Extracto
Los mecanismos específicos de cómo las células de cáncer de pulmón que albergan el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) la activación de mutaciones pueden sobrevivir al tratamiento con inhibidores de quinasa del EGFR-tirosina (TKIs) hasta que finalmente adquieren el tratamiento de resistencia a mutaciones genéticas no están claros. La diversidad fenotípica de las células cancerosas causadas por alteraciones genéticas o epigenéticas (intratumorales heterogeneidad) confiere el fracaso del tratamiento y puede favorecer la evolución del tumor a través de la selección darwiniana. Recientemente, hemos encontrado DDX3X como la proteína que se expresa preferentemente en el melanoma murino con células madre del cáncer (CSC) -al igual que los fenotipos de análisis del proteoma. En este estudio, transfectadas PC9, células de cáncer de pulmón humano que alberga EGFR exon19 eliminación, con ADNc que codifica DDX3X y encontramos que DDX3X, una ARN helicasa dependiente de ATP, inducidos fenotipos CSC-como y la transición epitelial-mesenquimal (EMT) acompañados de pérdida de la sensibilidad a EGFR-TKI. expresión DDX3X se asoció con la regulación positiva de Sox2 y el aumento de las células cancerosas que exhiben fenotipos CSC-como, como la proliferación independiente de anclaje, la fuerte expresión de CD44, y aldehído deshidrogenasa (ALDH). La EMT con el pasar de E-cadherina a N-cadherina también se vio facilitada por DDX3X. Cualquiera de fosforilación de EGFR independiente de ligando o ligando inducida fue inhibida en las células de cáncer de pulmón que expresa fuertemente DDX3X. La falta de la adicción a la señal de EGFR dio lugar a la resistencia a EGFR-TKI. Por otra parte, nos encontramos con una pequeña subpoblación no adherente que expresa fuertemente DDX3X acompañado de las mismas propiedades de células madre y la EMT en las células PC9 parentales. La subpoblación única carecía de la señalización de EGFR y era muy resistente a EGFR-TKI. En conclusión, nuestros datos indican que DDX3X puede jugar un papel crítico para la inducción de la diversidad fenotípica, y que el tratamiento dirigido DDX3X puede superar la resistencia primaria a EGFR-TKI resultante de la heterogeneidad intratumoral
Visto:. Nozaki K, Kagamu H, Shoji S, Igarashi N, Ohtsubo A, Okajima M, et al. (2014) DDX3X induce la resistencia primaria EGFR-TKI Basado en intratumoral La heterogeneidad en las células del cáncer de pulmón con mutaciones de EGFR-Activación. PLoS ONE 9 (10): e111019. doi: 10.1371 /journal.pone.0111019
Editor: Pier Giorgio Petronini, Universidad de Parma, Italia |
Recibido: 10 Marzo, 2014; Aceptado: September 26, 2014; Publicado: 24 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Nozaki et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica del Ministerio de Educación, Ciencia y Cultura de Japón (# 20590915, 23591141 #,#24591157,#26293196), y por los fondos de investigación de Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Compitiendo intereses:. Este estudio fue financiado en parte por Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y compartir materiales
señal de Introducción
Tratamientos de orientación la adicción causada por la mutación oncogénica controlador haber dado lugar a resultados sin precedentes en el ámbito clínico. El uso del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) tirosina quinasa inhibidores (ITC) ha mejorado significativamente la supervivencia libre de progresión en pacientes con cáncer de pulmón que albergan mutaciones activadoras del EGFR; Sin embargo, todavía es difícil conseguir una cura para el cáncer de pulmón, especialmente en pacientes con enfermedad en estadio avanzado [1], [2]. La diversidad fenotípica de las células del cáncer se basa en dos factores y resultados genéticos y no genéticos en la supervivencia de las células resistentes al tratamiento. De hecho, la resistencia más adquirido refleja la selección de las células cancerosas que alberguen alteraciones genéticas que confieren resistencia estocásticos. Sin embargo, los mecanismos por los cuales las células cancerosas sobrevivan hasta la adquisición de mutaciones adicionales no están claros. Sharma et al. demostró que una pequeña subpoblación de células reversiblemente tolerante a la droga existía en todas las células cancerosas examinadas y que las células tolerantes con las drogas se comportaron como las células madre, dando lugar a células resistentes a los medicamentos que albergan mutaciones adicionales [3].
