Extracto
Desmogleína 3 (DSG3) es un componente de la desmosome, que confiere adhesión célula-célula fuerte. Anteriormente, una función oncogénica de DSG3 se ha encontrado en cáncer del cuello (HNC). A continuación, se investigó cómo esta molécula contribuye al fenotipo maligno. Debido DSG3 se asocia con plakoglobina, se examinó si estas alteraciones fenotípicas fueron mediadas a través de la molécula plakoglobina. La inmunoprecipitación y la tinción de inmunofluorescencia revelaron que el silenciamiento DSG3 interrumpido su interacción con plakoglobina e indujo plakoglobina translocación desde el citoplasma al núcleo. Desmontables de DSG3 aumentó significativamente la interacción de plakoglobina con el factor de transcripción TCF y suprimió el TCF /LEF transcripcional actividad. Estos efectos conferidos además a la reducción de expresión de los genes diana aguas abajo TCF /LEF, incluyendo c-myc, ciclina D1, y MMP-7. Análisis funcional mostraron que el silenciamiento DSG3 reduce el crecimiento celular y las células en fase G0 /G1 detenido. Además, también se redujeron las capacidades de migración celular y la invasión. Estos resultados se confirmaron celulares utilizando xenoinjertos de tumores en ratones, como silenciamiento DSG3 condujo al crecimiento del tumor suprimido, plakoglobina translocación y reducción de expresión de TCF /LEF genes diana en los tumores. Por lo tanto, nuestro estudio muestra que el DSG3 proteínas de los desmosomas, además, las funciones de regular los fenotipos malignos vía de señalización nuclear. En conclusión, hemos encontrado que las funciones DSG3 como un oncogén y facilita el crecimiento del cáncer y la invasión de las células HNC través de la vía DSG3-plakoglobina-TCF /LEF
Visto:. Chen YJ, Lee LY, Chao YK, Chang JT , Lu YC, Li HF, et al. (2013) DSG3 Facilita el crecimiento de células cancerígenas y la invasión a través de la DSG3-Plakoglobin-TCF /LEF-Myc /ciclina D1 /MMP vía de señalización. PLoS ONE 8 (5): e64088. doi: 10.1371 /journal.pone.0064088
Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 7 de Diciembre, 2012; Aceptado: April 10, 2013; Publicado: 30 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de Memorial hospital Chang Gung (los números de subvención CMRPD1A0641 y CMRPD190391-2) y del Departamento de Salud de Taiwán (número de concesión DOH99-TD-C-111-006). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
desmogleína 3 (DSG3) es uno de los componentes del desmosoma. Desmosomas son puntos de botón-como de contacto intercelular que permiten la fijación de elementos del citoesqueleto a la membrana plasmática en los sitios de célula-célula. Por anclaje a los filamentos intermedios que soporta esfuerzo, desmosomas proporcionan una fuerte adhesión intercelular para mantener la integridad del tejido y la homeostasis [1] - [3]. Desmosomas se componen de proteínas de al menos tres familias de genes distintos: cadherinas (por ejemplo, DSG1-4 y DSC1-3), proteínas armadillo (por ejemplo, plakoglobina y varios plakophilins), y plaquinas (por ejemplo, desmoplaquinas, envoplakin, y periplakin). Estas proteínas desmosómicas se coordinan y se asocian entre sí para formar el desmosome. El andamio supracellular resultante juega un papel clave en la prestación de la integridad mecánica de los tejidos [1] - [3]. Además de su papel en la adhesión célula-célula, las proteínas cadherina y armadillo pueden funcionar como transductores moleculares para convertir un evento extracelular en señales intracelulares [4]. Por ejemplo, la cola de DSG3 ha demostrado plakoglobina obligado [1] - [3]. Plakoglobin está estrechamente relacionado con ß-catenina, que es un conocido molécula efectora aguas abajo en la vía de señalización Wnt canónica [5]. Por lo tanto, es posible que DSG3 puede transducir mensajes molecular a través de la vía de señalización plakoglobina.
