Extracto
Sld5 es un miembro del complejo GINS compuesto por PSF1, PSF2, PSF3 y Sld5, jugando un papel fundamental en la formación del tenedor con la replicación del ADN en la levadura CDC45. Anteriormente, habíamos aislado un ortólogo PSF1 de una biblioteca de ADN de células madre hematopoyéticas murinas y fueron capaces de identificar orthologues de todos los demás miembros GINS por la levadura de dos híbridos utilizando el enfoque PSF1 como el cebo. Estos ortólogos GINS pueden funcionar también en la replicación del ADN en células de mamífero debido a que forman complejos tetraméricos como se observa en la levadura, y los mutantes de supresión de genes de ambos PSF1 y resultado Sld5 en una falta de proliferación epiblasto y la letalidad embrionaria temprana. Sin embargo, encontramos que PSF1 también está involucrada en la segregación cromosómica en fase M, en consonancia con las recientes sugerencias de que los homólogos de los genes asociados con la replicación del ADN en organismos inferiores también regulan eventos celulares distintos de la replicación del ADN en células de mamífero. A continuación analizamos la función de Sld5 distinta de la replicación del ADN y encontramos que es activo en el daño y reparación del ADN. La atenuación de Sld5 expresión tiene por resultado daños en el ADN marcado tanto en las células normales y células cancerosas, lo que sugiere que protege contra el daño de ADN. La atenuación de Sld5 retrasa la respuesta de reparación del ADN y la restauración del ciclo celular en las células normales pero no en las células cancerosas. Estos hallazgos sugieren que Sld5 podría representar una molécula diana terapéutica actuando a nivel de las células del estroma del tumor en lugar de las propias células cancerosas, porque el desarrollo de la microambiente tumoral podría retrasarse o interrumpido por la supresión de su expresión en los tipos de células normales dentro del tumoral
Visto:. Gong ZY, Kidoya H, T Mohri, Han Y, Takakura N (2014) Daño del ADN mejorada por la atenuación de Sld5 Retrasa Restauración del ciclo celular en células normales, pero no en las células cancerosas. PLoS ONE 9 (10): e110483. doi: 10.1371 /journal.pone.0110483
Editor: Ryuichi Morishita, Osaka University Graduate School of Medicine, Japón
Recibido: 12 Agosto, 2014; Aceptado: September 15, 2014; Publicado: 21 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Gong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología y subvenciones-en-Ayudas a la Investigación Científica (KAKENHI) Japonés de la Sociedad Japonesa para la la Promoción de la Ciencia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Nobuyuki Takakura es ahora un editor académico de esta revista. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas y criterios editoriales.
Introducción
Las células están constantemente expuestos a daños en el ADN genómico causada por agentes internos y externos como el estrés oxidativo y la UV, respectivamente. Los errores en la reparación de daño del ADN puede resultar en el desarrollo de células de cáncer [1], [2]. Para evitar la transformación oncogénica, las células normales monitorizar y reparar los daños en el ADN en su genoma mediante el establecimiento de puntos de control del ciclo celular [3]. Sin embargo, las células cancerosas son capaces de tolerar daños en el ADN de tal manera que la replicación continúa sin reparación, lo que resulta en la acumulación de la expresión del gen mutante anormal [4]. Este evento se ha sugerido como una de las causas del desarrollo quimio- y radio-resistencia en las células cancerosas malignas.
Sld5 es un miembro del complejo GINS compuesto de PSF1, PSF2 y PSF3. Este complejo se regula el tenedor de replicación del ADN en la levadura en ciernes [5]. En el inicio de la replicación de ADN, el reconocimiento de origen complejo (ORC) se une a la secuencia de replicación autónoma (ARS) que funciona como un dominio de inicio la replicación del ADN. Posteriormente, ciclo de división celular (CDC) 6 y se unen a ARS Cdc1 guiados por ORC e inducen la unión del mantenimiento de mini-cromosomas (MCM) proteínas en las ARS. Estos complejos se denominan pre-replicación (pre-RC) [6] - [8]. Además, Cdc45 y GINS son reclutados para pre-RC y helicasa formar activado CMG (Cdc45-MCM-GINS) en el tenedor de replicación del ADN [9] - [12].