DEAD /H (Asp-Glu-Ala-Asp /His) polipéptido cuadro 3, ligada al cromosoma X (DDX3X) es un miembro de la familia muertos-box de helicasas de ARN dependientes de ATP y se encuentra en el cromosoma X [4]. helicasas DEAD-box tienen múltiples funciones, incluyendo el empalme de ARN, ARNm de exportación, regulación transcripcional y traslacional, la decadencia de ARN, la biogénesis de ribosomas, y la regulación de los genes miARN [5], [6]. Por lo tanto, se cree que DDX3X estar involucrado en la regulación epigenética de la expresión génica. Nuestros análisis de proteoma anterior se identificaron DDX3X como una proteína purificada preferentemente expresado en CD133
+ células de melanoma B16, que poseía las células madre del cáncer (CSC) -al igual que las propiedades [7], [8]. Aunque DDX3X se informó originalmente para suprimir el crecimiento tumoral mediante la modulación de
p21
WAF /cip1
expresión de genes [9], DDX3X También se ha demostrado que se correlaciona directamente con la oncogénesis [10], [11]. Recientemente, la secuenciación del exoma identificó DDX3X como blanco de las mutaciones del gen controlador que median la patogenicidad de señalización β-catenina en el meduloblastoma, lo que apoya la teoría de CSC [12] - [16].
En este estudio, hemos tratado para investigar el papel de DDX3X en conferir resistencia EGFR-TKI en células de cáncer de pulmón. Nuestros datos sugieren que DDX3X puede representar una nueva diana terapéutica para superar intratumoral heterogeneidad en los pacientes con cáncer de pulmón tienen mutaciones de EGFR-activación.
Materiales y Métodos
Las células tumorales
células PC9 células de adenocarcinoma de pulmón que albergan un EGFR exón 19 mutación de deleción, se proporcionaron a partir de Riken de bio Center y se mantuvieron en medio de cultivo (CM) que contiene RPMI 1640 suplementado con 10% inactivado por calor lipopolisacárido (LPS) Calificado de suero de ternera fetal (FCS), 0,1 mM aminoácidos no esenciales, piruvato 1 mM de sodio, 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de sulfato de estreptomicina (todos de Life Technologies, Inc., Tokio, Japón). HCC4006 células de adenocarcinoma de pulmón que albergan un exón 19 de EGFR mutación por deleción fueron adquiridos de la American Type Culture Collection y se cultivaron en CM.
La transfección de células PC9 con
DDX3X
ADNc
La transfección de las células de cáncer de pulmón con
DDX3X
ADNc se realizó con un marco de lectura abierto marcado con Myc-FLAG (ORF) del clon de transcripción variante humana DDX3X 1 como ADN transfección listo (Origene Technologies, Inc., Rockville, MD , EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. células experimentales se incubaron con medio fresco que contiene G418 (600 mg /ml, Promega, Madison, WI, EE.UU.), y el medio se reemplazó con medio fresco que contenía G418-cada 3-4 días hasta que se identificaron las colonias resistentes.
Desmontables de DDX3X por shRNA
Desmontables de DDX3X se realizó utilizando un lentiviral shRNA (pLKO.1-puro) plásmido (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) que tiene la siguiente secuencia diana DDX3X: 5'-CCGGACGTTCTAAGAGCAGTCGATTCTCGAGAATCGACTGCTCTTAGAACGTTTTTTG. células PC9 se sembraron en medio fresco, y se añadió bromuro de hexadimetrina (8 mg /ml) a cada pocillo. Las células se cotransfectaron con el plásmido pLKO.1-puro, más el vector de empaquetamiento de acuerdo con el protocolo del fabricante. El medio se cambió aproximadamente 16 h después de la transfección, y se cultivaron las células durante un 48-72 h adicional. células experimentales se incubaron con medio que contenía puromicina fresco (2,0 mg /ml), y el medio se reemplazó con medio fresco que contenía puromicina cada 3-4 días hasta que se identificaron las colonias resistentes. Un mínimo de colonias cinco resistentes a la puromicina fueron recogidos, y cada clon se expandió para el ensayo. La eficiencia de DDX3X desmontables se determinó por inmunotransferencia.
