infección epitelio-mesenquimal
Extracto
Antecedentes
(VHC) y la cirrosis hepática asociada representan un factor de riesgo importante para el desarrollo de carcinoma hepatocelular (HCC). TGF-β es un importante motor de la fibrogénesis hepática y cáncer; Sin embargo, su impacto real en la progresión del cáncer humano aún es poco conocido. El objetivo de este estudio fue investigar el papel de las variantes naturales de núcleo de HCV derivada de HCC en la progresión del cáncer a través de su impacto en la señalización de TGF-β.
Principales conclusiones
Nos proporcionan evidencia de que HCC- la expresión de la proteína del núcleo derivado en hepatocitos humanos o de ratón primaria alivia las respuestas de TGF-ß en términos o la inhibición del crecimiento o apoptosis. En lugar de ello, en estos hepatocitos TGF-β todavía era capaz de inducir una transición epitelial a mesenquimal (EMT), un proceso que contribuye a la promoción de la invasión de células y la metástasis. Por otra parte, se demuestra que los diferentes umbrales de activación Smad3 dictan las respuestas de TGF-β en las células hepáticas y que la proteína del núcleo de VHC, por la disminución de la activación Smad3, puede cambiar de crecimiento TGF-β efectos inhibidores de respuestas promotores de tumores.
Conclusión /Importancia
Nuestros datos ilustran la capacidad de los hepatocitos para desarrollar la EMT y la plasticidad en virtud de TGF-β, hacen hincapié en el papel de la proteína del núcleo de VHC en la dinámica de estos efectos y proporcionan evidencia de un paradigma por el cual una proteína viral implicada en oncogénesis es capaz de cambiar las respuestas de TGF-β de los efectos citostáticos a EMT desarrollo
Visto:. S Battaglia, Benzoubir N, S Nobilet, Charneau P, Samuel D, Zignego aL, et al. (2009) de origen del cáncer de hígado virus de la hepatitis C Core proteínas Shift Respuestas TGF-beta a partir de la supresión tumoral para la transición epitelio-mesenquimal. PLoS ONE 4 (2): e4355. doi: 10.1371 /journal.pone.0004355
Editor: Mauricio Rojas, Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Julio, 2008; Aceptado: 18 de diciembre de 2008; Publicado: 3 Febrero 2009
Derechos de Autor © 2009 Battaglia et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el INSERM, Asociación para la Investigación sobre el cáncer (ARC), Agencia Nacional de Investigación sobre el Sida (ANRS) y la Comunidad Europea (Virgilio). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
transición epitelial a mesenquimal (EMT) se define como un proceso en el que las células epiteliales pierden su característica fenotípica y adquieren características de las células mesenquimales. Mientras EMT está involucrado en el contexto del desarrollo embrionario que también desempeña un papel en la génesis de los fibroblastos durante la fibrosis de órganos en tejidos adultos y podría contribuir al desarrollo de carcinoma metastásico [1]. De hecho, la EMT está siendo cada vez más reconocido como un paso crucial que promueve la migración celular, invasión tumoral y la metástasis [2], y también se ha implicado recientemente en la emergencia de células madre del cáncer [3]. En el hígado, las células estrelladas hepáticas (HCS) son considerados como las principales células precursoras fibróticas que transdifferentiate a la producción de la matriz extracelular miofibroblastos fibrogénicos, en el tejido hepático inflamatoria en la señalización de TGF-β, mientras que los hepatocitos experimentan apoptosis en la señalización de esta citocina. Sin embargo, la identificación de las diferentes poblaciones fibrogénicos, aparte de las células estrelladas residentes [4], así como los resultados convergentes de estudios recientes han cuestionado el paradigma de HSC como la fuente esencial de miofibroblastos hepáticos y inferido un papel destacado para los hepatocitos en la fibrogénesis hepática. De hecho, se ha informado recientemente de que la rata o el ratón hepatocitos responden tanto
in vitro
y
in vivo
a TGF-β no sólo en términos de inhibición del crecimiento celular y la apoptosis, sino también en términos de la inducción de EMT [5] - [7]. En consecuencia, se ha demostrado que el TGF-β y laminina 5 se transforman células de carcinoma hepatocelular no invasivos en células invasoras a través de la inducción de una completa EMT [8]. Sin embargo, aunque los mecanismos moleculares que subyacen en el desarrollo de EMT han sido ampliamente estudiados, existe poca evidencia disponible en relación con sus funciones fisiológicas y relevancia en patologías humanas.
