Extracto
Carcinoma de células transicionales (TCC) de la vejiga urinaria es el cáncer más común del tracto urinario. La mayor parte de los casos de TCC son de tipo superficial y son tratados con resección transuretral (RTU). Sin embargo, la tasa de recurrencia es alta y los tratamientos actuales tienen el inconveniente de inducir una fuerte toxicidad sistémica o causar cistitis dolorosa. Por lo tanto, sería de valor terapéutico para desarrollar conceptos novedosos e identificar nuevos fármacos para el tratamiento de cáncer de vejiga. Ki-67 es un gran fosfoproteína nucleolar cuya expresión está estrechamente vinculada a la proliferación celular, y la curcumina, un fitoquímico derivada de rizoma
Curcuma longa, España se ha demostrado que poseen potentes propiedades contra el cáncer. En este estudio, se evaluó la eficacia combinada de curcumina y un siRNA contra Ki-67 mRNA (Ki-67-7), en la rata (AY-27) y humano (T-24), las células de cáncer de vejiga. Los efectos contra el cáncer se evaluaron mediante la determinación de la viabilidad celular, la apoptosis y el análisis del ciclo celular. Ki-67-7 (10 nM) y la curcumina (10 M), cuando se tratan de forma independiente, fueron moderadamente eficaz. Sin embargo, en su presencia combinada, la proliferación de células de cáncer de vejiga era profundamente (& gt; 85%) inhibió; la tasa de apoptosis en la presencia combinada de la curcumina y Ki-67-7 (36%) fue mayor que el debido a Ki-67-7 (14%) o la curcumina (13%) solo. También se observó una sinergia similar entre la curcumina y Ki-67-7 en la inducción de la detención del ciclo celular. Western blot sugiere que el tratamiento previo con células de cáncer de vejiga Ki-67-7 sensibilizados a la apoptosis y la detención del ciclo celular curcumina mediada por mecanismos p53 y p21-independiente. Estos datos sugieren que una combinación de anti-Ki-67 siRNA y curcumina podría ser un tratamiento viable contra la proliferación de células de cáncer de vejiga
Visto:. Pichu S, S Krishnamoorthy, Shishkov A, Zhang B, McCue P , Ponnappa BC (2012) Derribo de Ki-67 por células Dicer-sustrato pequeños ARN de interferencia sensibiliza cáncer de vejiga a la inhibición de tumores inducidos por la curcumina. PLoS ONE 7 (11): e48567. doi: 10.1371 /journal.pone.0048567
Editor: Bharat B. Aggarwal, la Universidad de Texas Centro de Cáncer MD Anderson, Estados Unidos de América
Recibido: 23 Agosto, 2012; Aceptado: September 28, 2012; Publicado: 12 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Pichu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos nacionales de Salud de subvención AA016551. El organismo de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. No se recibió financiación externa adicional para este estudio
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer de vejiga es el cáncer más común en urológica. Sudeste de Asia y la segunda neoplasia urológica más frecuente en América del Norte [1]. Carcinoma de células transicionales (TCC) representa más del 90% de los pacientes diagnosticados con cáncer de vejiga [2]. Mayor que 70% de los tumores de CTP son tumores superficiales confinados a la mucosa de la vejiga y la lámina Propia -Ta o T1 por etapas los tumores y los restantes son de tipo invasivo. La incidencia de cáncer de vejiga urinaria se ha incrementado continuamente durante las últimas dos décadas [3]. Un tratamiento preferido para los tumores superficiales es la resección transuretral (TUR), pero el riesgo de recurrencia (60-70%) debido a la reinserción de las células tumorales liberados y la muerte de la enfermedad (10-30%) es elevada [4]. El enfoque principal para prevenir la recurrencia del tumor, después de la RTU, ha sido la terapia instilación intravesical (IVI) utilizando fármacos quimioterapéuticos [5], [6] pero los efectos citotóxicos de los medicamentos son de preocupación. Debido a su mayor eficacia, la inmunoterapia intravesical con
Calmette Guerin
Bacillus (BCG) se ha convertido en el tratamiento de elección durante las últimas tres décadas. Sin embargo, la inducción de la cistitis y la toxicidad sistémica son algunos de sus efectos secundarios graves [2]. A pesar de las terapias agresivas, los pacientes con cáncer de vejiga tienen una tasa de supervivencia a 5 años de sólo el 50% [7]. Además, un número sustancial de pacientes con cáncer de vejiga son resistentes a la terapia intravesical convencional y, por lo tanto, es necesario desarrollar enfoques y, preferiblemente, menos tóxicos nuevas para combatir la enfermedad.