Varios informes han encontrado que las proteínas de los desmosomas, se expresan anormalmente en varios tipos de cáncer. Si bien han informado de algunos investigadores que la expresión de las proteínas de los desmosomas, está disminuida en los cánceres, otros han encontrado que la expresión se incrementa. Por ejemplo, se ha informado de las reguladas de DSC2 en el cáncer colorrectal [6], en DSC3 de mama y cáncer de la cavidad oral de [7], [8], y DSG2 en el cáncer gástrico [9], [10]. Sin embargo, también se ha demostrado la sobreexpresión de DSG2 o DSG3 en varios tipos de cáncer, incluyendo la piel, próstata, pulmón y cáncer de cabeza-cuello [11] - [14]. Todos estos estudios indican que la desregulación de las proteínas de los desmosomas, juega un papel durante la carcinogénesis. En consonancia con otros informes, hemos encontrado previamente que las funciones DSG3 como un oncogén en el cáncer de cabeza y cuello y se asocia con la enfermedad avanzada [15]. En este estudio, se investigó más a fondo cómo esta molécula contribuye a la formación de cáncer. Nuestros resultados mostraron que DSG3 promueve el crecimiento de células de cáncer y la invasión a través de una vía de señalización mediada por plakoglobina. Estos efectos resultaron en la alteración de la TCF /LEF transcripcional actividad y por lo tanto alterar la expresión de las moléculas de aguas abajo, incluyendo c-myc, ciclina D1, y MMP-7, que puede conducir a fenotipos malignos.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares, la construcción de shRNA y transfección celular
Dos líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello, OECM1 y SAS [16], se utilizaron. Las células OECM1 se mantuvieron en medio RPMI 1640, y las células se cultivaron en SAS Modificado de Dulbecco medio de Eagle. Todos los medios se complementaron con 10% de suero bovino fetal (FBS) y antibióticos (100 U /ml de penicilina, 100 U /ml de estreptomicina y 0,25 g /ml de anfotericina B), y las líneas de células se cultivaron en una atmósfera humidificada a 37 ° C con 5% de CO
2.
El shRNA secuencia de dirección DSG3 (shDSG3), que se ha descrito anteriormente [15], se subclonó en un plásmido pCI-neo y se utiliza para establecer las células transfectadas de forma estable shDSG3 . Plakoglobin dirigido shRNA fue diseñado como un sentido 22-nt y horquilla antisentido que era complementaria a la secuencia de mRNA plakoglobina 5'-GGA TGC CCA GCG CCA CGT AGC T-3 'y fue clonado en el plásmido vector pTOPO-U6, como se describió previamente [15].
para la transfección del plásmido, las células se sembraron a una densidad de 5 × 10
5 en un plato de 100 mm y se cultivaron durante 16 horas. Cuando las células alcanzaron 60% de confluencia, se transfectaron con 6 g de shRNA plásmido o el plásmido vector vacío usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) en Opti-MEM reducido medios suero (Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de 16 horas, los medios de comunicación Opti-MEM se reemplazó con medio completo fresco. Los clones celulares transfectadas estables fueron seleccionados mediante un reactivo de neomicina, solución de antibiótico G418 (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.).
Pacientes y determinación de las expresiones de proteínas en los tejidos clínicos
El estudio se aprobado por el Comité de Ética del hospital Memorial Chang Gung, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los participantes. Se obtuvieron nueve tejidos de biopsias de pacientes con cáncer de cabeza-cuello visitados en las clínicas de cirugía de cabeza-cuello en el Hospital Memorial Chang Gung (Taoyuan, Taiwán), incluyendo cuatro de cinco muestras de mucosa y cáncer sumamente normal. proteínas del tejido se extrajeron y se sometieron a análisis de inmunotransferencia para la determinación de DSG3, plakoglobina, c-myc, ciclina D1, y MMP-7, como se describe a continuación.