Uno de los mecanismos por los cuales las células se someten a la transformación neoplásica y se escapan de la normalidad implica el control del crecimiento una respuesta alterada a los efectos citostáticos de TGF-β [9], [10]. Además, durante las últimas etapas de la tumorigénesis, TGF-β puede estimular la invasión principalmente a través de la inducción de EMT. Ahora es generalmente aceptado que el TGF-β tiene un doble papel en la oncogénesis y puede actuar como un supresor de tumores o factor promotor de tumores en función del contexto celular [11], [12], pero los mecanismos implicados en el interruptor de las respuestas de TGF-ß hacia la malignidad no se entienden completamente.
In vivo
, se ha demostrado que la pérdida de TGF-β señalización disminuyó significativamente la latencia del tumor y el aumento de la tasa de metástasis en varios modelos de ratones [13].
TGF-β inician respuestas contacto con dos tipos de serina trans-membrana /treonina quinasas denominadas receptores de tipo I y de tipo II, la promoción de la activación de la de tipo I por el tipo II quinasa. El receptor de tipo I activado luego se propaga la señal al núcleo mediante la fosforilación de Smad2 y Smad3. , Smad2 y Smad3 asociado Una vez fosforilada con el socio compartido Smad4 y los complejos se acumulan en el núcleo, donde regulan la expresión de los genes diana TGF-β a través de interacciones de cooperación con socios transcripcional [14], [15], [16]. La interrupción de la señalización de TGF-β, ya sea a través de la inactivación mutacional de los componentes de la vía de señalización, o por la modulación de su expresión o función, ahora se sabe que juega un papel importante en la progresión del tumor. A pesar de todas estas evidencias, la implicación clínica del TGF-β en la progresión de la metástasis sigue siendo poco clara.
virus de la hepatitis crónica C (VHC) y cirrosis hepática asociada representan un factor de riesgo importante para el desarrollo de carcinoma hepatocelular (HCC), y a pesar de la evidencia epidemiológica que conecta la infección por VHC en HCC, el impacto clínico de este virus en hepatocarcinogénesis todavía no está claro [17]. Debido a que el ARN del VHC muestra una alta variabilidad genética, la infección crónica por el VHC en una población compleja de diferentes pero estrechamente relacionados variantes virales comúnmente se conoce como quasiespecies [18], [19]. La distribución no aleatoria de cuasiespecies del VHC se ha observado entre el hígado tumoral y no tumoral que sugiere la posibilidad de una selección de cuasiespecies con propiedades funcionales modificados que podrían contribuir al desarrollo de la fibrosis, así como proceso de tumorigénesis [20].
El componente estructural del VHC, proteína del núcleo de VHC ha atraído una atención especial después de su caracterización y varios informes han sugerido su posible papel en la patogénesis del VHC. En efecto, además de su papel en el empaquetamiento del ARN viral, la proteína del núcleo de VHC se ha informado de interactuar con varias proteínas celulares, tales como TNFR [21], PKR [22], Stat3 PRB o p53 [23] conduce a la modulación de la transcripción de genes dependientes de estas cascadas y en consecuencia a la modulación de una serie de funciones de regulación celular. De hecho, numerosos datos han sugerido una posible participación de la proteína del núcleo de VHC en la modulación de la proliferación celular y la apoptosis, aunque se han controversial dado algunos resultados que la proteína de núcleo se ha informado que exhiben efectos pro o antiapoptóticas en función del sistema experimental utilizado [24] , [25]. Además, estos estudios se realizaron principalmente el uso de agentes apoptóticos de la familia de TNF y no con TGF-β. Esta discrepancia también podría ser debido a la heterogeneidad genética de los diferentes genotipos del VHC.
Nosotros y otros han demostrado previamente una interacción entre la proteína Smad3 y del núcleo de VHC [26], [27]. Curiosamente, también se observó que los diferentes núcleo natural de variantes aisladas de nódulos no tumorales del tumor o de otra manera podrían unirse Smad3, y por lo tanto inhibir la inducida por la actividad transcripcional Smad3 TGF-β sugiriendo que la proteína del núcleo de VHC puede modular la señalización de TGF-β y sus posteriores respuestas biológicas [ ,,,0],27]. Nos hypothetised que la heterogeneidad molecular de HCV observada en los pacientes infectados podrían estar involucrados en la evolución clínica de desarrollo del cáncer.