Los anticuerpos monoclonales (mAbs) y citometría de flujo
conjugado con PE anti-CD44 (IM7), anti-E-cadherina (67A4), y anti-vimentina (GF2); isotiocianato de fluoresceína (FITC) y conjugado con anti-N-cadherina (8C11) se compraron de BD Pharmingen (San Diego, CA, EE.UU.). El análisis de los fenotipos de la superficie celular se llevó a cabo a través de la tinción de inmunofluorescencia directa de 0,5 a 1 × 10
6 células con los mAbs fluoróforo conjugado antes mencionados y después se trató con 1% de paraformaldehído. En cada muestra, se analizaron 1 × 10
4 células utilizando un citómetro de flujo microfluorometer (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, EE.UU.). anticuerpos de subclase de concordancia PE-conjugados utilizados como controles de isotipo también se compraron de BD Pharmingen. Las muestras se analizaron con el software CellQuest (BD).
Immunoblotting ensayo
Las células se recogieron y se lisaron en Nonidet P-40 tampón que contiene una mezcla de inhibidores de la proteasa (Sigma). Igual cantidad de proteína se sometieron a dodecilsulfato de sodio electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) sobre el Mini-Protean TGX Cualquier kD prefabricados de geles (BioRad, Hercules, CA, EE.UU.) y posteriormente transferidos a membranas de difluoruro de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA, ESTADOS UNIDOS). Las inmunotransferencias de lisados de células tumorales se sondearon con anticuerpos contra DDX3X (Sigma), EGFR, fosfo-EGFR (Tyr1068), fosfo-EGFR (Tyr1173), fosfo-EGFR (Tyr845), Akt, fosfo-Akt, Erk1 /2, fosfo Erk1 /2, y β-actina (Sigma). Todos los anticuerpos anti-excepto DDX3X y anti-β-actina fueron adquiridos de Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, EE.UU.). Los anticuerpos secundarios consistieron en IgG anti-ratón (BioRad) y IgG anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.). bandas de proteínas inmunorreactivas se visualizaron usando un kit ECL (Pierce). Al menos tres experimentos independientes se realizaron para todos los análisis.
Aldefluor ensayos
se detectó
actividad ALDH utilizando el kit ALDEFLUOR (StemCell Technologies Inc., Vancouver, Canadá) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, Aldefluor ensayos se llevaron a cabo mediante la suspensión de células en tampón de ensayo que contiene 1,5 M Aldefluor BODIPY-aminoacetaldehído, un sustrato de ALDH. Las células fueron incubadas durante 30 minutos a 37 ° C y se analizaron con un microfluorometer.
Ensayos de viabilidad celular
Un total de 5 × 10
4 células tumorales se sembraron en 24 pocillos se añadieron placas en el día 0. Veinticuatro horas después de la siembra, erlotinib o vehículo. El número de células vivas y muertas se contaron con tinción con azul de tripano. % De supervivencia indica un porcentaje de células vivas, lo que excluye la tinción con azul de tripano, basada en el número total de células en un pozo. Las muestras se prepararon por triplicado.
ensayos de MTT
Las células tumorales se sembraron a 5 x 10
3 células por pocillo en placas de cultivo de fondo plano de 96 pocillos y se cultivaron en CM. Después de un período de incubación de 24 h para permitir que ellos se adhieren a placas de cultivo, las células se trataron con erlotinib para 48 h. Las placas de cultivo se centrifugaron para las células tumorales no adherentes y se retiró el medio tanto como sea posible y se reemplazaron con 100 l de medio fresco. El (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) ensayo de 3- para la viabilidad celular se realizó mediante la adición de 10 l de reactivo MTT por pocillo durante 2 horas a 37 ° C, seguido de la adición de 100 l /pocillo de tinte reactivo de solubilización en detergente. El sobrenadante se aspiró y se midió la absorbancia a 570 nm. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.