extracción de la proteína celular, inmunoprecipitación y análisis de inmunotransferencia
Los métodos de extracción de proteínas, de inmunoprecipitación y de inmunotransferencia se realizó de manera similar como se describe anteriormente [17], [18]. Brevemente, las células se homogeneizaron en tampón de lisis CHAPS, se incubaron en hielo durante 30 minutos, y se centrifugaron para obtener las proteínas celulares. Para el fraccionamiento de las proteínas nucleares, se utilizaron los reactivos commencial NE-PER nucleares y citoplasmáticas de extracción (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Para preparar las perlas de inmunoprecipitación, 30 l de proteína A /proteína G perlas de sefarosa se conjugaron con 4 g de anticuerpos específicos (clon 5H10 para DSG3, H80 clon para plakoglobina, H125 clon para TCF4, Santa Cruz Biotech, CA). Para la inmunoprecipitación, 1 mg del extracto de proteína celular se incubó con 30 l de la proteína A /proteína específica g de perlas durante 4 horas a 4 ° C. Las perlas se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en un tampón de muestra, y se sometieron a análisis de inmunotransferencia. ratón o suero de conejo IgG-no inmunizados se utilizaron como un control negativo para determinar el efecto específico de inmunoprecipitación.
Para el análisis de inmunotransferencia, 30 g de proteína celular se separó usando electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 8% y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se hibridó con una de las siguientes anticuerpos primarios: clon 5H10 para DSG3, H1 clon para plakoglobina, clon M-20 para ciclina D1, 9E10 clon de c-myc (Santa Cruz Biotech, CA), o MAB3315 clon para MMP 7 (Millipore, MA). La membrana se incubó posteriormente con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (Santa Cruz Biotech, CA). La imagen de la proteína fue desarrollado utilizando un Kit Renaissance Western Blot quimioluminiscencia reactivo (NEN Life Science Products, MA) y autorradiografía. Se determinó la densidad de cada banda de proteína después de la normalización a una banda de control de actina mediante el uso de gel de imagen del sistema y el software Image J (Scion Corporation, MD).
El crecimiento celular, la formación de colonias, y citometría de flujo análisis
los ensayos de crecimiento y de formación de colonias se realizaron como se describe anteriormente [19], [20] las células se sembraron a una densidad de 5 × 10
5 en placas de 100 mm, y se determinó el grado de crecimiento de las células diariamente utilizando un hemocitómetro. Para el análisis de la formación de colonias, un total de 1000 células fueron sembradas en placas de 6 pocillos y se dejó crecer sin ser movido por 7 días en medio de cultivo completo que contiene 20% de FBS. El número de colonias de células se contó después de la tinción con 5% de cristal violeta durante 15 minutos.
citometría de flujo se realizó como se describe anteriormente [21]. En pocas palabras, después de la sincronización de las células en la fase G0 /G1 por privación de suero, las células se recogieron posteriormente en diferentes puntos de tiempo (un intervalo de 6 horas para las células OECM1 y un intervalo de 3 horas para las células SAS). Los sedimentos de células se fijaron con etanol, se permeabilizaron con Triton X-100 y RNasa, y después se incubaron con yoduro de propidio (PI) para la tinción nuclear. Las muestras fueron inmediatamente analizó utilizando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). La distribución de las fases del ciclo celular se determinó usando el Cell Quest Software Pro y el ModiFit. Dos experimentos independientes se realizaron para cada conjunto de datos.
La migración celular y la invasión ensayos
La migración celular y la invasión ensayos se realizaron como se describe anteriormente [19]. Brevemente, los ensayos de migración celular se realizaron con cámaras de policarbonato Transwell (Becton Dickinson Biosciences). Las células se sembraron en una placa de 6 pocillos con insertos Transwell que tenían una membrana de policarbonato porosa (8 micras de tamaño) y se incubaron en medios regulares. Después de 24 horas, las células que habían migrado a la cara inferior de los insertos Transwell se fijaron con glutaraldehído, se tiñeron con cristal violeta, y se fotografiaron.
El ensayo de invasión de células se realizó utilizando las cámaras de invasión BD BioCoat Matrigel (Becton Dickinson Biosciences, Bedford, MA) y la cámara de invasión Millicell (Millipore Corporation, Bedford, MA). La membrana del inserto de cámara superior Millicell, que tiene un tamaño de poro de 8 m, se colocó en una placa de 24 pocillos y se recubre con Matrigel. Se sembraron las células en las cámaras superiores con medios que contienen 1% de FBS. Las cámaras inferiores contenían medio de cultivo completo (FBS al 10%) para atrapar las células invasoras. La capacidad de invasión de las células se determinó cada 24 horas contando las células en las cámaras inferiores que habían pasado con éxito a través de la membrana recubierta con Matrigel.