Se identificó un ortólogo de ratón de PSF1 en una biblioteca de ADN derivado de células madre hematopoyéticas durante la embriogénesis en la que esta población celular prolifera activamente [13]. Posteriormente, se identificaron Sld5 utilizando un sistema de dos híbridos de levadura con PSF1 como el cebo [14]. Por otra parte, hemos identificado todos los miembros de GINS en ratones y han confirmado que forman complejos como se observa en la levadura [15]. Hemos informado anteriormente de que los ratones mutantes deficientes para PSF1 o Sld5 muestran letalidad embrionaria temprana causada por la detención del crecimiento de epiblasts en el día embrionario 6.5 [13], [16]. Estos resultados sugirieron que PSF1 y Sld5 son funcionales en mamíferos y es esencial para la proliferación celular, posiblemente asociarse con la replicación del ADN como se observa en la levadura.
alta expresión de genes GINS se ha observado en cánceres y una correlación de su nivel de expresión con la malignidad ha sugerido [17] - [19]. También se informó de que las células cancerosas que muestran mayor actividad promotora PSF1 están iniciando el cáncer /células en un modelo murino de trasplante de células tumorales [20] tallo. Una característica de las células malignas del cáncer es la quimioterapia y radio-resistencia. La expresión de alto nivel de genes GINS puede inducir no sólo el crecimiento celular, sino también la resistencia a la quimioterapia. Sin embargo, no se ha determinado si la función de los genes GINS está implicado en el daño del ADN o reparación. Mediante la observación de la celularidad de la médula ósea en ratones mutantes, encontramos previamente que la haploinsuficiencia de PSF1, pero no Sld5, reduce el crecimiento celular [13], [16]. Por lo tanto, es complicado de analizar la función de PSF1 en daño en el ADN derribando expresión PSF1 porque el propio crecimiento de las células también se ve afectada por la falta de este factor. En caso de Sld5, heterocigotos Sld5
+/- ratones, que estaban sanos y fértiles, nacieron en la frecuencia mendeliana y exhibieron un crecimiento normal. Por otra parte, no hay gran diferencia de celularidad de la médula ósea entre salvaje y Sld5
+/- ratones [16]. Por lo tanto, hemos utilizado Sld5
+/- ratón fibroblastos embrionarios (MEFs) para analizar la reparación de daños en el ADN y el crecimiento celular después de daño en el ADN. Por otra parte, se comparó la función de Sld5 en la reparación del daño en el ADN utilizando siRNA experimentos knock-down en las células cancerosas.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y tratamiento de drogas
MEF, células B16 (células de melanoma de ratón), y células colon26 (células de cáncer de colon de ratón) se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma) con 10% de suero bovino fetal (FBS; Sigma), y penicilina /estreptomicina (Sigma) a 37 ° C bajo una atmósfera de 5% de CO
2. MEFs se prepararon a partir de tipo salvaje (WT) o Sld5
+/- ratones en el día embrionario (E) 15,5 de acuerdo con el método habitual [16]. células B16 y células colon26 se adquirieron de banco de células de Riken (Tsukuba, Japón). Las células se trataron con 1 M o 10 M etopósido (Sigma). Para inducir daño en el DNA fuertemente, hemos utilizado 10 M etopósido. Sin embargo, 10 M etopósido indujo apoptosis de las células gravemente. Por lo tanto, se utilizó etopósido 1 M para observar la restauración del ciclo celular. Los animales fueron alojados en habitaciones el medio ambiente controlado de las instalaciones de animales de experimentación en la Universidad de Osaka. Todos los experimentos se llevaron a cabo conforme a las leyes y directrices aplicables para el cuidado y uso de animales de laboratorio en el Instituto de Investigación de Enfermedades microbianas, la Universidad de Osaka, aprobado por el Comité Experimental Animal del Instituto de Investigación de Enfermedades microbiana, Universidad de Osaka (Número de permiso 3239- 6). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
siRNA transfección
Sld5 expresión en las células B16 y Colon26 fue derribado de forma transitoria con pequeños ARN de interferencia (siRNA) . Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) se utilizó para la transfección de plásmido y siRNA en las células, siguiendo los protocolos de los fabricantes, y los experimentos se realizaron 48 h después de la transfección. Se utilizaron dos oligonucleótidos diferentes siRNA específicos para Sld5; secuencias de siRNA objetivo fueron: 5'-GGA CCA CAC GGA GAC CCA CUU SAU A-3 '(# 1); 5'-GAU GAG CAG AGA GAC UAC GUG AUU G-3 '(# 2).