La sobreexpresión de TGF-β y la disminución concomitante en la inhibición de crecimiento de hepatocitos que se observa con frecuencia en HCC apoyo a la idea de que TGF-β podría desempeñar un papel en la promoción tumoral del cáncer de hígado [28]. Sin embargo, la implicación funcional de TGF-β en la tumorigénesis hígado, así como la implicación de EMT en el desarrollo de HCC todavía no se han dilucidado. Del mismo modo, los efectos de oncogénico hepatitis B viral o proteínas C en desarrollo EMT no se han estudiado en el curso de proceso de hepatocarcinoma. Lo que demuestra la interacción entre la infección por el VHC y el TGF-β mediada EMT puede proporcionar un nuevo modelo para obtener información en los mecanismos de la carcinogénesis hepática.
En este estudio, se hizo uso de VHC núcleo natural de variantes aisladas de HCC relacionada con el VHC tejidos para analizar su impacto en la doble función de TGF-β en una condición pathophysiogically relevantes. Por lo tanto, se investigaron los efectos de la proteína del núcleo variantes aisladas de ambas zonas cirróticos en hepatocitos humanos primarios tumoral o no tumoral; de hecho, la cirrosis es una condición preneoplásicas bien conocido, asociado en por lo menos 90% de los casos de HCC. El uso de estas variantes nos ofrecen evidencia de un paradigma en el que una proteína viral es capaz de cambiar las respuestas de TGF-ß de los efectos citostáticos a EMT desarrollo.
Materiales y Métodos
Materiales
recombinante TGF-β1 y TRAIL recombinante /Apo2L se adquirieron de Abcys, el inhibidor químico de TGF-β señalización SB-431542, que actúa al interferir específicamente con el receptor de tipo I [29] era de Calbiochem, el colorante fluorescente Dioc
6 (yoduro de 3,3'dihexylocarbocyanine) era de Molecular Probes.
Vectores
secuencias centrales del VHC de longitud completa se amplificó a partir de VHC-ARN extraído de tumor (T) o nódulos cirróticos (NT) de un paciente (paciente B) infectados con VHC genotipo 1b tal como se describe anteriormente [22]. productos de PCR se secuenciaron directamente y se insertaron en el vector pcDNA3.1. La secuencia de estas dos variantes se ha descrito anteriormente [27]. La secuencia T difiere del NT por 2 cambios en AA 118 (N → D) y aa 189 (A → V).
(CagA)
9-Luc fue proporcionado amablemente por el Dr. JM Gauthier . Los vectores de expresión para HA-TβRI.act y Bandera-TβRImL45.act fueron un regalo del Dr. Y.E. Zhang [30]. El plásmido pRetroSuper-puro que contiene corta antisentido ARN horquillas contra Smad3 fue proporcionado amablemente por el Dr. J. Massagué [31]. Un plásmido pRetroSuper-puro que contiene scramble horquillas cortas de ARN se utilizó como control. pIRES-GFP se obtuvo de Stratagene, pCMV-Renilla-luc era de Promega. vector de expresión de myc-Smad3 se describió anteriormente [32].
Los ratones transgénicos
Para obtener ratones transgénicos, los ADNc núcleo del VHC aislados de tumor (T) o nódulos cirróticos (NT) fueron clonados aguas abajo de elementos reguladores de virus de la hepatitis B y se introduce en C57BL /6 embriones (Institut Clinique de la Souris, Estrasburgo, Francia). Los ratones transgénicos fueron identificados sometiendo 1 mg de ADN de la cola de la amplificación por PCR.
Cultivo de células
La línea celular de hepatoma humano Huh7 [33] se mantuvo en medio Dulbecco modificado que contiene 10% de ternera fetal suero (FCS). Las células se transfectaron con los diferentes vectores utilizando el método de LipofectAMINE (Invitrogen) y los transfectantes estables se seleccionaron mediante la incubación de las células con el antibiótico correspondiente al gen de selección.