inmunofluorescencia y microscopía confocal
La inmunofluorescencia y microscopía confocal análisis se realizó como se describe anteriormente [22]. Brevemente, los cubreobjetos de vidrio se recubrieron primero con poli-L-lisina y formaldehído. Las células fijadas se permeabilizaron con Triton posteriormente-X-100 y se bloquearon con suero bovino fetal. Los cubreobjetos se incubaron con un anti-DSG3 (clon 5H10), un anti-plakoglobina (clon H-80, Santa Cruz Biotech), un anti-β-catenina (clon E5), o un anticuerpo anti-TCF4 (cloneD4), y se tiñeron con isotiocianato de fluoresceína (FITC) - o un anticuerpo secundario conjugado con rodamina. Los cubreobjetos se montaron con medio de montaje que contiene DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). La fluorescencia se visualizó usando un microscopio láser confocal (Leica TCS SP2 MP).
ensayo indicador de luciferasa para la actividad promotora TCF
Para determinar la actividad promotora TCF, la TOPflash (TOP) y el negativo se utilizaron el control de contrapartida FOPFLASH (FOP) reportero plásmidos (Millipore, Corporation, Bedford, MA). El plásmido TOP contenía TCF sitios de unión, mientras que el FOP, sitios de unión contenía TCF inactivos mutantes. Las células estables shDSG3 o células plakoglobina desmontables fueron transfectadas con plásmidos informadores TOP o FOP, junto con el promotor de la timidina quinasa-Renilla indicador de luciferasa del plásmido (Promega, Madison, WI) como un control interno. Después de 48 horas, se recogieron las células, y las actividades de TOP /FOP se midieron usando el Dual Luciferase-Reporter sistema de ensayo en combinación con el luminómetro GloMax 20/20 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega). El TOPflash o actividad FOPFLASH se normalizaron en contra de la actividad luciferasa de Renilla, y se informó del aumento veces en el TOP en comparación con el plásmido informador FOP (TOP /FOP).
Mouse modelos de xenoinjerto y el análisis inmunohistoquímico de los tumores xenoinjertados
Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el IACUC (Institucional cuidado de animales y el empleo) de la Universidad Chang Gung y en las pautas del consejo de investigación de nuestra institución para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Se utilizaron un número mínimo de ratones para el estudio y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Se realizó el método de generación de xenoinjertos como se describe anteriormente [23]. Brevemente, se utilizó un total de 6 macho BALB /C ratones nulos a las 5 semanas de edad para el experimento. Un total de 5 × 10
5 células silenciamiento DSG3 estable (shDSG3) o células transfectadas estables de vectores se inyectaron por vía subcutánea en la parte superior de la extremidad posterior. El tamaño del tumor se controló a diario por el cálculo del volumen como la longitud x anchura x altura usando calibres. El peso del tumor se midió después de que los ratones fueron sacrificados en el día 38. Los tumores de xenoinjertos se quitaron y se sometieron a inmunohistoquímica (IHC) o análisis de transferencia Western.
IHC se realizó como se describe anteriormente [24]. Brevemente, las muestras de tejido se fijaron en una solución de formaldehído y embebidos en parafina. Las secciones se desparafinaron con xileno, hervidas en tampón de citrato para recuperar los antígenos, y se bloquearon con peróxido de hidrógeno. Los portaobjetos se incubaron entonces con anticuerpos primarios. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-DSG3 (clon 32-6300, Zymed Laboratories Inc., CA, EE.UU.), anti-c-myc (clon 9E10, Santa Cruz Biotech, CA, EE.UU.), anti-ciclina D1 (clon M20, Santa Cruz Biotech, CA, EE.UU.), o anti-MMP-7 (MAB3315, Millipore, Corporation, Bedford, MA). análisis IHC y el desarrollo de color se realizaron utilizando un sistema de Dako Envision (Dako, Carpinteria, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. diluyentes de anticuerpo se sustituyen por los anticuerpos primarios como controles negativos y después de contraste con hematoxilina (HE). Las reacciones de tinción se determinaron por examen microscópico.
El análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba t de Student para comparar los dos conjuntos de datos entre diferentes muestras. Todos los valores de p fueron de dos caras. Un
p
valor. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
silenciamiento DSG3 altera su interacción con plakoglobina e induce la translocación al núcleo plakoglobina
Para demostrar la función celular de DSG3, que estableció shDSG3 células derivadas de la selección de las líneas de células HNC OECM1 y SAS después de la transfección de shRNA DSG3 focalización expresan de forma estable. La eficacia de la caída DSG3 se muestra en la Figura 1A. En las células OECM1, ambos clones (SH1 y SH2) que aparecen caída significativa de DSG3 (& gt; 90%) en comparación con las células transfectadas con el vector vacío. En el SAS células, SH1 y SH2 reducen expresión DSG3 a 60% y 30%, respectivamente. Por lo tanto hemos utilizado OECM1-SH1 y SAS-SH2 células del clon largo de más estudios.
expresión (A) DSG3 fue suprimida en las células shDSG3 utilizando RNAi. células OECM1 y SAS se transfectaron con el plásmido de expresión de shRNA-DSG3 específico o el plásmido vector vacío, y los clones fueron seleccionados utilizando G418. Cuatro clones (OECM1-SH1 y OECM1-SH2 en las células OECM1 y SAS-SH1 y SAS-SH2 en las células SAS) de células shDSG3 fueron escogidos y analizados mediante ensayos de Western blot para determinar el nivel de proteína DSG3. Dos clones (OECM1-V en las células OECM1 y SAS-V en las células SAS) de las células transfectadas con el vector también se escogieron como controles. El nivel de proteína actina se determinó como un control interno para la expresión de proteínas. (B) el silenciamiento DSG3 reduce la interacción de DSG3 con plakoglobina, como se determina por inmunoprecipitación (IP) y el análisis de inmunotransferencia (IB). Se examinaron dos grupos de células, las células transfectadas con el vector vacío y las células transfectadas shDSG3. En cada muestra, las proteínas se extrajeron y se inmunoprecipitaron con anti-DSG3 (D3), anti-plakoglobina (Pg), IgG de ratón (IgG) (como control negativo) tal como se indica encima de cada calle. Cada muestra se inmunotransferencia posteriormente, ya sea con un plakoglobina (Pg) - o DSG3 (D3) de anticuerpos específicos de, como se indica en el lado izquierdo de cada conjunto de muestras. silenciamiento (C) DSG3 inducida plakoglobinn translocación desde el citoplasma al núcleo. Inmunofluorescencia y microscopía confocal se utilizaron para examinar la localización de DSG3 y plakoglobina tanto en las células transfectadas con el vector y transfectadas con shDSG3 vacías. DSG3 se detectó utilizando un anticuerpo primario-DSG3 específica con un anticuerpo secundario conjugado con FITC y se muestra en verde. Plakoglobina se detectó utilizando un anticuerpo primario-plakoglobina específica con un anticuerpo secundario conjugado con rodamina y se muestra en rojo. DAPI se realizó una tinción para la tinción nuclear y se muestra en azul. Las imágenes se fusionaron para identificar la localización subcelular de DSG3 y plakoglobina. La barra de escala indica el tamaño de hasta 40 micras. (D) Total y extracto de proteína nuclear se utilizaron para examinar el nivel plakoglobina por ensayo de inmunotransferencia. la densidad de proteínas se midió por el software Image J. extractos de proteínas totales se normalizaron con la actina; extractos de proteínas nucleares se normalizaron con HDAC para calcular el nivel de expresión relativo.
Desde DSG3 es un componente de la desmosome e interactúa con otras proteínas de los desmosomas, como plakoglobina, para mantener la adhesión célula-célula. Investigamos si la vía de señalización de DSG3 se mediada a través de su interacción con la molécula plakoglobina aguas abajo. Como se muestra en la Figura 1B, el silenciamiento DSG3 no tuvo ningún efecto significativo en el nivel de expresión de plakoglobina. Cuando las muestras de proteínas de las células transfectadas con el vector vacío se inmunoprecipitaron con un anticuerpo de DSG3 específica y a inmunotransferencia con un anticuerpo específico plakoglobina, estas dos moléculas interactúan uno con el otro. En las células shDSG3, DSG3 exhibió una asociación mucho más débil con plakoglobina que en las células transfectadas con el vector vacío. Resultados similares se encontraron en el experimento inverso. Cuando las muestras de proteínas se inmunoprecipitaron con un anticuerpo de plakoglobina específica y a inmunotransferencia con un anticuerpo de DSG3 específica, aunque no se encontraron interacciones entre estas dos moléculas en las células transfectadas con el vector y la shDSG3 vacías, las células shDSG3 mostraron una asociación mucho más débil. Estos resultados indicaron que desmontables DSG3 interrumpe la interacción entre DSG3 y plakoglobina.
