa tardía, una masa sólida con ascitis es evidente y no hay folículos en desarrollo (Figura 1C y 1F).
Un ovario normal (A y D) con la maduración de los folículos ováricos (F1, F2) y los vasos sanguíneos del estroma (flechas) con la normalidad que muestra la morfología bruto de maduración (F1, F2) los folículos ováricos. Un ejemplo de un ovario anormal (B y E) que contiene más vasos sanguíneos (flechas) que en el ovario normal, no hay grandes folículos maduros detectables y una masa pequeña sólido tejido (círculo) en el ovario. Un ejemplo de cáncer de etapa tardía de ovario (C), caracterizada por una masa sólida grande con aumento del flujo sanguíneo (flechas) y ascitis profusas (*). La morfología bruto (F) confirmó la presencia de masas sólidas múltiples y la metástasis del tumor a otros órganos. Abreviaturas: CT = amígdala cecal; F1-F2 = grandes folículos preovulatorios; GI = tracto gastrointestinal; VO = ovario; S = estroma ovárico; SM = masa de tejido sólido en el ovario; SP = bazo; UOD = oviducto superior; UT = útero.
La localización de linfocitos en la normal del ovario, etapa temprana y finales de la etapa de ovario Tumores
se observaron células T CD4 + dentro de las capas de la teca de folículos en los ovarios normales (Figura 2 ) pero no en los compartimentos de células de la granulosa de los folículos o los ovocitos. células T CD4 + se produjeron en todo el ovario normal, que ocurre de forma esporádica en el estroma y adyacente a los folículos, dentro de los folículos atréticos (no mostrados) y cerca de los vasos sanguíneos. En ovarios que contienen tumorales, las células T CD4 + se produjeron en el estroma de tanto la fase inicial (Figura 3) y de la etapa tardía tumores de ovario (Figura 4) y fueron menos frecuentes que o bien CD8 + o células Bu1a +. En contraste con las células T CD8 + y células Bu1a + B, las células T CD4 + estaban cerca, pero no dentro de, las lesiones tumorales tempranas (Figura 3). células T CD8 + fueron localizados de manera similar en los folículos normales y en el estroma cerca de folículos (Figura 2). Se encontraron células T CD8 + en tumores en etapa temprana y tardía (Figuras 3 y 4). Mientras que B (Bu1a +) y células T se distribuyeron de manera similar en el estroma ovárico, Bu1a + tinción se encuentra raramente en los folículos (Figura 2).
Bu1a +, CD4 + y CD8 + (flechas) detectado por inmunohistoquímica en los ovarios normales en el estroma ovárico (S), adyacente a los folículos (f), en la capa tecales de los folículos (doble flecha) y eran abundantes en la capa de células bajo el epitelio superficial del ovario (SE). Aumento original, 10x; barra de escala = 100 micras. Las áreas seleccionadas (cajas punteadas) se muestran en un recuadro a mayor aumento de Bu1a y CD8 tinción; barras de escala = 10 micras inserción.
células Bu1a +, CD4 + y CD8 + se muestran en regiones similares de secciones en serie que contienen focos tumorales. Más células T CD8 + y las células B están presentes en focos tumorales de células T CD4 +. (A) tumor en estadio temprano que muestra células CD4 + en un tumor con estructura pobremente diferenciado (PD), y CD8 + y células B en un área adyacente bien diferenciado (WD). (B) Una pequeña lesión (círculo de puntos) que contiene células T CD8 + y células Bu1a +, pero no las células CD4 +. (C) Un área con células neoplásicas que contienen CD8 + y las células Bu1a +, pero no las células CD4 +. Aumento original, 10x; barra de escala = 100 micras. Manchado linfocitos CD8 + en un área seleccionada (cuadro punteado) se muestra en un recuadro a mayor aumento; barra de escala = 10 micras.
regiones similares de tres tipos de tumores se muestran en secciones seriadas teñidas para Bu1a, CD4 y CD8.
Fila superior:
Un ejemplo de secciones de un tumor de ovario seroso que muestran pocas células CD4 + dentro del tumor en comparación con Bu1a + y CD8 +.
Oriente Fila:
Un ejemplo de un tumor de ovario mucinoso que muestra depósitos de Bu1a +, CD4 + y CD8 + entre las glándulas y en todo el tumor.
