Extracto
Un medicamento seguro y eficaz del cáncer es necesaria debido a la creciente población de pacientes con cáncer cuya enfermedades en particular no puede ser curado por el tratamiento disponible actualmente . (ad) Los vectores adenovirales representan una medicina terapéutica prometedora para la terapia del cáncer humano. Sin embargo, se necesitan varias mejoras con el fin de vectores de Ad que sean agentes terapéuticos eficaces contra el cáncer, que incluyen, pero no se limitan a, la mejora de la captación celular, la actividad de la muerte celular del cáncer mejorada y la capacidad de visualización del vector y de seguimiento una vez inyectados en los pacientes . Con este fin, hemos intentado desarrollar un anuncio como una plataforma multifuncional que incorpora la orientación, formación de imágenes y motivos terapéuticos. En este estudio, hemos explorado la utilidad de esta plataforma propuesta mediante la generación de un vector de Ad que contiene el poli-lisina (pK), el virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) de la timidina quinasa (TK), y la proteína fluorescente roja monomérica ( mRFP1) como la focalización, destrucción de células tumorales, y los motivos de imagen, respectivamente. Nuestro estudio en el presente documento demuestra la generación del vector de Ad mosaico triple con pK, HSV-1 TK, y mRFP1 en los extremos carboxilo de Ad menor proteína de la cápside IX (PIX). Además, las funcionalidades de pK, HSV-1 TK, y las proteínas mRFP1 en el vector Ad se retuvieron como se confirma por los correspondientes ensayos funcionales, lo que indica el potencial de aplicación de múltiples funciones de este nuevo vector Ad para la terapia génica del cáncer. La validación de los vectores de anuncios de mosaico triples también argumenta a favor de la posibilidad de modificación de pIX como base para el desarrollo de vectores de Ad multifuncionales
Visto:. Tang Y, Wu H, Ugai H, Matthews QL, Curiel DT ( 2009) Derivación de un triple Adenovirus mosaico para la terapia génica del cáncer. PLoS ONE 4 (12): e8526. doi: 10.1371 /journal.pone.0008526
Editor: Maciej Lesniak, La Universidad de Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 4 de octubre de 2009; Aceptó 7 de diciembre de 2009; Publicado: Diciembre 31, 2009
Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la declaración Creative Commons Public Domain que estipula que, una vez colocado en el dominio público, este trabajo puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitirse, modificarse, construida sobre, o de otra forma utilizado por cualquier persona con cualquier objeto lícito
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención 5R01CA111569 (Dr. Curiel DT) y subvención juvenil Fundación de Investigación de Diabetes 1-2005-71 (Dr. H. Wu). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer sigue siendo la segunda causa principal de muerte en todo el mundo, y representó aproximadamente 7,9 millones de muertes (13% de todas las muertes) en 2007, según la Organización Mundial de la Salud (OMS, "los 10 principales causas de muerte") . La terapia génica representa un nuevo paradigma en el tratamiento de enfermedades humanas mediante la inserción de material genético en las células de los individuos con fines terapéuticos [1]. Entre todos los métodos de tratamiento para el cáncer, la terapia génica representa una medida molecular novedosa que tiene el potencial de la eficacia anti-tumor con selectividad y la seguridad [2].
Hasta la fecha, 65,2% de todos los ensayos clínicos de terapia génica se han dirigido cáncer [3]. Entre un número de estrategias de terapia génica del cáncer, sin embargo, muy pocos de ellos han demostrado un efecto terapéutico potente en pacientes humanos. Además de la complejidad y la ambigüedad de la tumorigénesis, otros obstáculos que puede explicar el fracaso de muchos aplicaciones de terapia génica del cáncer incluyen la eficacia de transducción baja de los agentes contra el cáncer y la incapacidad para transducir toda la población de células tumorales; la pobre selectividad y la falta de duración a largo plazo de los agentes anti-cáncer en los tumores que resultan en una pobre eficiencia terapéutica, así como problemas de seguridad. El concepto de célula tumoral de orientación direcciones estos obstáculos y puede representar una mejora importante en el desarrollo de la terapia génica como una terapéutica anti-cáncer. Dada una selección eficaz, este agente anti-cáncer no sólo puede lograr ejecuciones de células tumorales altamente selectivos y específicos, sino también evitar la absorción por las células normales y posterior toxicidad. Un
in vivo
modalidad de imagen, lo que proporciona un medio para estudiar la distribución (por ejemplo, la acumulación, extensión, retención y etc.) de la terapéutica contra el cáncer, puede abordar las cuestiones clave que son fundamentales para el diseño y prueba de nuevas terapias contra el cáncer, especialmente para los agentes terapéuticos basados en virus replicativos [4] - [7]. Para combinar estas funcionalidades, y en un esfuerzo para crear la terapéutica anti-cáncer más potentes y fiables, se intentó generar un vector adenoviral multifuncional (Ad) para la detección y tratamiento del cáncer. Este anuncio incorpora la orientación, formación de imágenes y modalidades terapéuticas contra el cáncer.