Uno de los más nuevos enfoques para suprimir la progresión tumoral es por el uso de fármacos específicos de genes tales como, los oligonucleótidos antisentido (AsODNs) o pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) en contra de los ARNm de las proteínas específicas de tumor. Tras el descubrimiento de la interferencia de ARN (RNAi) en una variedad de especies [8] - [10], ha habido un tremendo interés en el aprovechamiento del potencial terapéutico de siRNAs en el tratamiento de diversas enfermedades [11], incluyendo el cáncer [12] y enfermedades inflamatorias [13]. Ki-67 es un gran fosfoproteína nucleolar cuya expresión está estrechamente vinculada con el ciclo celular y que está estrictamente asociado con la proliferación celular [14]. Es una proteína de unión al ADN con un papel principal en el mantenimiento de estructura de orden superior para el ADN durante el proceso de la mitosis. El análisis detallado del ciclo celular reveló que el antígeno Ki-67 está presente en los núcleos de la proliferación (G1, S, fase G2- y mitosis) pero no en los núcleos de las células quiescentes o de reposo (fase G0-) [15]. Esto sugiere que los inhibidores de Ki-67 pueden tener especificidad relativa para células malignas. Yoa et al., [16] informó de que entre muchos de los genes relacionados con el cáncer probadas, la de Ki-67 expresión era uno de los más altos de los tumores de vejiga de ratas, llegando a casi 20 veces los niveles más altos en comparación con el tejido normal. Por lo tanto, Ki-67 ha sido uno de los genes de interés a diana, utilizando AsODNs [17], [18] o siRNAs [19], [20]. En el informe más reciente, asODN contra Ki-67 fue utilizado en ensayos clínicos de fase I para el tratamiento de cáncer de vejiga humana [21]. Aunque, la eficacia de AsODNs demostrar la prueba del principio, se sabe que siRNAs son al menos un orden de magnitud más sensible que AsODNs [22], [23] y por lo tanto, mucho menor cantidad de medicamento que ser utilizado para una eficacia similar. Además, se ha demostrado que los (27 pb) siRNAs Dicer-sustrato más largos (DsiRNAs) son más sensibles que el estándar de 19-21 pb siRNAs [24]. Por lo tanto, siRNAs /DsiRNAs proporcionar una herramienta mejor que AsDONs para orientar genes específicos de tumores.
Además de las moléculas antisentido, en los últimos años, los fármacos de origen vegetal también han recibido mucha atención debido a su enorme potencial en la prevención y el tratamiento del cáncer [25]. La curcumina es un fitoquímico polifenólica derivada de rizoma,
Curcuma longa
. Debido a su potente efectos antiproliferativos y antiinflamatorios, que ha llamado mucho la atención de los investigadores en el campo del cáncer. Hasta la fecha, hay más de 70 estudios clínicos en diversas fases de ejecución, poniendo a prueba la eficacia de la curcumina contra muchas enfermedades (www.clinicaltrials.gov). El papel de la curcumina en la medicina moderna ha sido revisado recientemente [26] - [28]. El potencial contra el cáncer de la curcumina se deriva de su capacidad para suprimir la proliferación de una amplia variedad de células tumorales, por abajo de la regulación de la expresión de genes en proliferación, tales como COX2, MMP-9, quimiocinas, ciclina D1 y el factor nuclear kappa B (NF kappa B) [29]. Tharakan et al., [30] utilizando un modelo ortotópico de cáncer de vejiga de ratón, informó de que la curcumina abolió la activación constitutiva de NF-kB en el tejido tumoral, la apoptosis inducida y la disminución de la COX-2 expresión. Sin embargo, en presencia del fármaco quimioterapéutico, gemcitabina, bajas concentraciones de curcumina potencia los efectos de la droga a través de la modulación de la vía de señalización de NF-kappa B [31]. Estas observaciones demuestran claramente el potencial terapéutico de la curcumina en el tratamiento de cáncer.