LEF /TCF reportero ensayos
PC9 células fueron transfectadas transitoriamente con el vector lentiviral incluyendo TCF /LEF
Firefly
constructo informador de luciferasa e interna control de
Renilla luciferasa
constructo, o no inducible
Firefly
constructo indicador de luciferasa y el control interno
Renilla luciferasa
constructo (kit reportero Cignal TCF /LEF, Qiagen). Las células fueron transfectadas con Lipofectamine 2000 y seleccionados para 2 días en puromicin. células transfectadas fueron entonces reinicializar en placas de 24 pocillos a 30.000 células /pocillo antes del tratamiento con Wnt3a recombinante (100 ng /ml; R & amp; D Systems) durante 12 h. ensayo de indicador de luciferasa Dual se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante (luciferasa Dual-reportero sistema de ensayo, Promega), y los valores de la actividad del promotor se expresa como unidades relativas de luz. unidades relativas de luz se calcularon como
Firefly
-luciferase /
Renilla
-luciferase. Los experimentos se realizaron por triplicado.
El análisis estadístico
A menos que se indique lo contrario, los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EE.UU.) y no pareada de dos
t
Student pruebas -tailed. Para las comparaciones entre más de tres grupos, se utilizó el análisis de dos vías de la varianza (ANOVA) con post-test de Bonferroni. Las diferencias con
P
-valores de menos de 0,05 se consideraron significativos. Los resultados de los experimentos se presentan como media aritmética ± desviaciones estándar.
Resultados
DDX3X sobreexpresión induce madre fenotipos similares a células
Recientemente hemos informado de que la expresión DDX3X está regulada positivamente en el CD133
+ melanoma subpoblación, que posee las propiedades de CSC-como, tales como la formación de tumor esfera y de alta tumorigenicidad [8]. Para dilucidar si la expresión DDX3X se correlacionó con propiedades CSC-como, transfectadas las células PC9, las células de adenocarcinoma de pulmón que albergan un EGFR exón 19 mutación por deleción, con ADNc que codifica DDX3X y estableció una nueva línea de células, denominadas células A-1, que sobreexpresan DDX3X ( Fig. 1A). Como se muestra en la Fig. 1B, DDX3X sobreexpresión resultó en la regulación positiva de Sox2, un factor de transcripción Yamanaka que induce a las células madre pluripotentes. Además, la expresión de Snail, un factor de transcripción regulado DDX3X que promueve la migración celular y la metástasis en muchos tipos de cáncer [17], parecía ser upregulated en células A-1 (Fig. S1A). Además, se observó un aumento significativo en el número de células en proliferación de una manera independiente de anclaje (Fig. 1C y 1D).
A. El análisis de inmunotransferencia de DDX3X en las células parentales PC9, transfectantes simulacros, y A-1 células que fueron transfectadas con ADNc que codifica DDX3X. B. Análisis de inmunotransferencia de Sox2, Klf4 y c-Myc, en células parentales PC9, transfectantes falsos, y células A-1. C. Análisis de la proliferación celular independiente de anclaje por microscopía de contraste de fase. D. 1 × 10
5 PC9 células parentales o células A-1 se cultivaron en placas de 24 pocillos durante 3 días. Las células no adherentes se recogieron mediante balanceo suave en medio de cultivo. La proporción de células no adherentes se calculó basándose en el número total de células adherentes. Las células muertas fueron excluidos con el método de exclusión con azul de tripano. *
P Hotel & lt; 0,05. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes
DDX3X resistencia mediada por EGFR-TKI
Dado que las células madre utilizan detener la señalización específica de la célula.; Por lo tanto, los fenotipos CSC-como pueden estar asociadas con la activación de diferentes vías de señalización distintas de la señalización de EGFR resulta en una alteración de la sensibilidad a EGFR-TKI. Así, junto examinamos la sensibilidad EGFR-TKI de células A-1. Como se muestra en la Fig. 2A, se observó una resistencia significativa al tratamiento de 48 h con el erlotinib EGFR-TKI en células A-1. Desmontables de DDX3X restaura la sensibilidad a EGFR-TKI (Fig. 2B). Aunque se observó disminución de las células viables% en las células A-1 cuando las células se trataron con erlotinib a una concentración mayor que 20 nM, no estaba claro si las células estaban muriendo o no. Para probar si las células A-1 exhibían reducción de la viabilidad o simplemente reducen la proliferación después de 72 h-tratamiento erlotinib, las células muertas se tiñeron con yoduro de propidio (PI) y se analizaron con un microfluorometer. Mientras que el número de células muertas se incrementó en las células PC9 parentales, no se detectó aumento de células A-1 (Fig. 2C). Este fenómeno se confirmó contando el número de células durante tres días usando el método de exclusión de azul de tripano (Fig. 3A). El número de células muertas PC9 se incrementó significativamente en presencia de erlotinib en concentraciones mayores de 20 nM. En contraste, las células A-1 detuvieron la proliferación cuando se expone a erlotinib a concentraciones superiores a 20 nM, pero el número de células A-1 muertos no difieren de los de las células no tratadas, incluso después de tres días de la exposición a 2.000 erlotinib nM. Todos los otros clones que fueron diseñados para sobreexpresar DDX3X exhiben la misma resistencia a erlotinib como células A-1 (Fig. 3B).