anuncios es uno de los vectores virales más comúnmente utilizados en numerosos ensayos clínicos de terapia génica contra el cáncer [3]. En estos estudios, el uso de vectores adenovirales de primera o segunda generación ha demostrado la expresión del transgén terapéutico, pero la eficacia clínica global ha sido pobre debido a las limitaciones antes mencionadas. Para superar las limitaciones, muchos esfuerzos se han centrado en la modificación de la cápside Ad en una base tipo de cáncer individual. Por ejemplo, la modificación de la cápside del anuncio con ligandos dirigidos contra antígenos tumorales impulsó la transducción de Ad en células tumorales
in vitro
y
in vivo
[8], [9]. Otros esfuerzos encaminados a la visualización de anuncios y seguimiento resultaron en el etiquetado de la cápside del anuncio con bioluminiscencia o fluorescencia. Esta estrategia permitió el seguimiento dinámico y directo de la ubicación física y la replicación de partículas virales
in vivo
[4], [10], [11]. Por otra parte, la incorporación de virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) de la timidina quinasa (TK) en la superficie de la cápside Ad permitido para la aplicación funcional directa de esta proteína en la terapia génica suicida y microPET de formación de imágenes [12].
Nuestro laboratorio y otros han validado el papel servicial de tipo Ad 5 menor proteína de la cápside IX (pIX) para la incorporación y la pantalla funcional de polipéptidos y proteínas heterólogas, tales como poli-lisina (pK) [13], proteínas de fluorescencia verde y roja (GFP y RFP) [4], [10], [11], o HSV-1 TK [12], [14]. Hemos demostrado además la posibilidad de crear un anuncio de mosaico de triple presentando tres epítopos heterólogos diferentes en lugares pIX en un único vector de Ad mediante modificaciones genéticas o no genéticos [15]. En este estudio, hemos explorado pIX para mostrar tres epítopos funcionales - PK (para la orientación), RFP monomérica (mRFP1) (para imágenes), y el HSV-1 TK (con fines terapéuticos) en un único vector de Ad en nuestro esfuerzo de generar anuncio multifuncional vectores.
Materiales y Métodos
Los anticuerpos
El anticuerpo pIX-específica fue una especie de regalo del Dr. I. Dmitriev (Centro de Terapia Genética de la Universidad de Alabama en Birmingham) . El anticuerpo anti-TK policlonal de conejo fue una especie de regalo del Dr. J. M. Mathis (Programa de Terapia Génica, Departamento de Biología Celular y Anatomía, Ciencias de la Salud LSU). El anticuerpo de ratón anti-His
6 monoclonal fue adquirido de Qiagen (Valencia, CA.). El policlonal de cabra anti-His
6 anticuerpo fue adquirido de Abcam (Cambridge, MA.). El anticuerpo monoclonal anti-Flag M2 y el anticuerpo anti-c-myc policlonal de conejo fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, MO.). El anticuerpo anti-RFP policlonal de conejo se adquirió de Chemicon (Temecula, CA.). Peroxidasa de rábano (HRP) conjugado de cabra anti-ratón y cabra anti-conejo anticuerpos secundarios, fosfatasa alcalina (AP) conjugado de cabra anti-ratón, anticuerpos secundarios de cabra anti-conejo, y microscopía electrónica (EM) de grado 18 oro- coloidal nm anticuerpo anti-cabra de burro conjugado se adquirieron de Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. (West Grove, PA.). EM grado 10 nm burro anti-ratón conjugado con oro, y EM grado 25 nm de oro conjugado con burro anti-conejo secundaria de anticuerpos fueron adquiridos de Microscopía Electrónica de Ciencia (EMS, Ft. Washington, PA.).