Desde la curcumina inhibe la proliferación de las células tumorales por la orientación varios sitios con las vías de apoptosis y de proliferación, la hipótesis de que la superposición de la curcumina de objetivos múltiples después de la inhibición molecular de Ki-67, tendría un mayor efecto inhibitorio sobre el crecimiento tumoral. De hecho, nuestro datos muestran, por primera vez, que el pretratamiento de las células de cáncer de vejiga con DsiRNA contra Ki-67 mRNA promueve la detención del ciclo celular y sensibiliza las células a la apoptosis inducida por curcumina. Se discuten las dianas moleculares putativos de la curcumina y Ki-67 DsiRNA.
Materiales y Métodos
ARNsi diseño em
Un total de tres dúplex DsiRNA dirigida contra rata ARNm Ki-67 fueron diseñados (Integrated Technology ADN, Coralville, IA, EE.UU.). Las secuencias de los tres DsiRNAs son los siguientes; 1) Ki-67 -2; Secuencia sentido 5 '- CGA ACA AAG UCA UCA GAC ACA GUG A-3'; secuencia antisentido 5'-UCA CUG CUG UGÚ agosto ACU UUG NVND GUU-3 '; 2) Ki-67-7; Secuencia sentido 5 '- CAA GAG UGA GGG AGU CCG UUU GAA G-3'; secuencia antisentido 5 '- CUU CAA CAC AGG UCC CUC ACU CUU GUU -3' y 3) Ki-67-9; Secuencia sentido 5'-CCA CCA CCA GAG AUA GAU ACU UCA G-3 'y 5'-CUG secuencia antisentido AAG UAU CUA UUG GCU GCU GUG GUG-3'. Un DsiRNA irrelevante, de aquí en adelante como "control" DsiRNA fue diseñado y tiene la siguiente secuencia; Secuencia sentido 5'-CAA GAG UGA GGG AGU CCG UUU GAA G-3 '; secuencia antisentido 5 '- CUU CAA CAC AGG CGG AUC ACU CUU GUU-3'. Aunque la abreviatura "DsiRNA" se utiliza inicialmente para enfatizar el hecho de que los siRNAs más largos fueron utilizados en el estudio actual, el término genérico "siRNA" se usa indistintamente en todo el texto.
Cell Culture
TCC células de rata derivado trasplantables (AY-27 células) fueron amablemente proporcionados por el Dr. Ronal Moore (Universidad de Alberta, Canadá). La caracterización de un modelo de tumor de vejiga usando esta línea de células trasplantables ha informado [32]. Las células se mantuvieron en monocapas, en un medio de cultivo que consiste de RPMI-1640 (Gibco-BRL), suplementado con 10% de FBS, HEPES 30 mM (pH 7,3), piruvato 1 mM, penicilina-estreptomicina y 2,0 g /l de NaHCO
3. Las células se mantuvieron a 37 ° C en 5% CO atmósfera de aire
2 y 95% por el método de Xiao
et al
[32]. AY-27 células se pasaron cuando confluentes por tripsinización estándar y procedimiento de recultivo. T-24 líneas celulares de cáncer de vejiga que se indique, con fines comparativos, humano derivado (American Type Culture Collection) también se utilizaron en este estudio y se mantuvieron en cultivo de tejidos como se describe para AY-27 células.
transfección siRNA
El día antes de la transfección, las células se tripsinizaron, se diluyó con medio fresco y se transfirieron a placas de 12 pocillos (0,8-1,0 × 10
5cells /pocillo). DsiRNAs se transfectaron usando el reactivo diseñado específicamente para siRNA transfección (Lipofectamine ™ RNAiMax) según el protocolo del fabricante (Invitrogen, EE.UU.). Rutinariamente, la transfección se llevó a cabo en confluencia de células 8-10%.
tratamiento de cúrcuma
Cuando se indica, las células tumorales se trataron con diversas concentraciones de la curcumina (Sigma-Aldrich, EE.UU.), ya sea solo o en combinación con DsiRNA. La curcumina se disolvió en DMSO, y en cualquier experimento dado, la concentración final de DMSO fue siempre inferior a 0,1% en volumen.
crecimiento celular Curve
Para la evaluación de la proliferación tumoral, crecimiento tumoral se evaluó midiendo el número total de células en diversas etapas. En cada etapa, las células fueron separadas por tripsinización, se lavaron con PBS, se tiñeron con azul de tripano y las células vivas se contaron usando un hemocitómetro. Cada condición experimental se repitió tres a seis veces.