El azul tripán prueba de exclusión para la viabilidad celular y la regeneración después del tratamiento con etopósido
5 × 10
3 células fueron sembradas en cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos (BD Falcon) en 500 l de medio. Después de 24 h, los pocillos se expusieron a 1 etopósido mu M durante 12 h. Después de que el fármaco se eliminó, las células se recogieron inmediatamente (0 h). La viabilidad celular se evaluó mediante exclusión con azul de tripano. El mismo número de células vivas se resuspendió en medio fresco, y las células se cultivaron durante 24, 48 o 72 h. Ellos luego se separaron mediante la adición de 100 l de Tripsina-EDTA a cada pocillo; a continuación, las células se lavaron y se re-suspendieron en 400 l de medio. 20 l de células resuspendidas se mezclaron con 20 l de solución de 0,4% de colorante azul de tripano (Life Technologies) durante 1 min. Las células se contaron inmediatamente con un micro-cámara de Neubauer con un microscopio óptico. Todos los recuentos se realizaron utilizando cuatro duplicados técnicas de cada muestra. Los medios y las desviaciones estándar se calcularon para cada subcultivo.
Western blotting
se recogieron y se lisaron en tampón de muestra de SDS (50 mM Tris-HCL, pH 6,8, 2% de dodecilsulfato de sodio, 6 células % de 2-mercaptoetanol, 10% de glicerol, 0,003% de azul de bromofenol) que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa. Las proteínas se separaron en 10% o 15% de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Después de bloquear durante 1 h en TBST (Tris 25 mM, pH 7,5, 1,37 M NaCl, KCl 27 mM, 0,05% de Tween 20) que contiene 2% de leche seca no grasa, las membranas se incubaron con anti-Sld5 (1:1000; Iwaki) , anti-γ-H2AX anticuerpo, o de ratón anti-β-actina en tampón de bloqueo durante la noche (1:500; Cell Signaling), anti-Rad51 (Santa Cruz H-92;; 1:1000). a continuación, las membranas se lavaron con TBST y se incubaron con anticuerpos anti-rata, conejo o cabra HRP-conjugados (1:10000) para 1 h. Los anticuerpos unidos se detectaron con kits ECL (Amersham). Las proteínas inmunorreactivas se visualizaron usando el sistema ECL Prime Western Blot Detección (GE Healthcare, Buckinghamshire). Las transferencias fueron escaneados utilizando el densitómetro de imágenes Las-300 mini (Fujifilm, Tokio, Japón).
Análisis estadístico
Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar. Se utilizó
t
de Student para el análisis estadístico. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando
p
. & Lt; 0,05
Resultados
Enhanced daño en el ADN por la atenuación de la expresión Sld5 en MEFs
Para evaluar si Sld5 se refiere a la respuesta al daño del ADN, se comparó la diferencia entre el daño del ADN utilizando los MEF de ratones WT y Sld5
+/- ratones [16]. Se confirmó que el nivel de Sld5 en Sld5
+/- MEFs fue de aproximadamente la mitad que en WT MEFs (Figura 1A y B). Para investigar el daño del ADN, desafiamos MEFs con etopósido, un inhibidor de la topoisomerasa Π que induce ADN doble hebra se rompe [21], [22]. Las células fueron tratadas con 0,01% de DMSO como control o con 10 etopósido mu M durante 1 h. En el estado estacionario (exposición a DMSO), el nivel de fosforilación de la histona H2AX cromatina determinada (γ-H2AX), que es un marcador cuantitativo de la respuesta al daño de ADN en el sitio de doble filamento se rompe [23], [ ,,,0],24], fue baja y similar en ambos WT y Sld5
+/- MEFs (Figura 1C y D). La exposición a etopósido condujo a un aumento en el nivel de γ-H2AX en ambos WT y Sld5
+/- MEFs, pero significativamente más que en la última (figura 1C y D).