Las células
Las células humanas embrionarias de riñón (293), células de carcinoma de pulmón humano (A549), y las células de cáncer de mama humano (Au-565) fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA.). Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C en un 5% CO
2 incubador humidificado. Las células AU-565 se cultivaron en medio RPMI-1640 (2 mM L-glutamina, HEPES 10 mM, piruvato mM de sodio 1, 4,5 g /l de glucosa, 1,5 g /bicarbonato de sodio L, 100 unidades /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, 10% de suero bovino fetal). Todas las demás líneas celulares se cultivaron en medio F12 de Ham Eagle modificado de Dulbecco (50/50) medio (Sigma) que contiene suero de ternera fetal 10% (HighClone, Logan, Utah), 2 mM L-glutamina, 100 unidades /ml de penicilina, 100 g /ml de estreptomicina.
Construcción de plásmidos recombinantes
Generación de plásmidos lanzadera. Todos los plásmidos parentales fueron adquiridos de fuentes comerciales o se han caracterizado previamente: pShlpIXNhe [13], pShuttle-IX-mRFP1 [4], pShuttle-IX-bandera-sr39tk [12], pShuttle-CMV y pAdEasy-1 (Stratagene, La Jolla, CA). Los plásmidos lanzadera se construyeron utilizando la restricción y la clonación de PCR de la siguiente manera. pShldpIX = pShlpIXNhe /BglII /NheI /roma /SL (auto ligadura); El producto de PCR (pcrIXpK) que contiene la secuencia de codificación de proteína de fusión pIX-pK fue generado mediante el uso de pShlpIXNhe como plantilla y los cebadores 5 'y 5'-GGGGTACCGGGCGTGGTTAAGGGTG GGGGTACCTTTATTTATGTTCTTGTCATCGTCATCCTTATAATC; pShlpIXflagpK = pShldpIX /KpnI + pcrIXpK /KpnI. El producto de PCR (pcrH6TK) que contiene la secuencia de codificación de la proteína H6-sr39tk fue generado mediante el uso de pShuttle-IX-flag-sr39tk como plantilla y los cebadores 5'-CTAGCTAGCCACCATCACCATCACCAT CTAGCCGGATCCGGTTC y 5'-CTAGCTAGCTCAATTAGCCTCCCCCATC; pShlpIXH6TK = pShlpIXNhe /NheI + pcrH6TK /NheI. El producto de PCR (pcrMycmRFP1) que contiene la secuencia de codificación de la proteína c-myc-mRFP1 fue generado mediante el uso de pShuttle-IX-mRFP1 como plantilla y los cebadores 5 'CTAGCTAGCGGCGG AGGGAGCGAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAAGATCTGGGAAGCGCCTCCTCCGAGGACGTCAT y 5'-CTAGCTAGCTTAGGCGCCGGTGGAGTG; pShlpIXmycmRFP1 = pShlpIXNhe /NheI + pcrMycmRFP1 /NheI. Todos los clones se verificaron mediante digestión de restricción y secuenciación.
Generación de genomas adenovirales modificados pIX por recombinación homóloga en
Escherichia coli
[16]. El servicio de transporte vectores pShlpIXflagpK, pShlpIXH6TK, y pShlpIXmycmRFP1 se linealizó con la enzima de restricción PmeI y recombinado de forma homóloga con pAdEasy-1 en electrocompetentes BJ5183-AD1 (Stratagene, La Jolla, CA). El genoma adenoviral generado contiene IX-pK, IX-sr39tk, o IX-mRFP1 modificados gen pIX en la región E1 eliminada. Las construcciones de plásmidos resultantes Ad pAdpIXflagpK, pAdpIXH6TK, y pAdpIXmycmRFP1 se confirmaron mediante digestión de restricción y secuenciación.
Rescate de virus, Propagación y purificación
pAdpIXflagpK, fueron linealizados pAdpIXH6TK, y plásmidos pAdpIXmycmRFP1 con la enzima de restricción PacI y se transfectaron en células 293 cultivadas en 25 cm
2 matraces usando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células se recogieron cuando se observó efecto citopático evidente (CPE) seguido de interrupción por medio de cuatro ciclos de congelación y descongelación. Los lisados se centrifugaron a 3000 xg durante 5 min a 4 ° C para eliminar los desechos celulares. Los virus liberados en el sobrenadante fueron posteriormente utilizados para la propagación adicional hasta que se infectaron una cantidad suficiente de células 293 (diez por 175 cm
2 frascos). El anuncio en las células infectadas se purificaron esencialmente como se describe anteriormente [15]. En breve, las células se lisaron mediante cuatro ciclos de congelación y descongelación y se centrifugaron a 3800 xg durante 30 min a 4 ° C para eliminar los desechos celulares. Los extractos celulares que contienen los virus se carga en la parte superior de un gradiente de CsCl paso 1,33 /1,45 y se centrifugaron a 55.000 x g durante 3 horas a 4 ° C. La banda inferior, que contiene partículas de virus infecciosas, se volvió a centrifugar en otro 1,33 /1,45 CsCl gradiente paso a 100.000 xg durante la noche a 4 ° C. Se recogió la banda resultante de adenovirus y se dializó cuatro veces contra 500 ml de tampón fosfato salino (PBS) que contiene 10% de glicerol, 2 horas cada vez. Los anuncios generados fueron designados como Ad-IX-bandera-pK, Ad-IX-H6-sr39tk, y Ad-IX-myc-mRFP1. partículas virales (VP) Los títulos se determinaron por espectrofotometría a DO260 utilizando procedimientos estándar [17].