MTT Ensayo
Los efectos antiproliferativos de siRNA contra Ki-67 en presencia o ausencia de la curcumina se determinó mediante el ensayo de MTT. El ensayo se basa en la capacidad de las mitocondrias para reducir 3- (4, 5 dimethylthiaol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) de colorante, en la rata (AY-27) y humano (T-24) cáncer de vejiga células como se detalla por Plumb [33]. En pocas palabras, después de la exposición de las células a diferentes condiciones de tratamiento, se eliminó medio, se lavó con PBS, y se añadió solución de MTT (5 mg /ml en medio RPMI) y se incubó durante 37 ° C durante 3 horas. Posteriormente, se retiró el medio y se sustituye con un ácido-isopropanol disolvente para disolver el precipitado. Los contenidos se colocaron en un agitador durante 5 minutos y se midió la absorbencia a 570 nm.
Cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR)
Después de la transfección con ARNip y /o tratamiento con curcumina, las células fueron cosechado en el intervalo apropiado y el ARN total fue preparado por PureLink RNA Mini kit (Invitrogen, EE.UU.). Para la síntesis de ADNc, 1 g de ARN total se transcribió de forma inversa en ADNc en reacciones de 20 l utilizando Quantitect kit de transcripción inversa (Invitrogen, EE.UU.). qPCR se realizó con el sistema de detección 480 Cycler® Light (Roche, EE.UU.), utilizando el protocolo de mezcla Maestro Brilliant® SYBR® verde QPCR (Stratagene, EE.UU.). Brevemente, 2 l de cDNA se amplificó por PCR en reacciones de 25 l que contenía 12,5 l de 2 × reactivos SYBR verdes y 0,2 mM de cada uno de los cebadores. La incubación inicial de 10 min a 95 ° C fue seguido por 40 ciclos a 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 min. Cada experimento se realizó por triplicado
Ki-67 Expresión de proteínas:. La tinción de inmunofluorescencia
Las células fueron cultivadas en cubreobjetos de vidrio de 25 mm en placas de 6 pocillos. Después de la exposición a siRNA y /o curcumina en diversas condiciones, las células se lavaron con PBS frío y se fijaron con 4% de formaldehído. Después de lavar con PBS, las células se incubaron con Ki-67 anticuerpo primario (M19, Santa Cruz Biotechnology Inc.,) (1:100) durante 3 horas y se lavaron tres veces con PBS. Los cubreobjetos se incubaron a continuación con anticuerpo marcado con FITC secundario (1:400) en la oscuridad durante una hora a temperatura ambiente, se lavaron con PBS y se tiñeron durante 10 minutos con una solución de yoduro de propidio (PI). A continuación, los cubreobjetos se lavaron con PBS y se montaron en un portaobjetos en presencia de medio de montaje (solución Antifade, Invitrogen, EE.UU.). Las diapositivas fueron vistos bajo el sistema de Bio Rad Resplandor 2001 acoplado a un microscopio Olympus IX70 con 60 × 40 × y objetivos de inmersión en aceite (UAp0340, NA 1,35). Se utilizó una doble línea de Cr /Ar fuente láser de iones para la imagen con los ajustes de excitación de 488 nm para FITC y 588 nm para PI.
Detección de apoptosis por anexina V Ensayo
se midió
La apoptosis utilizando PE Anexina V apoptosis Detección Kit I (BD Biosciences, EE.UU.) según el protocolo del fabricante. Brevemente, tras la exposición a siRNA con o con curcumina a cabo, las células se lavaron con PBS frío y después se resuspendieron en tampón de unión, seguido de la adición de PE Anexina V y 7-amino-Acitomycin (7-AAD) y se analizaron en Epopeyas de Beckman Coulter XL-MCL ™ citómetro de flujo, (EE.UU.). De forma rutinaria, la fluorescencia promedio derivado de 20.000 recuentos de células por muestra se registró.
Cell Cycle Análisis
Para determinar el efecto de anticuerpos anti Ki-67 DsiRNA y /o curcumina en las fases del ciclo celular, AY-27 células fueron expuestas a diversas condiciones experimentales, los medios de comunicación retiró y las células se separaron mediante tripsinización. Después, las células se lavaron con PBS y se fijaron en etanol helado al 70% durante 2 horas a -20 ° C. Después, las células se lavaron una vez con PBS, se resuspendieron en 300 l de una solución enfriada con hielo modificado PI (solución PI 50 mg /ml, 0,1% de Triton X-100, y 0,1% de citrato de sodio, en PBS) y se incubaron durante 30 min antes del análisis. PI fluorescencia se midió de Beckman Coulter Epics XL-MCL ™ citómetro de flujo, (EE.UU.). Rutinariamente, se registró la fluorescencia promedio derivado de 20.000 recuentos de células por muestra. Las células se puntuaron como porcentaje de células en cada una de las fases del ciclo celular (G
O G
1, S y G2 /M /).