La interrupción de la interacción entre DSG3 y plakoglobina en las células SH-D3 se demostró adicionalmente mediante inmunofluorescencia. Como se muestra en las imágenes de tinción y fluorescencia nuclear fusionadas en la Figura 1C, y DSG3 plakoglobina co-localizados en la membrana celular en las células de control. En las células SH-D3, no se observó esta co-localización. En lugar de ello, desmontables de DSG3 facilitó plakoglobina translocación de la membrana celular de desmosome uniones al núcleo. Por otra parte, proteína y proteína nuclear total de extractos se examinaron distribución plakoglobina por ensayo de inmunotransferencia. En la Figura 1D, plakoglobina nivel elevado en el extracto de proteína nuclear en las células SH-D3 que las células de control de vectores, pero la cantidad de plakoglobina en la fracción de proteína total no encontró diferencias significativas entre las células de control de vectores sh-D3 y. Estos resultados sugieren que desmontables DSG3 altera su interacción con plakoglobina e induce plakoglobina translocación al núcleo
DSG3 aumenta desmontables la interacción de plakoglobina con el factor de transcripción TCF
Plakoglobin es el vertebrado más cercana relativa de β -catenina, que es una molécula efector aguas abajo en la vía de señalización Wnt canónica, aunque tienen diferentes potenciales de transactivación [25] - [28]. la señalización de Wnt se inicia una cascada de eventos que permite β-catenina de escapar de la degradación mediada por proteasoma, que normalmente se asegura de que sólo hay un bajo nivel basal de β-catenina en el citoplasma. β-catenina es entonces capaz de trasladar al núcleo donde complejos con el factor de unión /potenciador (TCF /LEF) factores de transcripción de la familia del factor de linfoides de células T y activa la transcripción de genes diana [25], [28]. Por lo tanto, se investigó si plakoglobina translocación nuclear desencadenada por desmontables de DSG3 efectúa la interacción entre plakoglobina y el factor de transcripción TCF. Los métodos de inmunoprecipitación y de inmunotransferencia se utilizaron para examinar tanto en OECM1 (Figura 2A) y células de SAS (Figura 2B). Como se muestra, el silenciamiento DSG3 aumento de la unión de TCF4 con plakoglobina pero no tenía ningún efecto significativo en la interacción con β-catenina. ensayos de inmunofluorescencia también revelaron resultados consistentes. En comparación con las células de control transfectadas con vector, DSG3 knockdown aumentó la cantidad de plakoglobina en el núcleo, que había sido mostrado prominente co-localización con el factor transcripcional TCF4 (Figura 2C). Estos resultados sugieren que desmontables de DSG3 inducida plakoglobina translocación en el núcleo, lo que condujo al aumento de la unión al factor de TCF transcripcional.
(A, B) Desmontables de DSG3 aumentó plakoglobina de unión al factor de transcripción TCF4, según lo determinado por inmunoprecipitación (IP) y análisis de inmunoblot (IB) como se determina en OECM1 (a) y células de SAS (B). Los extractos celulares del vector o las células transfectadas estables shDSG3 se inmunoprecipitaron con anti-TCF4, IgG de conejo (IgG) (como control negativo) y posteriormente a inmunotransferencia con anticuerpo plakoglobina o β-catenina. (C) de inmunofluorescencia y microscopía confocal se utilizaron para examinar las interacciones entre plakpglobin y TCF4. Las células vectoriales o shDGS3 estables transfectadas fueron co-teñidas con anticuerpos ya sea plakoglobina y TCF4. Después del lavado, las diapositivas se incubaron con el segundo anticuerpo conjugado con rodamina o FITC. tinción DAPI Se llevó a cabo para la tinción nuclear. La barra de escala indica el tamaño de hasta 40 micras.