Fila inferior:
Un ejemplo de un tumor de ovario endometrioide mostrando Bu1a +, CD4 + y CD8 +. Aumento original, 10x; barra de escala = 100 micras. Manchado CD8 + y CD4 + linfocitos en áreas seleccionadas (cajas punteadas) se muestran en las inserciones a mayor aumento; barra de escala = 10 micras.
Evaluación cuantitativa del número de células inmunes en la normal del ovario, etapa temprana y finales de la etapa de ovario Tumores
En los experimentos iniciales, el número total de T y células B aisladas de todo el ovario se determinó por citometría de flujo. Un flujo representante citometría de gráfico de dispersión muestra la distribución de tamaño de células de un ovario normal sin un tumor (Figura 5A) con una puerta en la región de linfocitos (R1). Los correspondientes diagramas de puntos representativos de cada marcador fluorescente también se muestra (Figura 5B). Aunque parecía haber un menor número de células T CD4 + en tumores de ovario en comparación con ovarios normales (Figura 5C), también había una variación significativa en el contenido de células CD4 + entre las gallinas, que es probablemente debido a las variaciones en el contenido de folículo y el estadio tumoral como se ve en la celda recuentos obtenidos usando morfometría. Una limitación de citometría de flujo es que todo el ovario se utiliza para preparar los linfocitos y por lo tanto la ubicación de las células inmunes con respecto a los tumores o los folículos no puede evaluarse. Del mismo modo, no fue posible determinar el tipo de tumor, la morfología de ovario o el estadio del tumor mediante histología. Se determinó el número total de células T y B aún más por la evaluación morfométrica de las secciones inmunoteñidas de ovario normal y los tumores de ovario. Este enfoque también permitió determinar el estadio del tumor de ovario y para evaluar las posibles diferencias en la localización de linfocitos
(A):. Representante adelante vs gráfico de dispersión lateral para las células de todo un ovario que muestra la compuerta (R1) utilizado para los linfocitos. (B) Las células fueron cerrada primero utilizando la puerta en (A) y después se tiñeron con cualquiera Bu1a-APC, CD4-FITC o CD8-PE. El porcentaje de células marcadas dentro de la puerta se muestra en el cuadrante inferior derecho de cada mancha. (C) El número total de Bu1a-APC, CD4-FITC y CD8-PE etiquetados células de los ovarios normales y tumorales de gallina (n = 3 /grupo) se muestran con el medio indicado por la línea horizontal.
dentro de los folículos (Figura 6), las células T CD8 + se redujeron (p = 0,052), mientras que las células T CD4 + aumentaron (p = 0,009) de normal a tumores tempranos y normal a tumores en etapa tardía. Las células B no se asocian típicamente con folículos y no se contaron. El número de folículos disminuye o estaban ausentes en los ovarios con tumores en comparación con ovarios normales (Figura 1).
(A) B células (Bu1a +) se encuentran raramente en los folículos y por lo tanto no se contaron. El número de células T CD4 + aumentó ligeramente (p = 0,052) y el número de células T CD8 + se redujo (p = 0,009) en los tumores de ovario en fase tardía en comparación con ovarios normales. En cada etapa había más CD8 + en comparación con las células T CD4 + (ovario normal, p = 0,003; tumor en estadio temprano, p = 0,008; tumor etapa tardía, p = 0,007). Los folículos se definieron como se muestra en (B) y se contaron las células dentro del área designada y el promedio determinados por 2 × 10
5 m
2 Área de folículo. Tres secciones de cada ovario por cada gallina se contaron con un aumento de 20x; barra de escala = 50 micras. Las barras de error representan la media ± SEM.
El estromal (es decir, no foliculares) el contenido de las células inmunitarias aumentó en conjunto con el estadio del tumor (Figura 7) y se caracterizó por un mayor número de células T CD8 + que CD4 + las células T en cada etapa (CD8 vs. células CD4 para ovario normal, p = 0,003; principios de tumor etapa, p = 0,008 y tumorales etapa tardía, p = 0,007). Al igual que en la citometría de flujo, las células Bu1a + y células T CD8 + eran más numerosos que las células T CD4 + en ovario normal y principios y finales de etapa tumores de ovario (Figura 7A, B y C). El número de células CD4 + T fue significativamente menor en los tumores en fase inicial en comparación con el ovario normal (p = 0,03) y no hubo diferencias entre Bu1a + y CD8 +. células CD4 + aumentaron significativamente (p = 0,05) mientras que el incremento en los valores medios para Bu1a + y CD8 + células no alcanzó significación en los tumores en fase tardía en comparación a la normalidad. En general, las células inmunes totales aumentaron de normal a fase temprana a los tumores en fase tardía (Figura 7D).