A. ensayo de MTT de las células parentales y células PC9 A-1. Las células cancerosas se trataron con la concentración indicada de erlotinib para 48 h. Las muestras se prepararon por triplicado. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar. B. ensayo MTT de las células parentales PC9, A-1 células, y las células A-1, con la eliminación de DDX3X. Las células cancerosas se trataron con la concentración indicada de erlotinib para 48 h. Las muestras se prepararon por triplicado. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar. C. Flujo análisis de las células de cáncer tratados con erlotinib 20 nM durante 72 h citometría.
A. Un total de 5 × 10
4 células tumorales se sembraron en placas de 24 pocillos en el día 0. Veinticuatro horas después de la siembra, erlotinib o vehículo se añadieron a las concentraciones indicadas. El número de células vivas y muertas se contaron con tinción con azul de tripano. % De supervivencia indica un porcentaje de células vivas, lo que excluye la tinción con azul de tripano, basada en el número total de células en un pozo. Las muestras se prepararon por triplicado. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar. * Se utiliza para indicar la significación. B. La Supervivencia% de las células cancerosas tratadas con 20 nM erlotinib se demostró. A-1, 2, 3, 4, y 5 indican los números de clones que se transfectaron con ADNc que codifica DDX3X. La supervivencia% indica el porcentaje de células vivas que excluía la mancha azul de tripano, basada en el número total de células en un pozo. Las muestras se prepararon por triplicado. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar. **
p
. & Lt; 0,001
DDX3X reduce EGFR señalización en las células cancerosas que alberguen mutaciones de EGFR-activación
La supervivencia y la proliferación de las células PC9 son dependientes una adicción señalización porque las células PC9 poseen mutaciones del conductor en el EGFR
EGFR
genes que mejoran la actividad tirosina quinasa [18], [19]. Por lo tanto, analizamos si la señalización del EGFR se vio afectada por la sobreexpresión DDX3X. De acuerdo con informes anteriores, Tyr1068 de EGFR se fosforiló en las células parentales y PC9 transfectantes falsos, incluso en ausencia de EGF (Fig 4A.); sin embargo, casi no se detectó la fosforilación de EGFR en células A-1. Además, desmontables de DDX3X en células A-1 restauró la fosforilación de EGFR. Para confirmar que este fenómeno no se limita a PC9 línea celular, transfectadas HCC4006, un adenocarcinoma de pulmón humano que alberga una deleción del exón 19 de EGFR, con ADNc que codifica DDX3X (HCC4006 S1, S2 HCC4006). HCC4006 S1 y S2 también perdieron la fosforilación de EGFR (Fig. S1B). EGFR posee múltiples residuos de Tyr que se someten a la fosforilación. Por ejemplo, la proteína adaptadora GRB2 ata el EGFR activa en fosforilada Tyr1068 [20], y fosforilados Tyr1173 proporciona un sitio de acoplamiento para la proteína andamio Shc, que está implicado en la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) de activación [21] de señalización. Además, Tyr845 puede ser fosforilados por otras quinasas, incluyendo Src, y se ha demostrado ser fosforilados en muchos mutantes de EGFR gefitinib resistente [22] - [24]. Por lo tanto, el próximo examinado los estados de fosforilación de estos tres residuos de tirosina (Tyr845, Tyr1068, y Tyr1173) en presencia de EGF. Curiosamente, encontramos reducida fosforilación de residuos de tirosina todo examinó en EGFR en células A-1 (Fig. 4B).