Aislamiento y cultivo de hepatocitos primarios
hepatocitos primarios de ratón se aislaron por perfusión del hígado con una mezcla de colagenasa como se describe anteriormente [34]. Después del aislamiento, los hepatocitos se resuspendieron en medio Williams suplementado con suero de ternera fetal al 10%, 100 mg /ml de estreptomicina, 100 U /ml de penicilina, 250 fungizona ng /ml ( "medio de baño") y se sembraron a la densidad de 3 × 10
4 células /cm
2. Después de 4 horas, medio que contiene suero se retiró y las células se cultivaron en medio Williams suplementado con 1 mg /ml de albúmina de suero bovino, 100 mg /ml de estreptomicina, 100 U /ml de penicilina, 250 fungizona ng /ml, y se trató con TGF β 2 ng /ml o SB431542 1 M.
hepatocitos humanos primarios fueron aislados del tejido hepático sano de muestras de biopsia de hígado quirúrgicos recogidos después de consentimiento informado obtenido de paciente sometido a hepatectomía parcial terapéutico para la metástasis de hígado y tumor hepático benigno. La colagenasa (Sigma Aldrich) de perfusión (500 g /ml, 2,4 mg /ml CaCl
2 en tampón HEPES, pH 7,4) fue precedido por un lavado extenso del tejido del hígado con tampón HEPES /EDTA (pH 7,4) utilizando un catéter insertado en los vasos sobre la superficie de corte del fragmento resecado. Las células fueron lavadas dos veces y los hepatocitos se separaron a partir de células nonparenchymatous por Percoll fraccionamiento (solución Percoll isotónico 30%, se centrifugaron a 450 g durante 4 min) e inmediatamente infectaron a 37 ° C durante 2 h con vectores lentivirales, se lavaron y se sembraron en medio Williams complementado como se describe en otra parte [35]. Doce horas más tarde, fueron tratados o no con TGF-β o SB431542 durante diversos periodos de tiempo.
Los vectores lentivirales
TRIP-ΔU3-CMV-T, TRIP-ΔU3-CMV-NT y los vectores TRIP-ΔU3-CMV-CINV se obtuvieron mediante la sustitución de GFP en TRIP-ΔU3-CMV-GFP con ADNc que codifica secuencias centrales del VHC. Un invertida secuencia central TRIP-ΔU3-CMV-CINV se utilizó como control.
partículas del vector se produce por la co-transfección con fosfato de calcio transitoria de células 293T como se ha descrito previamente [36]. concentraciones del vector se normalizaron de acuerdo con el p24 (HIV-1 proteína de la cápside) contenido de sobrenadantes.
Western blotting
Las células se lavaron dos veces con PBS y se lisaron en tampón RIPA que contiene 0,5% de SDS y Benzon nucleasa. Las proteínas se cuantificaron con el ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, Francia) y 30 g de extractos se separaron en gel de poliacrilamida SDS, se transfirieron sobre membrana de nitrocelulosa y se transfirieron utilizando diferentes anticuerpos primarios dirigidos contra la proteína del núcleo de VHC, E-cadherina, fibronectina (Cruz de Biotecnología de Santa), vimentina (Chemicon), fosfo-Smad3 (señalización celular), Smad3 (Abcam), Bandera, Myc y HA etiquetas (Sigma). Las membranas se revelaron utilizando un kit de detección chemioluminescence (ECL Plus, GE Healthcare).
tinción celular
hepatocitos primarios de ratón se cultivaron durante 48 h con o sin TGF-β (2 ng /ml) y la rutina de tinción de hematoxilina-eosina se realizó después de la fijación de las células con EtOH 70% a 4 ° C durante 15 min.
inmunofluorescencia tinción
Las células se lavaron con PBS y se fijaron con un 4% PFA solución a 4 ° C durante 20 min seguido de permeabilización en metanol durante 5 min a -20 ° C. Las células se incubaron a continuación con un ratón primario anti-vimentina, conejo anti-αSMA, o anticuerpo de conejo anti-E-cadherina y luego con un anticuerpo anti-ratón de Alexa Fluor 488 conjugado y un anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con Alexa Fluor 594 (Molecular Probes). Posteriormente fueron teñidos con Hoechst y examinadas por microscopía de fluorescencia.
