Extracto
Las nanopartículas de oro (PNB) han mostrado prometedoras aplicaciones médicas en el tratamiento del cáncer implicado en la regulación del equilibrio redox intracelular. Anteriormente, hemos informado de que PNB pueden desencadenar la apoptosis y necrosis en células de cáncer de pulmón humano (A549) cuando se usó L-butionina-sulfoximina (BSO) para disminuir la expresión de glutatión intracelular (GSH). En esto, se determinó la citotoxicidad de los PNB hacia las células del cáncer de pulmón en el marco del glutamato cisteína ligasa subunidad catalítica (GCLC) fue silenciado por siRNA. Nuestros resultados mostraron que PNB causan apoptosis y necrosis en células transfectadas con siRNA GCLC mediante la elevación de especies reactivas de oxígeno intracelulares (ERO). Estos resultados demostraron que la regulación de la síntesis de glutatión por GCLC siRNA en células A549 puede iniciar la citotoxicidad inducida por nanopartículas de oro
Visto:. Liu M, Y Zhao, Zhang X (2015) Derribo de glutamato cisteína ligasa catalítica Subunidad Causas de siRNA la citotoxicidad inducida por nanopartículas de oro en las células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 10 (3): e0118870. doi: 10.1371 /journal.pone.0118870
Editor Académico: Pedro V. Baptista, Universidad Nova de Lisboa, Portugal
Recibido: 25 Octubre, 2014; Aceptado: January 11, 2015; Publicado: 19 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81102468 a Y. Zhao). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Recientemente, el interés en las nanopartículas de oro (PNB) para el diagnóstico y la terapia del cáncer, tales como vehículos de administración de fármacos [1], los teléfonos vectores de abordaje [2], imágenes [3], radiosensibilización [4-7], y las terapias de ablación no invasivos [8, 9], ha crecido de manera significativa. PNB ofrecen ventajas en estas aplicaciones debido a su excelente biocompatibilidad [10], la fuerte absorción de la luz y el efecto de dispersión [11], la tasa de conversión fototérmica y alta fotoestabilidad [12-14], bioconjugation fácil y biomodificación [15]. Además, el uso de los PNB como agentes contra el cáncer ha sido ampliamente estudiado. Se han hecho varios intentos de incorporar PNB en tratamientos contra el cáncer.
glutatión reducido (GSH), el más abundante de tiol intracelular, es importante en el mantenimiento del equilibrio redox intracelular y está implicado en la desintoxicación de sustancias exógenas y endógenas tales como xenobióticos, radiación ionizante, peróxidos orgánicos y metales pesados [16,17]. Se ha demostrado que un tumor agresivo puede ser sensible a los medicamentos mediante el uso de una terapia basada en la modulación de los niveles de GSH en las células del cáncer [18]. Es bien conocido que el glutatión se sintetiza a partir de sus aminoácidos constituyentes en dos secuencial, catalizada por la sintetasa glutamilcisteína (GCL) y GSH sintasa. GCL consiste en una subunidad catalítica (GCLC) y una subunidad modulador (GCLM), que cataliza la primera y la tasa de limitación de paso y desempeña un papel clave en la homeostasis del glutatión [19]. Los niveles de GSH intracelular se pueden agotar a través de la inhibición específica de GCL. L-butionina-sulfoximina (BSO), un inhibidor de GCL, se conoce a agotar la piscina intracelular de glutatión y de ese modo causar estrés oxidativo [20]. Las alteraciones en las actividades específicas de las enzimas implicadas en el metabolismo de GSH en las células cancerosas han sido implicados en el estrés oxidativo y el agotamiento en GSH pueden aumentar la susceptibilidad de las células cancerosas a otros eventos nocivos [21-23]. Hemos informado anteriormente de que los PNB pantalla citotoxicidad para las células de cáncer de pulmón cuando se usó L-butionina-sulfoximina (BSO) para disminuir la expresión de glutatión intracelular [24]. Por lo tanto, las nanopartículas de oro se pueden emplear como agentes terapéuticos potenciales mediante la regulación de los niveles de glutatión en las células cancerosas. Mientras, BSO es una clase de compuestos exógenos. La influencia de la BSO sobre la función de células es impredecible. En el presente trabajo, se evaluó el efecto de siRNA GCLC de citotoxicidad inducida por PNB en células de cáncer de pulmón.