Como se muestra en los paneles AC para normal (N), temprana (E) y la etapa tardía (L) cáncer de ovario, células Bu1a + y células T CD8 + fueron más numerosos que en general las células T CD4 +, especialmente en tumores en fase tardía. En el panel D, se añadieron el B y células T recuentos. Hubo un incremento general en (no-foliculares) células inmunes totales de ovario normal a tumores etapa tardía. Se contaron las células en varios campos en tres secciones de cada ovario para cada gallina de 20 aumentos. El número promedio de B (Bu1a +) las células y las células CD4 + y T CD8 + se estimó a partir de 11 gallinas con ovarios normales (número de campos que contaba era Bu1a = 524, CD4 = 425 y CD8 = 360), 8 gallinas con cáncer de ovario en estadio temprano ( número de campos que contaba era Bu1a = 228, CD4 y CD8 = 190 = 225) y 7 gallinas con cáncer de ovario en etapa tardía (número de campos que contaba era Bu1a = 180, CD4 y CD8 = 190 = 200). Desde las áreas evaluadas de tamaño variado, todos los recuentos se normalizaron a 8 × 10
4 m
2.
El número de células inmunes diferían según el tipo de tumor (Figura 8). Sólo se evaluaron los (III /IV), los tumores en fase avanzada ya que la determinación de la histología del tumor era más clara en estas etapas. Hubo más células B en los tumores serosos que en mucinoso (p = 2,6 × 10
-
14) o endometrioide (p = 7,6 × 10
-
9) tumores. tumores serosos tuvieron significativamente menos células T CD4 + en comparación con mucinoso (p = 3,8 × 10
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5) o endometrioide (p = 2,9 × 10
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9), los tumores. El número de células T CD8 + fue similar entre los tipos de tumores (p & gt; 0,2).
Dado que la clasificación histológica de los tumores es más claro en los tumores de ovario en fase tardía, el análisis morfométrico se limita a los tumores de etapa tardía. tumores de células claras se produjeron en números relativamente bajos y no se incluyeron en el análisis. Se contó el número de Bu1a +, CD4 + y CD8 + como se describe en los métodos para la serosa (66 campos en los ovarios 3 gallina); mucinosos (53 campos en 2 ovarios gallina) y endometrioide (37 campos contadas en 2 ovarios gallina), los tumores de histología. Hubo significativamente más B (Bu1a +) las células en tumores serosos que en mucinoso (p = 2,6 × 10
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14) o endometrioide (p = 7,6 × 10
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9) tumores. Por el contrario, los tumores serosos tuvieron significativamente menos células T CD4 + en comparación con mucinoso (p = 3,8 × 10
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5) o endometrioide (p = 2,9 × 10
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9). El número de CD + 8 células T no difirió significativamente por la histología del tumor (p & gt; 0,2).
Discusión
Este estudio es el primero en investigar las células inmunes asociadas con tumores de ovario en el modelo de la gallina ponedora de cáncer de ovario espontánea. El contenido total de células inmunes en los ovarios con tumores fue mayor en comparación a la de ovarios normales. El resultado fue similar utilizando dos métodos estándar; citometría de flujo y análisis morfométrico de las secciones de tejidos mediante inmunohistoquímica etiquetados. Por citometría de flujo, hubo relativamente grandes variaciones en el número de células para cada tipo de células, en particular para las gallinas con tumores. Estas variaciones se encuentran por citometría de flujo podría ser debido en parte a la inclusión variable de células de los vasos sanguíneos y el contenido de la variable de folículos activos como el ovario progresa de un ovario normal a los ovarios con un tumor en estadio avanzado. Por lo tanto, se puso más énfasis en la determinación de los números de células inmunes mediante morfometría inmunohistoquímica ya que la ubicación de los linfocitos en relación con el tumor o de folículos podrían ser evaluados y dado que los tumores se pueden clasificar por histología y estadio.