ensayos
proliferación celular y la apoptosis
La proliferación celular se evaluó la incorporación de BrdU (Roche), la viabilidad celular y la actividad de caspasa 3 se estimaron utilizando una ensayo Celltiter-Glo viabilidad celular luminiscente o el ensayo CaspaseGlo 3/7 respectivamente (Promega) según las instrucciones del fabricante.
potencial transmembrana mitocondrial (ΔΨm) se evaluó por tinción de las células (10
6) con el colorante fluorescente DIOC
6 a una concentración final de 40 nM durante 15 min a 37 ° C. Las células se disociaron de inmediato por la tripsina y su fluorescencia estimaron por análisis con un citómetro de flujo FACScan (Becton-Dickinson) utilizando el canal FL1 [37].
Ordenando Cell análisis de citometría
Flow y la clasificación eran realizada utilizando un flujo FACSDiva citómetro (Becton Dickinson Immunocytometry Systems). Dispersión frontal (FSC) y dispersión lateral (SSC) se recogieron a través de un filtro. La señal de GFP se recoge en el canal FL1. Una puerta de luz se dibuja en el SSC con respecto a FSC para excluir células /restos muertos. Las células en la puerta se visualizan en un histograma biparameter (FS frente a FL1) y los ajustes de compuerta final determinado para recoger las células marcadas. células GFP positivas fueron ordenados en 5000 células /s.
análisis transcripcional
Las células se cotransfectaron con vectores de codificación para el gen de interés junto con el plásmido reportero CAGA-luc y la luciferasa de Renilla plásmido a normalizar los resultados. Se incubaron 24 h más tarde en la ausencia o presencia de TGF-β para otro 18 h. La actividad de luciferasa se midió con el sistema de ensayo de indicador Dual Luciferase (Promega) según las instrucciones del fabricante.
El análisis estadístico
La significación entre las diferentes condiciones y su control se determinó mediante emparejado Student de
t
prueba utilizando el software GraphPad Prism. A p-value≤0.05 fue considerado significativo.
Resultados
core del VHC variantes aliviar respuestas citostáticos TGF-β y aumentar la EMT mediada por TGF-β en el ratón o hepatocitos primarios humanos
Hemos demostrado previamente que, cuando se expresa transitoriamente en células hepáticas, proteínas del núcleo de HCV aislados de tumor o nódulos cirróticos se unen Smad3 de manera diferente y que esta interacción inhibe la actividad transcripcional dependiente de Smad3 [27]. Para determinar la relevancia fisiológica de esta observación, lo primero que investigó el impacto de dicha unión en las respuestas biológicas de TGF-β en hepatocitos aislados de ratones transgénicos que expresan estos tumores VHC (T) o cirróticos (NT) variantes básicas bajo el control del promotor HBx y que se expresa principalmente en el hígado. Los hepatocitos se aislaron de hígados de ratones de 2 meses y tratados o no con TGF-β durante 48 horas. Hemos observado que el TGF-β fue menos potente para inhibir la proliferación celular en hepatocitos aislados de ratones transgénicos que expresan las proteínas del núcleo del VHC que en hepatocitos aislados de un ratón de control (Fig. 1A). Por consiguiente, la viabilidad celular se redujo menos por el TGF-β en células que expresan las proteínas del núcleo en comparación con células de tipo salvaje (Fig. 1B). También se encontró que la expresión de las proteínas del núcleo de VHC inhibidas apoptosis TGF-β mediada como se muestra por la activación de la caspasa 3, lo que representa una característica bien definida de la apoptosis (Fig. 1C). Curiosamente, la expresión núcleo T disminución de la apoptosis o inhibición de la viabilidad celular mediada por TGF-β en un grado más alto que el núcleo NT que muestra un significado funcional de la mayor interacción de esta variante núcleo con Smad3 [27]. Con el fin de verificar que esta reducción del núcleo del VHC inducida por la apoptosis observada después del tratamiento de TGF-β fue específico, se utilizó otro inductor de la apoptosis, TRAIL. hepatocitos de ratón que expresan o no las proteínas del núcleo de VHC responden a TRAIL de una manera similar en términos de la caspasa 3 de activación lo que sugiere que el proceso general de la apoptosis no fue modificada por la expresión de núcleo (Fig. 1D). Este resultado está de acuerdo con un informe previo que indica que el VHC núcleo conduce a la apoptosis inducida por TRAIL través de la activación de la vía mitocondrial de señalización [38].