Ad Generación de Triple-pIX Modificado por el Co-Infección
Ten-175 cm
2 frascos de 293 células fueron infectadas con Ad-IX-bandera-pK, Ad-IX-H6-sr39tk, y Ad-IX-myc-mRFP1 a una MOI total de 200-300 VP /célula. Se recogieron las células infectadas para la purificación como se describe en Ad anteriormente.
Electroforesis de proteínas e inmunotransferencia de tipo Western
5 × 10
9 VP de virus purificados se hirvieron en tampón de muestra Laemmli durante 5 min y se separaron en 4 a 15% de dodecil de sodio gradiente de electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Las proteínas separadas se transfirieron entonces a difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas, que fueron bloqueadas en el 5% de leche desnatada en solución salina tamponada con Tris que contiene 0,05% de Tween-20 (TBS-T) seguido de incubación con anticuerpos primarios (de ratón anti-Flag, 1 :1000; conejo anti-TK, 1:500; conejo anti-RFP, 1:500). Después de lavar y re-bloqueo, la membrana se incubó con los anticuerpos secundarios apropiados conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) a una dilución 1:1000. La señal de HRP se desarrolló con ECL plus occidental sistema de detección de transferencia (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido), y luego se detectó con películas BioMax RM científica (Kodak, Chalon-sur-Saone, Francia) y un procesador de películas médicas SRX-101A (Konica, Tokio, Japón).
ELISA
en fase sólida pruebas de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) de unión se realizaron esencialmente como se describe anteriormente [18]. Brevemente, 10
9 VP de los virus fueron sometidos a dilución en serie (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128) en 100 l de tampón carbonato 100 mM (pH 9,5), y se inmovilizan por triplicado en una placa de 96 pocillos (Nunc Maxisorp) por incubación durante la noche a 4 ° C. Después de 4 lavados con TBS-T y el bloqueo con TBS-T que contiene 2% de albúmina de suero bovino (BSA), los virus se sondearon con el anticuerpo primario, y anticuerpos secundarios a continuación, AP-conjugados en TBS-T que contiene 0,5% de BSA a temperatura ambiente durante 2 horas, con un amplio lavados y el bloqueo en el medio.
se utilizó fosfato de p-nitrofenil
(Sigma) para desarrollo del color como se describe por el fabricante, y absorbancia de la luz (405 nm) se obtuvo por un lector de microplacas (PowerWave HT 340, BioTek, Winooski, VT). Después de la incubación durante 150 minutos a temperatura ambiente.
microscopía inmunoelectrónica
inmunoelectrónica microscopía se realizó esencialmente como se describe anteriormente [15]. En resumen, los virus se adhirieron a rejillas de níquel 400 de malla compatibles con la película de Formvar revestida de carbono (EMS). Después de lavar con 1% de BSA /PBS dos veces durante 10 minutos cada una, las rejillas se probaron con 1% de BSA /PBS diluido anticuerpos primarios (1:200 M2 anti-Flag, cabra anti-His
6, y de conejo anti-c- myc) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de 2 ciclos de 1% de BSA /PBS lavados, las rejillas se incubaron con anticuerpos secundarios diluidos 1:10 (10 nm de oro-burro anti-ratón, 18 nm de oro-burro anti-cabra, y 25 nm de oro-burro anti-conejo) a temperatura ambiente durante 45 min. Después de la fijación con glutaraldehído al 1% /PBS durante 20 min, las rejillas se sometieron a tinción negativa en acetato de uranilo al 2% durante 12 segundos y se examina bajo el microscopio electrónico de transmisión a 60 KV en el Fondo UAB Imágenes de Alta Resolución.