A. Análisis de inmunotransferencia de EGFR, fosfo-EGFR (Tyr1068), y DDX3X en células de cáncer sin suplementación EGF. B. Análisis de inmunotransferencia de fosfo-EGFR en Tyr1068, Tyr1173, y Tyr845 en las células parentales y células PC9 A-1. C. El análisis cinético de la señalización de EGFR en las células parentales y células PC9 A-1. EGFR, fosfo-EGFR (Tyr1068), Akt, fosfo-Akt, ERK1 /2, y fosfo-ERK1 /2 niveles se analizaron por inmunotransferencia en 0, 15, 30, 60, 120, y 900 min después de la adición de 100 ng /ml de EGF.
en presencia de 100 ng /ml de EGF, la fosforilación de EGFR (Tyr1068) se incrementó en las células PC9 parentales (Fig. 4C). Por el contrario, la fosforilación de EGFR inducida por ligando y la quinasa regulada por señal extracelular fosforilación subsiguiente (ERK) fueron significativamente atenuada en las células A-1.
Además de ser regulada por la fosforilación, EGFR puede generar señalización a través de la fosforilación de otra proteínas de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER) mediante la formación de heterodímeros. Diafonía de Met con la vía de señalización del EGFR también se ha demostrado que participan en EGFR-TKI la resistencia [25]. Por lo tanto, si la prueba de HER2, HER3, HER4, y Met fueron fosforilados. Sin embargo, no se encontraron diferencias en los estados de fosforilación de HER2 o Met entre las células parentales y células PC9 A-1 (Fig. S1c, D). Además, HER3 y HER4 no se fosforilaron en estas células (datos no presentados).
una pequeña subpoblación de células PC9 expresa fuertemente DDX3X y exhibió CSC-como fenotipos
La acumulación de pruebas ha demostrado que casi todas las células tumorales muestran notable variabilidad en fenotipos sobre la base de la heterogeneidad genética y epigenética [26]. Si DDX3X de hecho juega un papel en la inducción de un estado de células madre similares y señal de conmutación, una población pequeña de células que sobreexpresan DDX3X-PC9 los padres puedan existir. Por lo tanto, ya que las células A-1 mostraron la tendencia a proliferar de manera independiente de anclaje, se analizó una pequeña subpoblación de células no adherentes PC9. Sorprendentemente, esta población no adherente de células PC9 parentales exhibió casi el mismo nivel de expresión DDX3X como células A-1 (Fig. 5A). Se examinó la expresión de ALDH, un putativo marcador CSC (Fig. 5B). Aunque sólo el 0,47% de las células adherentes PC9 expresó ALDH, el 23,0% de las células no adherentes exhibió actividad de ALDH. Por otro lado, el 15,8% de las células adherentes A-1 y 23,8% de las células no adherentes A-1 eran ALDEFLUOR positivo. Es probable que existan células ALDEFLUOR-positivas sólo en la población de células que expresan fuertemente DDX3X. Por otra parte, la mayoría de las células no adherentes, pero no las células adherentes exhibió fuerte expresión de CD44, otro marcador putativo CSC (Fig. 5C).
A. Análisis de inmunotransferencia de la expresión en las células DDX3X PC9 parentales adherentes y no adherentes y las células A-1. B. ALDEFLUOR ensayos se llevaron a cabo mediante la suspensión de células en tampón de ensayo que contiene 1,5 M Aldefluor BODIPY-aminoacetaldehído, un sustrato de ALDH. Las células se incubaron a continuación durante 45 min a 37 ° C y se analizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. C. citometría de flujo análisis de las células parentales PC9 adherentes y no adherentes y las células A-1. Histgrams indican la expresión de CD44. Las líneas de puntos indican control de isotipo, líneas delgadas indican las células adherentes, y las líneas gruesas indican las células no adherentes. D. Citometría de flujo análisis de las células no fraccionadas, adherentes y no adherentes derivadas de células PC9 parentales y células A-1. El eje X indica la intensidad de fluorescencia de E-cadherina, y el eje Y indica la intensidad de fluorescencia de N-cadherina. E. Citometría de flujo análisis de las células no adherentes aisladas de PC9 parental y las células A-1. histogramas muestran la expresión de vimentina en células cerradas N-cadherina +.