(A, B, C) hepatocitos de ratón obtenidos a partir de hígados de ratones transgénicos que expresan o no las proteínas del núcleo de HCV aislados de tumor (T) o los tejidos cirróticos (NT) se trataron con TGF-β por 48 h antes de la determinación de la proliferación celular, estimada por incorporación de BrdU (a), la viabilidad celular (B) o caspasa 3 actividad (C). (D) Las células se trataron con TRAIL (20 ng /ml) durante 18 h antes de la determinación de la actividad caspase3. Los resultados representan la media +/- SD de triplicados de un experimento representativo. * P = 0.05, ** p≤0.005, *** p≤0.0005.
Varias líneas de evidencia apoyan la noción de que las células cancerosas epiteliales pierden su capacidad para responder a los efectos citostáticos de TGF-β, pero en algunos casos, conservar su capacidad de responder a otras funciones mediadas por TGF-β como EMT. La observación de que las proteínas del núcleo del VHC interfieren con la capacidad del TGF-β para ejecutar la inhibición del crecimiento celular y la muerte celular nos llevó a considerar la posibilidad de que estas proteínas podrían influir en el TGF-β mediada EMT. Desde hallazgos recientes han demostrado que el TGF-β podría inducir un EMT en hepatocitos de ratón maduros
in vitro
[6], [7], se investigó si las proteínas del núcleo del VHC podría modular la capacidad del TGF-β para promover la EMT en las mismas hepatocitos primarios. observación de microscopía de contraste reveló que después del tratamiento de 30 h con TGF-ß algunos hepatocitos adquirido una morfología similar a fibroblastos sugestivo de EMT y que este efecto fue más pronunciado cuando estos hepatocitos expresan la proteína del núcleo que muestra que la plasticidad de células se podría aumentar en hepatocitos de ratón que expresan VHC núcleo de la proteína T (Fig. 2A). Esta observación se vio reforzada por la observación videomicroscopy (datos no mostrados). Para confirmar que estos cambios fenotípicos observados fueron el reflejo de un EMT, se realizó un análisis de inmunofluorescencia en hepatocitos aislados de control o de ratones transgénicos. En línea con los resultados anteriores, el tratamiento de TGF-β de control de hepatocitos de ratón fue acompañado por un aumento muy fuerte en la polimerización de la mesenquimales marcador de alfa actina de músculo liso (αSMA) consistente con un fenotipo de EMT (Fig. 2B). Curiosamente, las proteínas del núcleo de VHC y particularmente la T podría aumentar las fibras αSMA en ausencia de exógenamente añadido TGF-β. Para evaluar si la liberación autocrina de TGF-β podría estar implicado en la formación de fibras de estrés αSMA en el núcleo de las células que expresan el VHC, se utilizó un inhibidor específico TGFβR1, SB431542. Cuando estas células que expresan fueron tratados con este inhibidor, fibras αSMA desaparecieron por completo, lo que sugiere que el efecto de la proteína del núcleo central en el desarrollo de EMT está mediada por una producción endógena de TGF-β (Fig. 2B). De acuerdo, transferencias de Western también los análisis mostraron que la expresión de E-cadherina, un marcador epitelial conocida que se pierde en las células mesenquimales, se redujo en gran medida por el TGF-β y completamente restaurada mediante la adición de SB431542 (Fig. 2C).
(A) los cambios morfológicos de los hepatocitos de ratón que expresan o no el VHC proteína de núcleo T observada después de 48 h de cultivo con o sin TGF-β (2 ng /ml). (B) Los hepatocitos aislados de ratones transgénicos que expresan las proteínas del núcleo de VHC fueron tratados con TGF-β (2 ng /ml) o SB431542 (1 M) durante 48 h y la expresión de αSMA se examinó por inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo αSMA. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. (C) Los hepatocitos aislados de ratones transgénicos que expresan las proteínas del núcleo de VHC fueron tratados con TGF-β o SB431542 durante 48 h y la expresión de E-cadherina se determinó por transferencia Western. Anti-p38 Western Blot se utilizó como control de carga. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
Para obtener más evidencia de que las proteínas del núcleo del VHC podría modular la magnitud de los efectos reguladores negativos del crecimiento de TGF-ß también se realizaron experimentos en cultivos primarios de hepatocitos humanos. recién aislados hepatocitos fueron infectadas con lentivirus que codifican para las variantes básicas T o NT o una secuencia de núcleo invertida como control. análisis de Western blot confirmó la expresión de las proteínas del núcleo (Fig. 3A). Las células se trataron a continuación o no con TGF-β durante 96 h antes del análisis de la viabilidad celular o la caspasa 3 de activación. Tanto disminución TGF-β-mediada de la viabilidad celular (Fig. 3B) y las respuestas apoptóticas (Fig. 3C) se aliviaron por la expresión del núcleo de VHC que confirma los resultados obtenidos en hepatocitos de ratón
.