Análisis Western Blot
Vejiga células de cáncer, después de la exposición a la curcumina y DsiRNA bajo diversas condiciones, se trataron con tripsina, se lavaron con PBS, y se lisaron con tampón RIPA enfriado con hielo (Sigma Cat#R0278). Los lisados se mantuvieron en hielo durante 20 min, vortex 3-4 veces, y después se centrifugaron en una microcentrífuga a 12.000 rpm durante 15 min a 0-4 ° C. Se retiraron los sobrenadantes y se ensayaron para el contenido de proteína. Alícuotas (40 mg) de proteína de cada muestra se disolvieron en 4 × NuPage sulfato de litio-dodecil (LDS) y se sometieron a SDS-PAGE en condiciones reductoras. Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se bloquearon en cualquiera de albúmina 5% de suero bovino (BSA) o leche en polvo no grasa 5% en una solución salina tamponada con Tris que contiene 0,1% de Tween-20 (TBST) por procedimientos estándar. Las membranas fueron incubadas durante la noche a 4 ° C con los anticuerpos primarios contra los antígenos siguientes: β-actina, la ciclina E y p53 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EE.UU.). Otros anticuerpos utilizados fueron contra Caspase3 escindido, fosforilada-RB (PRB-P) (Cell Signaling Technology, Inc, Danvers, MA), ciclina D1, (BD Bioscience, San José, CA), Ki-67, NF-kappa B (p65 subunidad), p27 /p21 y Kip (Abcam, Cambridge, MA). A continuación, las transferencias se lavaron extensamente con TBS-T y se incubaron con rábano picante apropiada conjugado con peroxidasa anti-ratón o anti-conejo (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) anticuerpos secundarios a diluciones 1:15,000 y 1:20,000, respectivamente, para 2 ha temperatura ambiente antes del lavado final con TBST. Las bandas de proteínas se detectaron por mayor sistema de quimioluminiscencia utilizando SuperSignal West Pico Substrato quimioluminiscente (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). La imagen KODAK estación 440CF (Kodak Scientific Imaging Systems, New Haven, CT) se utiliza para visualizar y cuantificar la intensidad neta de la señal de las bandas. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. se muestran transferencias representativas.
ensayo de proteínas
El contenido de proteína en los lisados celulares se midió usando el kit de ensayo de proteínas Micro BCA ™ (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) usando albúmina de suero bovino como el patrón interno.
Análisis estadístico
Donde se indique, los valores se presentan como media ± sE de las determinaciones (n). Los datos fueron sometidos a análisis estadístico mediante la prueba t de Student pareado utilizando el programa Microsoft Excel y los valores con p. & Lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos
Resultados
Inhibición de la Ki-67 gene Expresión y la proliferación celular por DsiRNA
La
in vitro
se ensayaron eficacias de tres DsiRNA construye dirigida a la rata Ki-67 ARNm como se describe anteriormente en AY-27 células. Como se muestra en la Figura 1A, de los tres DsiRNAs (Ki-67-2, -7, -9), Ki-67-7 mostró la inhibición máxima. La expresión de mRNA, analizado por qPCR, mostró un 39%, 50% y 28% de disminución en la expresión de Ki-67 mRNA por Ki-67-2, 67-7 y Ki-Ki-67-9, respectivamente, en comparación con las células se trató con reactivo de transfección solo. Del mismo modo, ensayo de viabilidad celular por MTT mostró que el tratamiento Ki-67-7 fue el más eficaz de los tres (Fig. 1B). Por lo tanto, Ki-67-7 fue elegido como el DsiRNA más eficaz contra Ki-67 ARNm para estudios posteriores. Además, los estudios de dosis-respuesta que mostraron Ki-67-7 fue más eficaz en la concentración de 10 nM (1c). Bajo condiciones experimentales, un aumento de la concentración Ki-67-7 no mejoró el efecto antiproliferativo del siRNA
.