Se demostró que durante la EMT, E-cadherina es downregulated mientras cadherina neural (N-cadherina) está regulada positivamente, conocido como interruptor de cadherina y que el interruptor de cadherina promueve la invasión del cáncer y la metástasis a través de aumento de la motilidad de células de cáncer [27] - [30]. Por lo tanto, se examinó si el interruptor cadherina E /N fue inducida por DDX3X. Como se muestra en la Fig. 5D, 15,5% de las células no fraccionadas A-1 y 7,0% de las células parentales no fraccionadas PC9 expresó N-cadherina, por lo tanto, es probable que la expresión de N-cadherina fue promovida por DDX3X. Las células adherentes fueron E-cadherina único positivo y N-cadherina
+ células pertenecían a la población de células no adherentes. Curiosamente, el 43,1% de las células parentales no adherentes PC9 expresadas tanto cadherina E y N-cadherina y el 29,2% era de cadherina E
N-cadherina
+. Parece que el interruptor de cadherina incompleta se produjo en células PC9 parentales. Por el contrario, el 42,3% de las células no adherentes A-1 eran N-cadherina única positiva y el 10,8% era de cadherina E
+ N-cadherina
+. El 21,7% de N-cadherina cerrada
+ en las células PC9 los padres, y el 47,7% de N-cadherina cerrada
+ en las células A-1 expresado vimentina (Fig. 5E). Tomados en conjunto, una subpoblación única que estaba sufriendo EMT existía en las células no adherentes tanto de A-1 y de los padres PC9 y que DDX3X facilitó E interruptor cadherina /N seguido por la expresión de vimentina.
población de células no adherentes de PC9 parental carecía de EGFR señalización y exhibió resistencia a EGFR-TKI
Como se muestra en la Fig. 6A, todas las células no adherentes carecía de la fosforilación de EGFR como células A-1. Además, la población no adherente de células PC9 parentales era resistente a la erlotinib EGFR-TKI, similar a las células adherentes A-1 (Fig. 6B). Dado que las células no adherentes pueden incluir células muertas, se examinaron los porcentajes de células que mueren con la tinción PI. Higo. 6C muestra que el 28,5% de las células parentales PC9 adherentes estaban muriendo después de 72 h de tratamiento con erlotinib. En contraste, el porcentaje de células que mueren fue sólo 14,1% en las células no adherentes PC9. A continuación, se cultivaron las células parentales PC9 en presencia de concentraciones crecientes de erlotinib (hasta 3000 nM) para obtener células resistentes. Después de la exposición de 3 meses a erlotinib, establecimos células R-PC9, que eran capaces de sobrevivir en CM que contiene 3000 nM erlotinib. Higo. 7A demuestra que las células R-PC9 fueron significativamente resistente a erlotinib. células R-PC9 mostraron una fuerte expresión de DDX3X (Fig. 7B). En conjunto, nuestros datos demuestran que las células parentales PC9 contenían una población menor que exhibe una fuerte expresión de DDX3X, fenotipos CSC-como, la EMT, y la resistencia primaria a la EGFR-TKI. La población menor puede sobrevivir largo tratamiento con EGFR-TKI.
A. El análisis de inmunotransferencia de EGFR y fosfo-EGFR (Tyr1068) en las células cancerosas adherentes y no adherentes. ensayos de MTT B. Se utilizaron para medir la proliferación celular en las células adherentes y no adherentes PC9 y A-1 células después del tratamiento con erlotinib. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar. Las muestras se prepararon por triplicado. **
P Hotel & lt; 0,001. C. citometría de flujo con tinción PI se utilizó para examinar las células que mueren.
A. Se utilizaron ensayos de MTT para determinar la proliferación de células adherentes y no adherentes PC9, así como las células R-PC9, que se obtuvieron por la exposición a largo plazo a concentraciones crecientes de erlotinib. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar. Las muestras se prepararon por triplicado. * Indica diferencias significativas por ANOVA de dos vías y análisis ad hoc. B. Análisis de inmunotransferencia de la expresión en células PC9 DDX3X parentales y células R-PC9.