silenciamiento DSG3 suprime TCF /LEF transcripcional actividad y los genes diana aguas abajo de c-myc, ciclina D1, y MMP-7
investigó además si plakoglobina translocación nuclear provocada por el silenciamiento DSG3 también indujo efectos sobre el TCF /LEF transcripcional actividad. Dado que el papel de plakoglobina en la vía Wnt no está bien definida, por lo tanto, identificamos la función de plakoglobina en el TCF /LEF transcripcional actividad. Se utilizó el ensayo indicador de luciferasa TOPflash /FOPFLASH [28]. Como se muestra en la Figura 3A, desmontables de expresión plakoglobina aumentó el TCF /LEF transcripcional actividad más de 2 veces en las células OECM1 y SAS después de 1 día. Estos resultados sugieren que, en contraste con ß-catenina, funciones plakoglobina como un regulador negativo de la señalización de Wnt y la LEF transcripcional vía TCF /.
(A) y (B) Los efectos de TCF /LEF transcripcional actividad después de plakoglobina o desmontables DSG3. El silenciamiento estable plakoglobina (sh-Pg) o el silenciamiento DSG3 células (sh-D3) se transfectaron con TOPflash o FOPFLASH plásmido indicador de luciferasa de Renilla y el plásmido. Después de 24 horas, se determinó la actividad de luciferasa usando el Reactivo de Luciferasa Steady-Glo. La actividad de la luciferasa de luciérnaga se normalizó en contra de la actividad de la luciferasa de Renilla y el aumento pliegue de la actividad en comparación con TOPflash se informó de la actividad FOPFLASH. (C) y (D) Las expresiones de la /LEF genes diana aguas abajo de c-myc y ciclina TCF D1 se determinó en las células transfectadas de forma estable con el objetivo específico shRNAs con plakoglobina células (SH-Pg) o DSG3 (SH-D3), en comparación con el vector de forma estable células transfectadas. En cada muestra, las proteínas se extrajeron y analizaron mediante ensayos de Western blot para determinar los niveles de expresión de c-myc, ciclina D1, y MMP-7.
El efecto potencial de silenciamiento DSG3 en el TCF /se examinó la actividad transcripcional LEF. Como se muestra en la Figura 3B, desmontables de DSG3 suprimió la LEF transcripcional actividad TCF /a un nivel de 53% de las células de control en las células OECM1 y 59% en las células SAS después de 1 día. Junto con estudios anteriores, estos resultados demostraron que desmontables DSG3 interrumpido su interacción con plakoglobina (Figura 1B), haciendo que la importación nuclear de plakoglobina (Figura 1C), lo que facilita su interacción con TCF (Figura 2), y que conduce a la mejora de su efecto supresor sobre el TCF /LEF actividad transcripcional (Figura 3B).
para investigar más a fondo cómo DSG3 regula la vía de señalización /LEF-plakoglobina TCF que conduce a alteraciones en la homeostasis celular, se examinaron varias moléculas diana aguas abajo TVC, incluyendo c-myc , ciclina D1, y la metaloproteinasa de matriz 7 (MMP-7) [29] - [31], todos los cuales poseen funciones importantes en el crecimiento celular y la invasión. Según se determinó por Western blot, plakoglobina silenciar a un aumento sustancial de las expresiones de c-myc, ciclina D1, y MMP-7 en las líneas celulares OECM1 y SAS (Figura 3C), mientras que DSG3 silenciamiento suprimió la expresión de estas proteínas en ambas líneas celulares (Figura 3D). Estos resultados sugieren que el silenciamiento DSG3 suprimió el TCF /LEF transcripcional actividad, lo que inhibir aún más la expresión de las moléculas de aguas abajo c-myc, ciclina D1, y MMP-7.