× 10
5 células /pocillo) como se describe en Materiales y Métodos. Después de 24 h, se transfectaron con cada una de las construcciones de siRNA (Ki-67-2, 67-7 y Ki-Ki-67-9) dirigidos contra el Ki-67 ARNm. Después de 48 h, se extrajo el ARN y los niveles de ARNm se determinaron mediante PCR cuantitativa tal como se describe en Métodos. Las células tratadas con el reactivo de transfección solo se utilizaron como control. La tasa de expresión de Ki-67 mRNA se normalizó a la expresión de β-actina. Los valores representan los datos de un (de dos) experimento usando la media de determinaciones por triplicado. b) células AY-27 se cultivaron en 12 pocillos (0,8 x 10
5 células /pocillo) las placas durante 24 h y transfectadas con diversas construcciones de siRNA como se describe en Métodos. La viabilidad celular se determinó 48 h después de la transfección mediante un ensayo MTT. Las células tratadas con el reactivo de transfección solo sirvió como control (= 100%). Las barras indican los valores que son los medios ± S.E de tres determinaciones. (
* P & lt; 0,05). c) las células AY-27 se cultivaron en placas de 12 pocillos (0,8 x 10
5 células /pocillo) como se describe en Métodos. Cuarenta y ocho horas después de la transfección siRNA, el efecto de varias concentraciones de Ki-67-7 sobre la viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de MTT. Las células tratadas con el reactivo de transfección solo sirvieron como el control. Los valores de viabilidad celular se expresan como porcentaje de control y son las medias ± SE de 3-8 determinaciones (
* P & lt; 0,05,
*** P & lt; 0,005).
Efecto de la curcumina en la proliferación tumoral: Sinergia con Ki-67-7
Los efectos de la curcumina y Ki-67-7 se probaron en ambos (24-T) y derivado de rata de la vejiga de origen humano (AY-27) Células cancerígenas. La comparación de secuencias mostraron que había 80% de homología en la secuencia diana de Ki-67-7 entre ratas y humanos Ki-67 mRNAs. En los estudios de dosis-respuesta, se observó que el crecimiento de células tumorales fue inhibida por la curcumina de un modo dependiente de la dosis (Figs. 2A y 2B), en ambos tipos de células, pero las 24 células T eran más sensibles a la curcumina que las células AY-27 en 20 M y superiores. Sin embargo, en 10 μ M, el grado de inhibición (25-30%) fue similar en ambos tipos de células. En ambos casos, se observó una reducción drástica (60-85%) en la viabilidad celular entre la curcumina 10 y 20 mM. Sin embargo, para los propósitos de la comparación de los efectos combinatorios de DsiRNA y curcumina (CusiRNA), se utilizó la dosis más baja (10 mM) de la curcumina junto con la dosis óptima (10 nM) de la DsiRNA (Ki-67-7). Los datos mostraron (85%) inhibición casi completa de la viabilidad celular durante el tratamiento combinado de la curcumina y DsiRNA (Fig. 3A y 3B). Control de siRNA no tuvo un efecto significativo sobre la viabilidad celular que sugiere la especificidad de Ki-67-7 en contra de su objetivo.
T-24 (2a) y AY-27 (2b), las células se sembraron en placas de 12 pocillos (0,8 × 10
5 células /pocillo) y se cultivaron durante 48 hr (40 a 50% de confluencia) como se describe en Métodos. Después de la exposición a diversas concentraciones de curcumina durante 24 h, las células se lavaron con PBS y se incubaron durante otras 24 h en medio libre de curcumina. Las células incubadas con DMSO (0,1%) solo fueron tratados como controles. DMSO solo tenía poco impacto en el crecimiento de células tumorales (datos no mostrados). La proliferación celular se evaluó sobre la base de la viabilidad celular, medida por el ensayo de MTT. La viabilidad celular se expresó como porcentaje de la viabilidad observada en las células de control tratadas con DMSO. Los valores son parte de un representante (de dos) (2a) o 3-8 (media ± S.E) determinaciones (2b).
* P & lt; 0,05,
** P & lt; 0,01,
*** P & lt;. 0.005
Igual número (0,8 × 10
5 células /pocillo) de las células de cáncer de vejiga T-24 (3a) y AY-27 (3b) se cultivaron como se describe en Métodos fueron ya sea transfectada con Ki-67-7 o de control DsiRNA (10 nM) o tratado con el reactivo de transfección solo durante 24 h. Posteriormente, donde se indica, se añadió la curcumina (10 M) a las células y se incubó durante 24 h seguido por 24 h adicionales de incubación en ausencia de curcumina. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de MTT en el extremo de 72 h de la transfección. Las células tratadas con DMSO plus reactivo de transfección sirvieron como el control. Los datos presentados son la media ± S.E de 3-5 determinaciones (
* P & lt; 0,05,
** P & lt; 0,01). 3c) AY-27 células (0,8 × 10
5 células /pocillo) fueron tratados exactamente como se describe anteriormente en la leyenda para las Figuras 3A y 3B y al final de las 24, 48 y 72 h después del tratamiento curcumina (que es la misma que 48, 72 y 96 h después de la transfección de ARNsi), el crecimiento celular se evaluó basado en el número de células como se describe en Métodos. Los datos son la media ± S.E de tres determinaciones.