(A) El análisis de transferencia Western de la expresión Sld5 en WT y Sld5
+/- MEF. β-actina fue el control interno. (B) Evaluación cuantitativa de la expresión Sld5 como se revela en (A) basado en el análisis densitométrico. Los resultados se representan como factor de cambio en comparación con el nivel observado en WT MEFs. Los datos representan la media ± SD. *,
P Hotel & lt; 0,05 (n = 3). (C) Análisis de transferencia Western de la expresión γ-H2AX en WT y Sld5
+/- MEFs tras el tratamiento con etopósido (ETO) o vehículo de control (DMSO). β-actina fue el control interno. (D) La evaluación cuantitativa de la expresión de γ-H2AX como se revela en (C). Los resultados son los factores de cambio en comparación con el nivel observado en WT MEFs tratadas con DMSO. Los datos representan la media ± SD. *,
P
. & Lt; 0,05 (n = 3) guía empresas
Retraso de la restauración del ciclo celular por la atenuación de la expresión Sld5 en MEFs después de daño en el ADN
Para dilucidar si el daño del ADN marcado causada por la atenuación de la expresión Sld5 se refiere a la reparación de daños en el ADN, se midió el nivel de proteína Rad51, que es el componente clave para la recombinación homóloga [25]. Como se describió anteriormente, MEFs fueron tratados con 1 etopósido mu M durante 12 h, y luego la expresión de proteína Rad51 se analizó a las 0, 24, 48 y 72 h después de su retirada (Figura 2A, B). El nivel de expresión de Rad51 fue equivalente en WT y Sld5
+/- MEFs antes del tratamiento con etopósido. En WT MEFs, el nivel de Rad51 aumentó significativamente rápidamente después de la exposición a etopósido pero no tanto en Sld5
+/- MEFs, y disminuyó gradualmente a las 24, 48 h, casi volviendo a los valores basales a las 72 h. Por el contrario, la proteína Rad51 en Sld5
+/- MEFs aumentó más lentamente que en MEFs WT y se mantuvo durante un tiempo más largo. Esto sugiere que es necesario un plazo más largo para la reparación del ADN después de un extenso daño en el ADN en Sld5
+/- MEF. el tiempo de reparación de ADN prolongada en Sld5
+/- MEFs a su vez sugiere la restauración del ciclo celular retardada después de daño en el ADN. Por lo tanto, contamos el número de células viables después del tratamiento con etopósido como se describe anteriormente. La proliferación celular se determinó por el ensayo de exclusión de azul de tripano. No hubo diferencia significativa entre WT y Sld5
+/- proliferación MEF después de la exposición al control DMSO (Figura 3A), lo que sugiere que la expresión Sld5 reducido a la mitad en MEFs no afecta el crecimiento de células en sí. Por el contrario, tras la exposición a etopósido, Sld5
+/- MEFs muestra el crecimiento celular significativamente retrasados en comparación con WT MEFs (Figura 3B).