células recién aisladas fueron infectadas con lentivirus que codifican las variantes del núcleo de VHC de proteína o una secuencia de núcleo invertida como control (CTL) (a) los niveles de expresión de núcleo se estimaron mediante análisis de transferencia Western diferentes puntos de tiempo después de la transducción lentivirus. (B, C) Determinación de la viabilidad celular (B) o actividad de caspasa 3 (C) se realizó después de 96 h de tratamiento con TGF-β (5 ng /ml). Los resultados representan la media +/- SD de triplicados de un experimento representativo. * P = 0.05, *** p≤0.0005.
A pesar de que el TGF-β mediada EMT se ha descrito en el ratón o rata hepatocitos primarios, así como en las células humanas cancerosas, ningún estudio ha sido aún investigado en hepatocitos humanos primarios in vitro. Curiosamente, se observó que los hepatocitos humanos podrían expresar las fibras de estrés como los picos localizados principalmente en las protuberancias de la membrana bajo tratamiento TGF-β (Fig. 4A). La expresión de las proteínas del núcleo de VHC aumentó este efecto de TGF-β. Aquí de nuevo la expresión de las proteínas del núcleo de VHC aumentó polimerización αSMA incluso en ausencia de exógenamente añadido TGF-β. Este efecto podría implicar endógeno TGF-β, ya que fue completamente abolida en presencia del inhibidor del receptor de TGF. Para corroborar este resultado, se estudió la expresión de otro marcador mesenquimal, vimentina. De acuerdo con los datos obtenidos con αSMA, se observó que en hepatocitos de control de la expresión de vimentina se aumentó notablemente después del tratamiento de TGF-β y que este aumento fue mayor cuando los hepatocitos expresan la proteína del núcleo NT y aún mayor cuando T núcleo se expresó (Fig. 4A ). Del mismo modo, las proteínas del núcleo indujo la expresión de vimentina y la polimerización en ausencia de exógenamente añadido TGF-β. Esta expresión fue completamente revertido por la TGFbRI inhibidor lo que sugiere de nuevo que la producida endógenamente TGF-β podría ser responsable de este efecto
.
(A) Expresión de αSMA o vimentina se estimó por análisis de inmunofluorescencia después del tratamiento con TGF-β ( 5 ng /ml) o SB431542 (1 M). (B) Expresión de fibronectina o E-cadherina se estimó por análisis de transferencia Western en las mismas condiciones experimentales. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. Los análisis
Las transferencias Western evidenciaron una menor expresión de E-cadherina después del tratamiento de TGF-β que fue totalmente recuperado en presencia del inhibidor TBRI. Por el contrario, la expresión de la fibronectina marcador mesenquimal se incrementó en gran medida por el TGF-β (Fig. 4B).
Tomados en conjunto estos datos sugieren fuertemente que el VHC núcleo interfiere con las respuestas de TGF-β en términos de inhibición del crecimiento celular y la apoptosis en hepatocitos aislados de ratones transgénicos, así como hepatocitos primarios humanos. Notablemente, las respuestas de TGF-beta, en términos de EMT se incrementan por la expresión de T o NT variantes de la proteína del núcleo, tanto en ratón y hepatocitos humanos. Esto podría reflejar los efectos directos de núcleo en EMT y la reducción de la apoptosis inducida por TGF-β por la proteína de núcleo de TGF-β-inducida, lo que permite más células a someterse a EMT en comparación con las células control.