El efecto antiproliferativo se determinó también mediante el control de la curva de crecimiento celular. Las curvas de crecimiento basadas en el número de células se determinaron a los 24, 48 y 72 horas después de DsiRNA y tratamiento de cúrcuma. El tratamiento combinado (CusiRNA) dio lugar a una marcada inhibición de la proliferación celular e imitó la misma tendencia que la de los estudios de viabilidad celular (Fig. 3C). Los valores de las proteínas celulares también se correlacionan bien con las curvas de crecimiento (datos no mostrados).
Efectos de Ki-67-7 y la curcumina sobre Ki-67 ARNm y proteínas expresión
Para determinar si la reducción en la viabilidad de células tumorales durante el tratamiento CusiRNA estaba relacionada con los niveles de proteína Ki-67, que mide los niveles tanto de Ki-67 ARNm y la expresión de proteínas. Los datos muestran las reducciones en los niveles de Ki-67 ARNm de 17%, 37% y 57% cuando se expone a la curcumina, Ki-67-7 y CusiRNA respectivamente (Fig. 4A). Del mismo modo, utilizando la técnica de tinción de inmunofluorescencia, se observó que a diferencia de Ki-67-7, la curcumina
per se
tenido un impacto mínimo en Ki-67 expresión de la proteína (Fig. 4B).
a) AY -27 células fueron tratadas con Ki-67 siRNA en presencia o ausencia de la curcumina exactamente como se describe en la leyenda para las Figuras 3A y 3B. Al final del tratamiento, se extrajo el ARN y Ki-67 expresión de ARNm se determinó por PCR cuantitativa utilizando β-actina como patrón interno tal como se describe en Métodos. los niveles de ARNm de Ki-67 se expresan como porcentaje de la tasa de expresión en células de control que se trataron con reactivo de transfección y DMSO. Las barras indican los valores que son la media ± S.E de tres determinaciones. b) células AY-27 se cultivaron en cubreobjetos de vidrio colocados en el interior placas de 12 pocillos y se trataron con siRNA (Ki-67-7), la curcumina o como una combinación, como se describe en la leyenda de las figuras 3A y 3B. Al final del período de tratamiento, las células fueron expuestas a Ki67 anticuerpo primario (M19) y el anticuerpo secundario marcado con FITC seguido de PI (yoduro de propidio), y se observaron bajo microscopía confocal como se describe en Métodos. La barra de escala inserta = 5 micras. El aumento de la baja regulación de la proteína Ki-67 debido a Ki-67-7 se observó.
inducción de la apoptosis por Ki-67-7 y curcumina
La pérdida de la viabilidad celular es a menudo el resultado de la apoptosis o necrosis. La extensión de la apoptosis, un indicador temprano de la muerte celular, se cuantificó por análisis de citometría de flujo utilizando anexina V para detectar las diferentes etapas de la apoptosis (Fig. 5). Los datos sugieren la inducción suave de la apoptosis cuando las células se trataron por separado con la curcumina o Ki-67-7. Sin embargo, se encontró que la extensión de la apoptosis (la derecha dos cuadrantes de la Fig. 5) en presencia de CusiRNA ser sinérgico (36% vs 13% para la curcumina y 14% para Ki-67-7) después de corregir para la apoptosis línea de base ( 11%) en las células control (Fig. 5). La figura también indica (cuadrante superior izquierdo en la Fig. 5) que la extensión de la necrosis celular (anexina V negativa, 7AAD positivo) fue mínimo durante todas las condiciones de tratamiento.
células AY-27 fueron tratadas con anti -Ki-67 siRNA, la curcumina o en la presencia combinada de ambos como se describe en la leyenda para las Figuras 3A y 3B. Al final del período de tratamiento, se recogieron las células, se tiñeron con fluorescencia conjugado con Anexina V y 7AAD como se describe en Métodos. Tras el análisis de citometría de flujo, el porcentaje (número insertos en la figura) de las células normales o los sometidos a la apoptosis y la necrosis se calculó usando el software apropiado (Flow Jo v.9). La tasa de apoptosis se midió mediante la adición de los porcentajes en la derecha dos cuadrantes en cada una de las figuras. Los datos son de un representante (de dos idénticos) experimento.