silenciamiento DSG3 inhibe el crecimiento celular e induce la célula la detención del ciclo en la fase G0 /G1
Desde DSG3 ha demostrado como un transductor molecular para regular la expresión de c-myc, ciclina D1 y MMP7, se examinó si esta molécula funcionó en la regulación del crecimiento celular. Como se muestra en la Figura 4A, el silenciamiento DSG3 suprimió el crecimiento celular de células OECM1 por 64% en el día 3 y suprimió el crecimiento celular de células de SAS en un 76% en el día 3. Este fenómeno fue apoyado además el uso de ensayos de formación de colonias que mostraban 90% la inhibición del crecimiento en células OECM1-shD3 y 80% de inhibición de crecimiento en células SAS-shD3. Para investigar el efecto de DSG3 en la regulación del ciclo celular, citometría de flujo se realizó el análisis. Como se muestra en la Figura 4B, desmontables de DSG3 dio lugar a células que detenidos en la fase G0 /G1, tal como se ilustra por el retraso en la entrada en la fase S. OECM1 células comenzaron a entrar en la fase S a las 12 horas (45,0%), mientras que las células OECM1-shD3 no comenzaron a entrar en la fase S hasta aproximadamente 18 horas (49,3%). Del mismo modo, las células SAS a partir de entrar en la fase S a las 3 horas (48,9%), mientras que las células SAS-shDSG3 no entraron en la fase S de hasta 6 horas (40.27%). Estos resultados sugieren que DSG3 desmontables inhibe el crecimiento celular mediante la detención de células en la fase G0 /G1 tardía entrar a la fase S.
(A) El crecimiento celular se redujo en las células shDSG3. Un total de 10
5 células de células transfectadas con vector vacío o transfectada-shDSG3 (SH-D3) se sembraron en una placa de 10 mm y se cultivaron durante 3 días. Los experimentos se realizaron por triplicado (***, p & lt; 0,001) (panel superior). La formación de colonias se redujo en las células shDSG3. Un total de cualquiera de 1000 células transfectadas con vector vacío o células transfectadas con shDSG3 (SH-D3) se sembraron en una placa de 6 pocillos y se incubaron durante 7 días para permitir la formación de colonias. Las colonias celulares se visualizaron y se contaron después de la tinción con 5% de cristal violeta. (***, P & lt; 0,001) (panel inferior). (B) El ciclo celular detenido en la fase G0 /G1 en las células shDSG3. Los shDSG3 (sh-D3) las células (5 × 10
5 células por placa de 10 cm) fueron sincronizados en la fase G0 /G1 mediante el cultivo en medio libre de suero durante 24 horas. A continuación, el medio de cultivo celular se cambió a completar medios de comunicación para permitir que las células entren en el ciclo celular. Las células se recogieron cada 6 ó 3 horas, y su estado de ciclo celular se determinó usando citometría de flujo. (C) La capacidad de migración de las células se redujo en las células shDSG3, como se determina usando un ensayo de migración Transwell. Cualquiera de vacío vector transfectadas o transfectadas con shDSG3 células (sh-D3) se sembraron a una densidad de 10
5 células por pocillo en una placa de 6 pocillos con insertos Transwell que tenía una membrana de policarbonato porosa (8 micras de tamaño) y se incubaron en medios de comunicación regular. Después de 24 horas, las células que habían migrado a la cara inferior de los insertos Transwell se tiñeron con cristal violeta. Cada experimento se realizó por triplicado. (***, P & lt; 0,001). (D) La capacidad de invasión de células se redujo en las células shDSG3, como se determina usando un ensayo de invasión de Matrigel. De cualquier vector vacío transfectadas o transfectadas con shDSG3 células (sh-D3) se sembraron a una densidad de 10
5 células por pocillo en una placa de 24 pocillos con cámaras de invasión Millicell recubiertas con Matrigel y se incubaron a 37 ° C durante 24 horas. El número de células que migraron a través del Matrigel a la cámara inferior se determinaron cada 12 y 24 horas. Cada experimento se realizó por triplicado (***, p & lt; 0,001).
silenciamiento DSG3 inhibe la migración celular y la invasión
Dado que las funciones DSG3 en las interacciones célula-célula, se examinó si DSG3 caída afectó la migración celular y la invasión. Los resultados de migración de células del ensayo Transwell se muestran en la Figura 4C. La migración de dos líneas de células SH-D3 se redujo drásticamente después de 24 horas en comparación con las líneas celulares de control. Los resultados de la invasión de células del ensayo de Matrigel se muestran en la Figura 4D.