Cell ensayo de inhibición de unión
El ensayo de inhibición de unión se realizó esencialmente como se describe anteriormente [13]. AU-565 células se liberaron de los matraces utilizando Versene, se lavaron una vez con PBS, y se sedimentaron y se resuspendieron a 0,5 x 10
7 células /ml en tampón de unión (DMEM /F12 con 1% de BSA). Alícuotas de 100 l de células se transfirieron a cada tubo de ensayo de 5 ml, y se añadieron con 50 l de un inhibidor (CAR soluble (SCAR), heparina, o PBS). Después de 30 min de agitación a 4 ° C, se añadieron los virus a una multiplicidad de infección (MOI) de 500 VP /célula en 50 l de tampón de unión en cada tubo, y se agitaron a 4 ° C durante 1,5 horas. Las células se lavaron una vez con 4 ml de tampón de unión, y se extrajo y se sometieron a cuantitativa en tiempo real PCR (TaqMan) para medir el número de copias Ad5 E4 su ADN total. El ADN total en cada muestra se cuantificó por OD260.
Cell Killing Ensayo
La muerte celular ensayo se realizó esencialmente como se describe anteriormente [12]. Las células A549 de carcinoma de pulmón se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 10.000 células /pocillo un día antes de la infección con Ad. vectores de Ad que transportan proteínas de fusión pIX-TK en diferentes MOIs se utilizaron para infectar las células A549. Después se añadieron 2 horas o 12 horas de incubación, el profármaco, ganciclovir (GCV) (GYTOVENE-IV, Roche Laboratories, Nutley, NJ), a las células a una concentración final de 1 mM. Después de 24 o 48 horas de incubación, se evaluó la viabilidad de las células A549 utilizando CellTiter 96® AQ
kit ensayo de proliferación celular no radiactivo ueous (Promega, Madison, WI) y un lector de microplacas (PowerWave HT 340, BioTek, Winooski , VT), de conformidad con la instrucción de las fábricas.
análisis estadístico
el análisis estadístico se realizó utilizando
t-pruebas
entre grupos de dos colas de Student no pareada.
P
valores. & Lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos
Resultados
Generación de un anuncio de modificación Triple-Pix por el Co-Infección
Con el fin de generar el triple de Ad modificado-pIX llevar a poli-lisina (pK), HSV-1 timidina quinasa mutante (HSV-1 sr39tk), y monomérico proteína fluorescente roja (mRFP1) por co-infección, tres virus parentales se generaron primero: Ad- IX-Flag-pK, Ad-IX-H6-TK, y Ad-IX-myc-mRFP1. Estos tres virus expresan PIX-pK, pIX-TK, o PIX-mRFP1 proteína de fusión con la bandera, Su
6, o una etiqueta c-myc, respectivamente (fig. 1A). Salvo que se especifique, todos los virus utilizados en el estudio son incompetente para la replicación (E1 /E3 suprimido), y la transcripción de genes pIX modificados en cada virus parental fue impulsada por el promotor de pIX endógeno. Además, pIX-modificado anuncios sólo expresar la proteína de fusión pIX ya que los genes pIX nativos se han reemplazado por los genes pIX modificados. Los tres virus parentales fueron utilizados para co-infectar a las células 293 que soportan la replicación de AD para generar el virus modificado de triple-Pix. Dado que las tres proteínas de fusión diferentes de pIX fueron expresadas y podrían ser ensamblados en cada partícula viral, se esperaba que los viriones resultantes para contener una mezcla de tres tipos de proteínas de fusión pIX (Fig. 1B). Las progenies de anuncios generado y purificadas con CsCl (designado como coAdpIXPTM#1) tenían un rendimiento normal, comparado con solo Anuncios modificados pIX en nuestro laboratorio (datos no mostrados). La incorporación de proteínas de fusión de pIX se analizó por Western Blot con anti-Flag, anti-RFP, y los anticuerpos anti-TK. La detección de pIX bandas de proteínas de fusión con masas moleculares esperadas confirmó que tres proteínas de fusión de pIX (es decir, PIX-PK, PIX-TK, y PIX-mRFP1) estaban contenidos en las partículas virales de la piscina vírica purificada (Fig. 1C).