Ki-67-7 y la curcumina en fases del ciclo celular
El efecto de Ki-67-7 en el ciclo celular se determinó en la presencia o ausencia de la curcumina. Los datos muestran un cambio general en la dirección de la fase G0 /G1 en todas las condiciones de tratamiento, pero el efecto fue máximo en la presencia de CusiRNA (Fig. 6). No hubo ningún cambio significativo en la fase G2 /M cuando se exponen por separado a cualquiera de la curcumina o Ki-67-7, pero no se observó una disminución del 33% cuando las células fueron expuestas a CusiRNA. Curiosamente, con un aumento en G0 /G1 y la disminución de G2 /M fases, se produjo un cambio de dos veces (relación de G0 /G1 a G2 /M) hacia la detención del crecimiento en presencia de CusiRNA comparación con el control (Fig. 6 ).
AY-27 células fueron tratadas con Ki-67-7, la curcumina o con ambos, como se describe anteriormente en la leyenda para las Figuras 3A y 3B. Al final del periodo de incubación, las células se trataron con PI y la distribución de células en varias fases del ciclo celular se determinaron por citometría de flujo como se describe en Métodos. Las células se puntuaron como la distribución de porcentaje de células en cada una de las fases del ciclo celular (G
O /G
1, S y G2 /M). Las barras indican los valores que son la media ± EE de tres determinaciones
Efecto de Ki-67-7 y la curcumina en la señalización múltiple:. Dianas moleculares en el ciclo celular y la apoptosis
La inhibición de la la progresión del ciclo celular, inducción de apoptosis o una combinación de ambos, son los principales acontecimientos relacionados con la inhibición de tumores. Los datos presentados anteriormente sugieren claramente que una combinación de curcumina y Ki-67-7 afectan tanto a los eventos. Con el fin de comprender el papel de algunos de los intermedios moleculares que puedan afectar a estos eventos, se determinó los niveles de algunas de las proteínas reguladoras asociadas con la apoptosis y la progresión del ciclo celular. Los niveles elevados de escindido con caspase3 por análisis de transferencia Western confirmó la inducción de apoptosis, que fue más pronunciado en el grupo CusiRNA (Fig. 7). Sin embargo, hubo una marcada reducción en los niveles de la proteína supresora de tumores, p53, en el mismo grupo. Las ciclinas D1 y E, las proteínas asociadas con la transición G1-S en las fases del ciclo celular, fueron también profundamente inhibidos por CusiRNA. Como era de esperar, la reducción de la ciclina D1 se asocia con una reducción en los niveles de pRb-P. Reducción de p53 también se asoció con una reducción de p21, un inhibidor de la ciclina E. Sin embargo, fue el aumento de la proteína p27, otro inhibidor de la ciclina E que parecía que se correlaciona bien con la inhibición de la ciclina E en el grupo CusiRNA. Estas observaciones fueron similares en ambos tipos de células. Por otra parte, la inhibición del factor de transcripción NF-kappa B era más atribuible al tratamiento curcumina en células AY-27, mientras que en células T-24, se inhibe principalmente por CusiRNA.
células de cáncer de vejiga (T -24 y AY-27) se cultivaron y expuestos a Ki-67-7 y curcumina como se describe anteriormente en la leyenda para las Figuras 3A y 3B. Al final del período de tratamiento, la proteína total se extrajo y se sometió a transferencia Western utilizando anticuerpos apropiados como se describe en Métodos. Para los fines de la asociación de proteínas con funciones específicas, que se agrupan en categorías diferentes, tales como la transcripción de genes (A), la progresión del ciclo celular (B) y la apoptosis (C). β-actina se utilizó como control interno. Desde se identificaron diferentes proteínas (por ejemplo, ciclina D1 y NF-kB) de la misma membrana en categorías diferentes, la misma transferencia β-actina se muestra en más de una ocasión. Los datos presentados son transferencias Western de un solo experimento, que es representativo de 2-3 experimentos idénticos.
Discusión
Carcinoma de células transicionales (TCC) de la vejiga urinaria es la más común cáncer en el sistema urinario.