núcleo del VHC modula TGF -β respuestas en células Huh7
con el fin de diseccionar los mecanismos moleculares activados por la proteína del núcleo de VHC, establecimos líneas de células Huh7 que expresaban de forma estable la proteína del núcleo T (Fig. 5A). proteína Core inhibió TGF-β mediada por la actividad transcripcional Smad3 medida por la expresión en estas células de un plásmido reportero, que contiene elementos CAGA previamente demostrado ser transactivado por el TGF-β a través de proteínas Smad (no mostrado). En consonancia con los resultados observados en hepatocitos primarios, se encontró que la proteína del núcleo de VHC fue capaz de disminuir el efecto inhibidor de TGF-β en la viabilidad celular (Fig. 5B). Del mismo modo, la apoptosis mediada por TGF-β se redujo en células que expresan núcleo del VHC, como se muestra por la activación caspase3 (Fig. 5C) o la pérdida de potencial de membrana mitocondrial, lo que representa otro marcador temprano de la apoptosis (Fig. 5D).
(A) Expresión de la proteína del núcleo de VHC se determinó por análisis de transferencia de Western. (B, C) Las células se trataron con TGF-β (5 ng /ml) durante 48 h antes de la determinación de la viabilidad celular (B) o actividad caspase3 (C). Los resultados representan la media +/- SD de triplicados de un experimento representativo. *** P≤0.0005 (D) el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) se estimó por análisis FACS en células tratadas con TGF-β para 48 h. Después de la tinción con Dioc
6 (3), las células con baja intensidad de fluorescencia correspondiente a la baja (ΔΨm) fueron cerrada y su número expresado como un porcentaje de la población total. Se muestra un experimento representativo. (E) Las células se trataron con TGF-β durante 48 h y E-cadherina o expresión αSMA se evaluó mediante el análisis de inmunofluorescencia. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. (F) Expresión comparativa de las proteínas del núcleo del VHC. Los extractos de células cultivadas que expresan la proteína de núcleo (Huh7, hepatocitos primarios humanos o de ratón) o de hígado de pacientes con HCC relacionada con el VHC se analizaron por Western blot. Anti-p38 Western Blot se utilizó como control de carga.
A continuación, EMT proceso determinado en líneas celulares Huh7 que expresaban esta proteína núcleo. Los estudios de inmunofluorescencia mostraron que αSMA fue altamente polimerizado después del tratamiento TGF-β asociada con una fuerte disminución de la E-cadherina de las membranas de las células (Fig. 5E). αSMA polimerización se aumentó en las células que expresan centrales. Curiosamente, en la presencia de la proteína del núcleo, las fibras αSMA aparecieron incluso en ausencia de la adición exógena de TGF-β. La expresión de αSMA fue acompañado con el crecimiento de anclaje independiente, que se observó en ausencia de exógenamente añadido TGF-β en la proteína del núcleo de VHC células que expresan (datos no mostrados).
Todos juntos, estos datos indican que los efectos de las proteínas del núcleo del VHC en las respuestas de TGF-β observado en hepatocitos primarios fueron reproducidos en una línea celular de hepatoma humano que podrían lo que constituyen una herramienta útil para diseccionar los mecanismos que están implicados en la modulación de las respuestas de TGF-beta.
también comparó la expresión de la proteína del núcleo en nuestros diferentes modelos celulares y en extractos de hígado de pacientes /HCC VHC. Se obtuvo la expresión más fuerte en los hepatocitos humanos, lo cual es consistente con una transducción lentiviral eficiente. HCV expresión de la proteína de núcleo podría ser también detectada en diferentes extractos de hígado, aunque a diferentes niveles. Curiosamente, la expresión de núcleo en estos extractos fue comparable a la observada en los hepatocitos de ratón (Fig. 5F).
umbrales diferenciales de Smad3 interruptor de activación de respuestas de TGF-β de supresión tumoral a la promoción de tumores
para analizar con más detalle la contribución de la activación de Smad en los efectos del core del VHC en las respuestas de TGF-β, hemos hecho uso de un mutante del receptor de TGF-β I, TβRImL45Act que conserva un dominio quinasa constitutivamente activa, pero es incapaz de inducir Smad fosforilación. células Huh7 se transfectaron con este mutante o con la forma activada de tipo salvaje de TβRI, junto con un plásmido que codifica para el núcleo del VHC y GFP para detectar las células transfectadas. .