(A) las construcciones de los genes pIX modificados en los genomas de tres virus parentales: Ad-IX-Flag-pK, Ad-IX-H6-TK, y Ad-IX-myc-mRFP1. genes pIX modificados (etiquetados con la bandera, Su
6, y c-myc, respectivamente) fueron impulsados por el promotor de pIX nativa. (B) diagrama estructural de Triple modificada-pIX Ad (coAdpIXPTM#1) generado por la estrategia de co-infección. pK, TK, y péptidos mRFP1 /proteínas fueron incorporados en los extremos C de pIX. (C) Análisis Western Blot de vector de Ad contiene modificaciones triples pIX. 5 × 10
9 VPs de control de purificado con CsCl Ad5 (carril 1) y la triple pIX-modificado coAdpIXPTM#1 (carril 2) se sometieron a SDS-PAGE. Las proteínas separadas se tiñeron con azul GelCode (Pierce, Rockford, IL.) Para detectar las proteínas virales totales (panel izquierdo) o sondado con anti-Flag, anti-RFP, o anticuerpo anti-TK (panel derecho).
Pantalla de superficie de pixs modificados en Ad partículas
para probar si o no los polipéptidos /proteínas incorporadas en el C-terminal de pIX se presentan en la superficie viral y accesibles a los anticuerpos, se realizó Los ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA). En el experimento de ELISA, anti-Flag, anti-anticuerpos Sus
6, y anti-c-myc se utilizaron para detectar los tres tipos de pixs modificados. El control Ad5 de tipo salvaje que contienen pIX no fue reconocido por cualquiera de estos anticuerpos. Los virus coAdpIXPTM#1 fueron reconocidos por anti-Flag, y los anticuerpos anti-c-myc (Fig. 2). Sin embargo, los virus no pueden ser reconocidas por anticuerpos anti-His
6 anticuerpo (Fig. 2) Anti-TK anticuerpo o (datos no mostrados). Este resultado sugiere que el pK y mRFP1 se incorporaron en los triples vectores de Ad modificados-pIX. El insignificante de unión de anticuerpos anti-His
6 o anti-TK de anticuerpos a los virus indica que los conocimientos tradicionales o bien no fue eficientemente superficie expuesta de las cápsides virales o la accesibilidad de estos dos anticuerpos a las proteínas de TK en una configuración de este tipo era insuficiente para ser detectado en ELISA.
análisis
ELISA del vector Ad que contiene modificaciones triples pIX. 10
9 VPs de Ad5 purificado con CsCl (control negativo) o coAdpIXPTM#1 se sometieron a una dilución en serie (1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1 /64, 1/128) e inmovilizado en una placa de ELISA. Los virus se sondaron con anti-Flag (1:2000), anti-His
6 (1:1000), y los anticuerpos anti-c-myc (1:1000), seguido de incubación con anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina (1:1000). Después del desarrollo de color, se midió la absorbancia de la luz y se representa en el eje Y frente a las concentraciones virales. Cada punto representa la media y la desviación estándar (SD) de determinaciones por triplicado. Algunas barras de error de pie para SD son más pequeños que sus símbolos.
El mosaicismo de la Triple PIX-Modificado
del anuncio
Western Blot y análisis de ELISA de las partículas virales purificadas demostraron que tres tipos de proteínas de fusión de pIX se incorporaron a las partículas de anuncios producidos por co-infección (Fig. 1). Para examinar si una partícula viral solo anuncio podría mostrar los tres tipos de proteínas funcionales, se realizó microscopía electrónica por inmunomarcaje para visualizar directamente las partículas modificadas Ad-Pix. Anti-Flag, anti-Su anticuerpos
6 y anti-c-myc se utilizaron para detectar PIX-pK, PIX-conocimientos tradicionales y las proteínas PIX-mRFP1 en las partículas virales, respectivamente, seguido de tres correspondientes anticuerpos secundarios conjugados con 10 , 18, y 25 partículas de oro nm, respectivamente. Como se muestra en la Figura 3, ninguna partícula de oro fue enlazado al control Ad5 presentan tipo salvaje pIX, mientras que las partículas virales de anuncios que contiene una única proteína de fusión pIX (Ad-IX-Flag-pK, Ad-IX-H6-TK, y Ad IX--myc-mRFP1) se tiñeron por partículas de oro correspondiente. Los virus modificados triples coAdpIXPTM#1 fueron reconocidos por anti-Flag, anti-His
6 y los anticuerpos anti-c-myc y se marcaron con 10, 18 y 25 partículas nm de oro. Los resultados demostraron que tres tipos de proteínas de fusión de pIX podían coexistir en una partícula viral simple y se expone en la superficie viral.
control o vectores de Ad modificados pIX se cargaron en redes de EM, se sondaron con anticuerpos conjugados nanopartícula de oro , y se observó bajo el microscopio de electrones a 60 KV. Mouse anti-Flag, cabra anti-His
6, y conejo anticuerpos primarios anti-c-myc se utilizaron para detectar tres tipos de etiquetas de pK, HSV-1 TK, y mRFP1, respectivamente. 10 nm de oro-burro anti-ratón, 18 nm de oro-burro anti-cabra, y 25 nm de oro-burro anti-conejo secundaria de anticuerpos fueron utilizados para la rotulación posterior de oro de las partículas de anuncios. flechas delgadas continuas indican partículas de oro de 10 nm, flechas vacías indican partículas de 18 nm de oro, y las flechas continuas gruesas indican partículas 25 nm de oro. La barra de escala en cada panel representa 50 nm de longitud.