β-catenina señalización inducida por DDX3X
Aunque las células A-1 carecían de la fosforilación de EGFR y la posterior señalización , mostraron casi la misma tasa de proliferación como células parentales PC9
in vitro
. Es probable que la señalización de EGFR se sustituye por otras vías de señalización. Las células madre utilizan vías de señalización específicas, tales como Wnt /β-catenina o hedgehog, en lugar de tipo receptor de señalización de la tirosina quinasa; por otra parte, un cierto subconjunto de mantenimiento CSC es dependiente de Wnt /β-catenina de señalización [31], [32]. DDX3X se requiere para la señalización /β-catenina Wnt, y mutado DDX3X se ha demostrado que desempeñan un papel en la señalización de β-catenina patógena en meduloblastoma [13], [33]. Por lo tanto, el próximo analizado la señalización /β-catenina vía. TCF /LEF ensayo indicador de luciferasa mostró que la señalización de β-catenina fue promovido en las células A-1 en presencia o ausencia de Wnt3a (Fig. S1E).
Discusión
En este estudio, se investigado el papel de DDX3X en la adquisición de la resistencia a EGFR-TKI en células de cáncer de pulmón. Nuestros resultados revelaron que las células cancerosas tienen mutaciones de EGFR-activación podrían desactivar la señalización del EGFR y perder la adicción señal de EGFR. residuos de Tyr en EGFR de las células de cáncer de pulmón que sobreexpresan DDX3X no se fosforilaron, incluso en presencia de EGF. Esto fue un hallazgo inesperado y sorprendente porque las mutaciones de EGFR de activación causan que el dominio quinasa de EGFR para permanecer en la conformación activa, incluso en ausencia de ligandos, lo que resulta en la fosforilación de residuos de tirosina en los segmentos de la cola C-terminal. El mecanismo exacto a través del cual DDX3X inhibe la fosforilación de residuos de tirosina en EGFR no está claro. Sin embargo, la inhibición de la actividad de tirosina quinasa es poco probable que participe porque no sólo los residuos de tirosina sometidos a la autofosforilación en segmentos de la cola C-terminal, sino también Tyr845 en el dominio de quinasa, que también puede ser fosforilado por Src, no fueron fosforilados. La observación de que la señalización mediada DDX3X /β-catenina Wnt es consistente con un informe reciente que describe la estimulación Wnt-dependiente de la caseína quinasa 1 y la promoción de la fosforilación despeinado por DDX3X en células de mamífero [33]. Además, todo el exoma análisis identificó DDX3X como un componente de la señalización de β-catenina patógeno, en el meduloblastoma Wnt subgrupo [12] - [14]. Tomados en conjunto, nuestros datos actuales y estos estudios previos indican que DDX3X es un componente crítico de la vía de señalización /β-catenina vía y que el cambio de la señal de la adicción al EGFR ß-catenina de señalización podría ser inducida por DDX3X en células de cáncer de pulmón que albergan EGFR la activación de mutaciones.
DDX3X es una helicasa de ARN que es altamente conservadas de la levadura a humana y modulan la estructura del RNA [34]. Por lo tanto, se cree que las helicasas de ARN para participar en la transcripción de ARN, corte y empalme, y la traducción. DDX3 humano tiene dos genes estrechamente relacionados, y DDX3X DDX3Y, que están codificados en los cromosomas X e Y, respectivamente. DDX3Y se expresa únicamente en células germinales y es esencial para la espermatogénesis [35]. Curiosamente, se encontró que DDX3X aumento de las células cancerosas acompañados de fenotipos madre-como tales como la expresión de Sox2 upregulated, ALDH, y CD44 inducida. Además, la proliferación de anclaje independiente, cadherina el cambio de E-cadherina a N-cadherina, la expresión de vimentina, se observó en estas células. De acuerdo con nuestros hallazgos, se han reportado tumores que albergan regulada positivamente DDX3X exhiben propiedades similares a madre y /o pruebas de la EMT en el melanoma, el cáncer de mama y leucemia [8], [10], [12], [36]. Especialmente, meduloblastoma, en el que DDX3X se ha demostrado que actúa como un gen conductor, es similar en aspecto y potencial de diferenciación de las células madre y progenitoras neuronales. Sin embargo, es hallazgo único que las células de adenocarcinoma de pulmón no tratados contenían una subpoblación expresar firmemente DDX3X y acompañados de conmutación de la señal, CSC-fenotipos similares, y la evidencia de la EMT.
En resumen, este estudio proporciona la primera demostración de que DDX3X pérdida inducida de la adicción a la señal de EGFR lo que resulta en resistencia a EGFR-TKI, acompañado de propiedades como CSC-y la aparición de la EMT en las células de cáncer de pulmón que albergan la mutación de EGFR-activación.