El hallazgo de las células inmunes en el ovario normal en este estudio es consistente con estudios previos en gallinas [38], otros modelos animales [47] y los seres humanos [45], [48]. En un estudio detallado de los ovarios de ratas normales, los linfocitos eran abundantes y también aumentó transitoriamente coincidente con la ovulación [47]. Cuando se esplenectomizados ratas, los linfocitos de ovario se redujeron, pero no eliminaron lo que sugiere que en el ovario normal, no son los linfocitos "residentes", o que no todos los linfocitos tráfico desde el bazo. En este estudio de la gallina, también parece ser linfocitos "residentes" en el ovario normal, que son adyacentes a la capa celular externa de los folículos, así como en el estroma y la superficie del ovario epitelio. Esto plantea una pregunta en cuanto a si las células inmunes que se encuentran en los tumores de ovario se originan a partir de bazo o ganglios linfáticos o si las células inmunes residentes en el ovario contribuyen a la conversión maligna
.
En el ovario normal de gallina, no se encontraron células B con relativamente de alta frecuencia en las regiones del estroma y medulares, similar a CD4 + y CD8 +. Sin embargo, las células B se observaron raramente dentro de los folículos, en contraste con CD4 + y CD8 +. La abundancia relativamente alta de las células T en los folículos sugiere que tienen un papel en la función ovárica normal. Mientras que el marcador Bu1a es específico para células B gallina, sino que también se expresa en los macrófagos aviar y en un grado mucho menor en otros tipos de células no B [49]. Por lo tanto, un estudio más se necesita con marcadores secundarios para diferenciar las células B y las células no-B en la gallina. Sin embargo, este estudio demostró que las células B representan una proporción significativa de los linfocitos en los tumores de ovario.
Sobre la base de numerosos informes de otros grupos de modelos animales y seres humanos, se espera que las células inmunes en los tumores de ovario [50], [ ,,,0],51], [52]. Se ha demostrado que la supervivencia del paciente se correlaciona con el número de linfocitos infiltrantes de tumores [5] en material quirúrgico que habitualmente se obtienen a partir de la enfermedad en etapa tardía. Es difícil determinar el papel de estas células en las primeras etapas ya que el cáncer de ovario rara vez se detecta a tiempo en los seres humanos. Del mismo modo cuando se induce el cáncer de ovario en los modelos animales no está claro si los eventos de iniciación son modelos de desarrollo de tumor espontáneo. No hay estudios de células inmunes en tumores de ovario de gallina y pocos estudios que comparan estas células en el ovario normal y tumores ováricos para evaluar los cambios que puedan surgir durante el desarrollo de tumores de ovario espontánea. En este estudio, se encontró que el número total de células inmunes en el ovario tiende a ser mayor en la presencia de tumores espontáneos, que es coherente con el concepto aceptado que las células inmunes tráfico a e invadir tumores [5], [53], [ ,,,0],54]. Además, el contenido de las células inmunes es la más alta en los tumores de etapa tardía, particularmente en tumores serosos etapa tardía. Desde esta tendencia es similar a la de los seres humanos [50], [52], [55], [56], [57], los resultados apoyan el uso del modelo de gallina para investigar las respuestas inmunes a los tumores de ovario y de pre-clínica los ensayos de vacunas.
en los seres humanos, el contenido de linfocitos determinado por inmunohistoquímica en tumores de ovario no es consistente en diferentes estudios, especialmente con respecto a las células B [58]. biopsias de tumores de ovario humanos en etapa tardía contenían principalmente las células CD8 + /CD45RO + T y los macrófagos CD68 +, mientras que las células NK y B se produjeron en los números más bajos [50]. En contraste, se encontró que las células B CD20 + en el 42% de los tumores ováricos en otro estudio [6]. En los estudios de supervivencia, un mayor número de células B CD19 + se asocia con un peor pronóstico [59] mientras que los números más altos de células B CD20 + se asociaron con la supervivencia libre de enfermedad aumento [6]. Las diferencias en estos estudios puede ser debido al uso de diferentes marcadores, pero también pueden reflejar diferencias en el contenido relativo de diferentes histo-tipos de tumores en estos estudios [6]. células B y células T CD8 + se observaron en los tumores de ovario de la gallina con frecuencia relativamente alta, mientras que se detectaron las células CD4 + a una frecuencia relativamente baja.
Las células inmunes se produjeron en los tres de los histo-tipos de tumores examinados ( seroso, mucinoso, endometrioide y), pero había más células inmunes en tumores serosos de última fase.