Es de destacar que, si bien existen 240 copias de moléculas de pIX en cada partícula viral, sólo unas pocas partículas anticuerpos conjugados con oro hayan sido consolidadas sobre las partículas virales Ad pIX-modificado. Estos datos son coherentes con los informes anteriores [15], [19], [20]. Esto es probablemente debido a la baja accesibilidad relativa de pIX de la superficie de la cápside [20] - [22] y el efecto obstáculo espacial de partículas de oro de anticuerpo conjugado con uno contra el otro durante la tinción. Elegimos partículas de oro grandes para la diferenciación más fácil entre los tres epítopos, que tienen incluso una mayor proporción de anticuerpo /oro y un efecto de estorbo espacial más alta que la de las partículas de oro pequeñas que se utilizan comúnmente. Además, anti-His
6 anticuerpo no se une de manera eficiente pIX-TK como se muestra en la Figura 2. Además, la baja eficiencia de triple tinción puede ser otra razón del patrón de tinción dispersa muestra en la Figura 3. Por lo tanto, es no es sorprendente que la frecuencia de anuncios etiquetados triplemente es baja -. sólo alrededor del 1% de partículas virales se tiñeron con los tres tipos de partículas de oro (Tabla 1) guía empresas
Orientación Actividad del Incorporated poli-lisina en la Triple pIX mosaico
del anuncio
Ad5 se ha demostrado para unirse a su receptor celular primaria, el virus coxsackie B y el receptor de adenovirus (CAR), como el paso inicial de la infección a través de su proteína mando de la fibra [23]. La poli-lisina (pK) incorporado en locales de pIX en AdLucIXpK se ha demostrado para mediar la interacción con Ad proteoglicanos heparán sulfato celulares (HSPGs), resultando en CAR-independiente de unión de células y la transducción de virus [13]. Por lo tanto, con el fin de examinar si los péptidos de pK incorporados en la triple pIX mosaico vector Ad tuvieron actividad orientación similar a HSPG, se realizó la unión celular y ensayos de inhibición con (bajo nivel de CAR) CAR deficientes en células AU-565 en presencia o ausencia de heparina o proteína soluble CAR (SCAR)
Otra versión de la triple vector de Ad-pix modificado fue creada usando tres parentales virus modificados-pix previamente caracterizados:. AdLucIXpK [13], Ad-dE1-IX- sr39tk [12], y Ad-IX-mRFP1 [4] (etiquetas Flag estaban presentes en las tres proteínas de fusión de pIX). La incorporación de PIX-pK, pIX-TK, y las proteínas PIX-mRFP1 en el anuncio de mosaico derivado de triple (designado como coAdpIXPTM#2) fue verificada por Western Blot en los virus purificados utilizando anti-Flag, anti-RFP y anti anticuerpos TK (figura 4C).
(A) las construcciones de los genes pIX modificados en los genomas de tres virus parentales:. AdLucIXpK, Ad-dE1-IX-sr39tk, y Ad-IX-mRFP1. genes pIX modificados (etiquetados con la Bandera) fueron impulsados por el promotor de pIX nativa. (B) diagrama estructural de Triple modificada-pIX Ad (coAdpIXPTM 2 #) generado por la estrategia de co-infección. (C) 5 × 10
9 VPs de control de purificado con CsCl Ad5 (carril 1) y la triple pIX-modificado coAdpIXPTM#2 (carril 2) se sometieron a SDS-PAGE. Las proteínas separadas se tiñeron con azul GelCode (a la izquierda) o probaron con anti-Flag, anti-RFP, o anticuerpo anti-TK. Se incluyó una larga exposición de la mancha anti-bandera para mostrar la proteína pIX-pK, que se incorpora en partículas anuncio de un nivel muy bajo. El "*" asteriscos indican productos de degradación de proteína de fusión pIX-mRFP1.