(A) análisis de transferencia de Western de la expresión de Rad51 en WT y Sld5
+/- MEF. β-actina fue el control interno. MEFs fueron tratados con etopósido durante 12 h (-12~0) y se lisaron en los tiempos indicados. (B) Evaluación cuantitativa de la expresión de Rad51 como se revela en (A) basado en el análisis densitométrico. Los resultados son factor de cambio en comparación con el nivel observado en WT MEFs antes del tratamiento con etopósido. Los datos representan la media ± SD *,
P
. & Lt; 0,05 (n = 3) guía empresas
MEFs fueron tratados con DMSO (A) o etopósido (B) como se indica en. la figura 2 y el mismo número de células vivas, como se indica se cultivaron con medio fresco durante 72 h. Las células se contaron en el momento indicado. Los datos representan la media ± SD. *,
P Hotel & lt; 0,05 (n = 3) guía empresas
daño del ADN es mayor en las células cancerosas mediante la atenuación de la expresión Sld5
En las células normales tales. como MEFs, el daño del ADN fue fuertemente inducidos por la atenuación de la expresión Sld5. Estamos próximos a prueba si las células cancerosas también muestran respuestas similares a etopósido cuando se le impidió la expresión Sld5. Con este fin, la expresión Sld5 fue derribado en células de melanoma B16 de ratón y células de cáncer de colon de ratón Colon26 mediante la transfección de siRNA (# 1 y#2) dirigidos contra Sld5 (siRNA B16 y siRNA Colon26). Se confirmó que la expresión Sld5 podría ser silenciado de manera eficiente por siRNA en células B16 y Colon26 pero no por el control revueltos siRNA (SCR B16 y SCR Colon26) (Figura 4A-D). El uso de estas células, se cuantificó el daño del ADN mediante la medición del nivel de γ-H2AX mediante inmunotransferencia de tipo Western. Después de mantenimiento en medio completo durante 48 h, las células se trataron con DMSO como control o 10 M etopósido durante 0,5 h. El nivel inicial de expresión γ-H2AX no fue alta, ya sea en SCR B16 o células B16 siRNA (Figura 5A, B). La exposición a etopósido condujo a un mayor nivel de γ-H2AX tanto en células SCR B16 y células siRNA B16, pero fue significativamente mayor en este último (Figura 5A, B). Del mismo modo, en las células Colon26, la atenuación de la expresión Sld5 mejora el daño del ADN por etopósido (Figura 5C, D). Tomados en conjunto, llegamos a la conclusión de que la expresión Sld5 se refiere al daño del ADN en las células normales y células cancerosas.
B16 o Colon26 células fueron transfectadas con el control negativo revueltos (SCR) o Sld5 siRNAs (# 1,#2) y se cosecha 48 h después de transfección. Sld5 niveles de expresión de proteínas en B16 (A, B) o Colon26 (C, D) se cuantificaron por transferencia Western. β-actina fue el control interno. Los datos fueron evaluados cuantitativamente en base al análisis densitométrico (B, D). Los resultados se representan como factor de cambio en comparación con el nivel observado en las células sin tratar siRNA-B16 (B) o Colon26 células (D), respectivamente. Los datos representan la media ± SD *,
P Hotel & lt;.. 0,05 (n = 3) guía empresas
El análisis de transferencia Western de la expresión γ-H2AX en SCR o Sld5 siRNA transfectadas-B16 células (A, B) o Colon26 (C, D) después del tratamiento con etopósido (ETO) o vehículo de control (DMSO). β-actina fue el control interno. Los datos fueron evaluados cuantitativamente en base al análisis densitométrico (B, D). Los resultados son factor de cambio en comparación con el nivel observado en células tratadas con siRNA SCR B16 (B) o Colon26 células (D), respectivamente. Los datos representan la media ± SD. *,
P Hotel & lt; 0,05 (n = 3) guía empresas
Atenuación de expresión Sld5 en las células cancerosas no retrase la restauración del ciclo celular después del daño en el ADN
. predijo que la atenuación de la expresión Sld5 retrasaría la reparación del ADN y la restauración del ciclo celular en células de cáncer como se observa en las células normales. Sin embargo, aunque el nivel de expresión Rad51 fue la misma en células SCR B16 y Sld5 siRNA B16, y en células SCR Colon26 y Sld5 siRNA Colon26 antes del tratamiento con etopósido, después, un rápido aumento de Rad51 se observó de manera similar en las cuatro líneas celulares ( la figura 6A-D). Correspondiente al daño en el ADN en las células marcadas siRNA B16 y siRNA Colon26, se observó alto nivel de expresión prolongada Rad51 en estas líneas. Por lo tanto, un período prolongado para la reparación del ADN era común a las células normales y células cancerosas, pero la respuesta rápida disminuido al daño del ADN que resulta de la atenuación de la expresión Sld5 en las células normales no se observó en las células cancerosas.
SCR o Sld5 siRNA transfectadas B16 (a, B) o Colon26 (C, D) las células se trataron con etopósido durante 12 h (-12~0). Las células se lisaron en los tiempos indicados. Se muestran los análisis de Western blot de la expresión de Rad51. β-actina fue el control interno. Los datos se evaluaron cuantitativamente basándose en el análisis densitométrico. Los resultados son factor de cambio en comparación con el nivel observado en SCR B16 (B) o SCR Colon26 (D) antes del tratamiento con etopósido. Los datos representan la media ± SD *,
P
. & Lt;. 0.05 (n = 3)
células cancerosas Para evaluar cómo la rápida respuesta al daño del ADN en Sld5 derribado afecta a la restauración del ciclo celular, enumeramos las células después del tratamiento con etopósido. La proliferación celular en sí mismo no se vio afectada por derribando Sld5 en las células o bien siRNA B16 o siRNA Colon26 en presencia de tratamiento de control DMSO (Figura 7A, C). Cuarenta y ocho horas después de daño en el ADN etopósido mediada, sólo había ligero retraso de la restauración del ciclo celular en ambos siRNA B16 y siRNA Colon26 relativa a la observada en SCR B16 y SCR Colon26. Sin embargo, después de 72 h, el crecimiento celular se indujo en células de cáncer silenciados-Sld5 a la misma medida que en los controles tanto en células B16 y Colon26 (Figura 7B, D). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que un extenso daño en el ADN resultante de la atenuación de la expresión Sld5 afecta gravemente a la restauración del ciclo celular en células normales pero no de cáncer.
SCR o Sld5 siRNA transfectadas B16 (A, B) o Colon26 (C, D células) fueron tratados con DMSO (a, C) o etopósido (B, D) como se indica en la Figura 6 y el mismo número de células vivas, como se indica se cultivaron con medio fresco durante 72 h. El número de células se registraron. Los datos representan la media ± SD *,
P
. & Lt; 0,05 (n = 3) guía empresas
Discusión
Se ha informado de que Sld5 forma una GINS. complejo con otros restos tales como PSF1, PSF2 y PSF3 y está implicado en la replicación del ADN en la levadura [5]. En el presente informe, se propone que Sld5 está implicado en el daño y reparación del ADN en células de mamífero. La atenuación de la expresión Sld5 dio lugar a daños en el ADN marcada por agentes promotores de ADN de doble filamento se rompe; esto era común para las células normales y células cancerosas. Se requirió un período más largo para la restauración del ciclo celular cuando el daño del ADN era extensa. Por esta respuesta, las células necesitan para mejorar la reparación del ADN. Cuando la expresión Sld5 se redujo en las células normales, la expresión de Rad51 se retrasó, lo que sugiere que Sld5 también está implicado en el ensamblaje de proteínas de reparación del ADN. Por el contrario, la rápida expresión Rad51 se indujo en las células cancerosas después de daño en el ADN y el retraso de la restauración del ciclo celular no fue tan grave como en las células normales. Funciones de los genes GINS en otros tipos de cánceres se han reportado [17], [26]. Por lo tanto, sugiere que la función de Sld5 en daño en el ADN y la reparación también se utiliza en otros tipos de células tumorales que las células de melanoma y cáncer de colon usados en nuestros experimentos. Se requieren más estudios para clarificar este
Como se describió anteriormente, el complejo GINS está implicada en la replicación del ADN.; sin embargo, los componentes GINS PSF1, PSF2, PSF3, y Sld5 no siempre formar complejos y puede tener otras funciones. Por ejemplo, PSF1 regula la organización de los microtúbulos en la fase M y está involucrada en la segregación cromosómica [20]. Recientemente, se ha informado de que las moléculas homólogas que asocian con la replicación del ADN en organismos inferiores también pueden regular eventos celulares distintos de la replicación del ADN [27] - [29]. Por lo tanto, es posible que Sld5, una molécula implicada en la replicación del ADN en la levadura, también está implicado en la reparación del daño en el ADN. Un informe anterior sugiere que se evite el daño del ADN cuando la cromatina se condensa con histonas [30]. Sin embargo, durante la replicación del ADN, ADN desnudo se disocia de la histona y se pone en peligro por los agentes que inducen el ADN de doble filamento se rompe. Cómo Sld5 protege de ADN de doble hebra se rompe hasta el momento no está claro, pero puede estar implicado en la modificación de histonas. Además se requiere un análisis preciso para dilucidar el mecanismo de la protección del daño en el ADN proporcionada por Sld5
.