Se observó que la AdLucIXpK control positivo, en el que todas las moléculas de pIX se modificaron por pK, exhibido tanto como dos veces de unión celular en las células AU-565 CAR deficientes en comparación con el tipo salvaje Ad5. La triple mosaico Ad5 (coAdpIXPTM#2), en el que sólo una parte de las moléculas de pIX modificación contenida pK, mostró actividad de unión de aproximadamente 1,5 a tiempo mayor de células en comparación con el tipo salvaje de Ad5 (Fig. 5). Además, más de 90 células% capacidad de AdLucIXpK y 50% de la coAdpIXPTM#2 de unión se inhibe por la heparina libre a una concentración final de 500 ug /ml, mientras que la unión de la célula del control Ad5 no se vio afectada significativamente (Fig. 5). La adición de 200 mg /ml cicatriz inhibe la unión de más de 80% de control de células Ad5, mientras que tiene un efecto relativamente modesto sobre AdLucIXpK (60%) y coAdpIXPTM#2 (25%) (Fig. 5). En conjunto, nuestros datos sugieren que los péptidos de pK muestran en coAdpIXPTM#2 cápsides podrían mediar célula CAR-independiente de orientación a través de la interacción con los receptores celulares de heparán sulfato.
AU-565 células se incubaron con Ad5, AdLucIXpK, o coAdpIXPTM#2 en una MOI de 500 VP /célula en presencia de 500 mg /ml de heparina o proteína de la cicatriz /ml a 200 mg a 4 ° C. partículas Ad unidos se cuantificaron por cuantitativa en tiempo real PCR y normalizado con el ADN celular total. Cada barra representa la media y la desviación estándar de las determinaciones por triplicado, y los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos especificados.
Actividad enzimática de los conocimientos tradicionales sobre el Triple Incorporated pIX Mosaico
del anuncio de la proteína CT
HSV-1 se pueden incorporar genéticamente en Ad en locales pIX con su actividad enzimática nativa retenido, que puede ser utilizado para la terapia génica del cáncer con profármaco ganciclovir (GCV), y puede ser utilizado para
vitro
en y
in vivo
de imagen cuando se combina con el sistema de microPET [12], [14]. Para investigar si las proteínas de fusión PIX-CT podrá funcionar normalmente, se evaluó la citotoxicidad inducida por los conocimientos tradicionales en presencia de GCV a una concentración farmacológica mediante el ensayo de MTS. Para evaluar la proteína de fusión pIX-TK lanzado directamente a partir de partículas anuncio después con éxito la entrada celular, se utilizaron células A549 de carcinoma de pulmón, en el que la replicación de Ad no replicativo y la expresión del gen pIX son mínimos. A549 células fueron infectadas con Ad-Pix modificado sola (Ad-dE1-IX-sr39tk) o triple pIX mosaico anuncio (coAdpIXPTM#2) a distintas MOI. GCV se añadió en las células infectadas dos horas después de la infección, y la muerte celular mediada por la proteína de fusión pIX-TK se evaluó mediante el ensayo de MTS 24 horas a partir de entonces. Los datos sugieren que hubo una significativa citotoxicidad GCV-asociado inducida por cualquiera de las Ad-dE1-IX-sr39tk o coAdpIXPTM infección#2 a una alta MOI (10000 VP /célula) (Fig. 6A). Sin embargo, a una MOI baja (5000 VPS /célula), sólo el Ad-dE1-IX-sr39tk infección mostraron GCV-indujo citotoxicidad significativa. Esto indicaba que la actividad PIX-CT en la triple Ad-Pix modificado fue menor que la de Ad modificado-Pix-TK única, que puede ser atribuible a las diferencias de número de copias de pIX-TK incorporados en las partículas virales.
Las células A549
(a) fueron infectadas con Ad5 (control negativo), Ad-dE1-IX-sr39tk, o coAdpIXPTM#2 en varias MOI. 2 horas más tarde, se añadió GCV profármaco en las células con la concentración final en 1 mM. 24 horas después, la actividad de destrucción celular inducida por GCV convertida mediada a través de pIX-TK se evaluó mediante el ensayo de MTS. Las células infectadas con virus se normalizaron con el de células no infectadas como la supervivencia celular relativa. (B) las células A549 fueron infectadas con Ad-sola dE1-IX-sr39tk modificada-Pix o coAdpIXPTM#2 en varias MOI. 12 horas más tarde, se añadió GCV en las células a la concentración final de 1 mM. 48 horas después, la actividad de destrucción celular de TK /GCV se evaluó como mismo que el descrito anteriormente.