Era de esperar que sería necesario un período de tiempo más largo para la reparación del ADN en las células con una peor daño del ADN como resultado de falta de Sld5. La hipótesis de que se indujo la expresión de Rad51 rápida en Sld5
+/- MEFs en comparación con WT MEFs para reparar el ADN dañado en gran medida. Sin embargo, se encontró Sld5 atenuación para retrasar la expresión de Rad51 en MEFs, lo que resulta en un severo retraso de la restauración del ciclo celular. Estos resultados sugirieron que Sld5 no sólo protege contra el daño de ADN, pero regula la rapidez de la reparación del ADN. Recientemente, se ha informado de que PSF2, también un miembro del complejo GINS, es fosforilada por ATM en cadena de ADN rotura [31]. Por lo tanto, es posible que PSF2 está implicado en la reparación del ADN también. Además, se ha informado de que los dominios N-terminales y C-terminales de Sld5 interactúan con el N-terminal y las regiones C-terminales de Psf2 en la estructura cristalina del complejo GINS humanos [32], y Sld5 se encontró para interactuar por dos híbridos con PSF2 en
Drosophila
[33]. Será interesante analizar las interacciones entre Sld5 y PSF2 fosforilada durante la reparación del ADN
.
Estudios recientes han demostrado que el crecimiento tumoral y la metástasis no están determinados por las células cancerosas por sí solas, sino también por diversas células del estroma. El estroma constituye una gran parte de la mayoría de los tumores sólidos, y la interacción de células de cáncer del estroma contribuye funcionalmente al crecimiento del tumor y la metástasis [34], [35]. estroma tumoral contiene muchos tipos diferentes de células, incluyendo fibroblastos asociados con el cáncer (CAF), pericitos, células endoteliales, células inmunes infiltradas. Entre ellos, los CAF son el principal tipo de células que juegan un papel crucial en la tumorigénesis y metástasis [36], [37]. Los resultados de nuestros experimentos han demostrado que la atenuación de los daños del ADN marcado Sld5 inducido y reprimido rápida restauración del ciclo celular en MEFs. Por lo tanto, predijimos que los inhibidores Sld5 podrían ser candidatos a fármacos contra el cáncer. Se encontró que en las células de cáncer, el daño del ADN está fuertemente inducida por el silenciamiento de la expresión Sld5, como se observa en MEFs; sin embargo, Rad51 aumentó rápidamente y la restauración del ciclo celular no se vio afectada en gran medida. Esto sugiere que las células cancerosas poseen la maquinaria de reparación del ADN adicional, independiente de Sld5, y de ese modo mantener la capacidad proliferativa. Silenciamiento de Sld5 en las células cancerosas, por lo tanto no puede ser eficaz como una estrategia para inhibir el crecimiento tumoral. Sin embargo, no sólo las células cancerosas, pero también tipos de células normales como las células endoteliales y los fibroblastos proliferan en el crecimiento apoyo microambiente tumoral del tumor como componentes de células del estroma [38] - [40]. angiogénesis de bloqueo ha demostrado ser una estrategia efectiva para inhibir el crecimiento tumoral y la metástasis [41]. Por lo tanto, silenciamiento de la expresión Sld5 o supresión de la función Sld5 por un compuesto pequeño o un análogo de nucleósido tales como microARN en células estromales tumorales pueden inhibir el desarrollo del microambiente del tumor y podría ser un enfoque prometedor para inhibir el crecimiento tumoral similar a la estrategia de tumor inhibiendo angiogénesis.
Reconocimientos
agradecemos a la Sra K. Fukuhara, Sra. Fujimoto para la asistencia técnica.