Hasta donde sabemos, no existe un estudio sobre la evaluación de las funciones de GCLC siRNA en la muerte celular inducida por PNB. El objetivo principal de este estudio es caracterizar la citotoxicidad de los PNB en las células de cáncer de pulmón cuando GCLC fue derribado por siRNA.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
células A549 (Shanghai Banco de células, Tipo Comité Colección Cultura, Academia de Ciencias de china, el número de gatos: TCHu150) se mantuvieron en suero RPMI-1640 que contenía 4,5 g /L de glucosa del medio, 2 mM de L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 10% inactivado por calor fetal bovino (FBS), 100 U /ml de penicilina y 100μg /ml de estreptomicina. Las células fueron cultivadas en 5% de CO
2 a 37 ° C en una atmósfera húmeda.
La transfección de siRNA en la línea celular A549
El silenciamiento génico de GCLC se realizó con un sistema de siRNA desmontables . Un control no siRNA dúplex [5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '], GCLC siRNA-1 dúplex [5'-GCUAAUGAGUCUGACCAUU (dTdT) -3'], GCLC siRNA-2 dúplex [5'-CUAUGUGGUGU UUGUGGUA (dTdT) - 3 '] y GCLC siRNA-3 dúplex [5'-GUAGUAUUCUGAACUACCU (dTdT) -3'] fueron adquiridos de Sigma-Aldrich. En resumen, las células A549 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 1,5 × 10
5 por pocillo. El día siguiente, las células (~ 60-70% de confluencia) en cada pocillo se transfectaron con el control negativo, GCLC siRNA (75pmol en libre de FBS RPMI1640) utilizando Thermo Scientific DharmaFECT Transfección reactivos (Thermo Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un día después, el medio se cambió a medio de crecimiento normal y se cultivaron las células durante 48 horas adicionales. Se recogieron las células transfectadas y se utilizan para la PCR, Western blot, y los niveles de GSH medición [25-27].
Preparación de ARN y RT-PCR semicuantitativa
RT-PCR semicuantitativa con β- actina como control interno se realizó para examinar la alteración en la expresión de mRNA de GCLC en células A549 transfectadas con siRNAs. El ARN total se extrajo usando el reactivo Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante [28]. El ARN aislado (2μg) a partir de células tratadas siRNAs se transcribió de forma inversa en ADNc de cadena sencilla en una mezcla de reacción que contiene: 10 mmol /L de imprimación dNTP, 1μg oligo (dT), y 200 UI 20IU RNasin M-MLV transcriptasa inversa. La amplificación por PCR se llevó a cabo con cDNA 0.4μg en un volumen de reacción que contiene 3pmol de cada cebador específico de oligonucleótido, 10 mmol /L dNTP, y Taq ADN polimerasa 1.5IU. Para todas las reacciones, se realizaron experimentos preliminares para determinar el número de ciclos de PCR en las que se produjo la saturación, y los experimentos mencionados se llevaron a cabo con un número de ciclos que preceden a la saturación. Las secuencias de los cebadores para GCLC y expresión β-actina análisis fueron: GCLC, cebador directo: 5'-TCCAGGTGACATTCCAAGCC-3 '; cebador inverso: 5'-GAAATCACTCCCCAGCGACA-3 '. La unidad termociclador se programó para 36 ciclos a 95 ° C durante 30 segundos, 60 ° C durante 30 segundos, y 72 ° C durante 30 segundos. β-actina, cebador directo: 5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3 '; cebador inverso: 5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3 '. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 2% (Sigma-Aldrich) y se visualizaron después de la tinción con bromuro de etidio sobre la luz UV [29].
Western Blot
Para la detección GCLC, las células cultivadas en seis placas -bien se incubaron con duplex control negativo y duplex GCLC siRNA durante 24 horas, después se cultivaron con medio de crecimiento normal durante 48 horas adicionales. Posteriormente, las células se lavaron con PBS, se tripsinizaron y recogieron por centrifugación. Una cantidad de proteína de 30μg de cada muestra se mezclaron con tampón de carga, se incubaron a 100 ° C durante 5 minutos y se separaron en un SDS-PAGE 10%. A continuación, las muestras se transfirieron a un (fluoruro de polivinilideno) membrana de PVDF y se bloquearon con 5% (w /v) de leche descremada en disolvió en TBS + 0,05% (v /v) de Tween-20 (TBST) durante una hora a temperatura ambiente y se probaron con GCLC (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), o β-actina (1: 2.000, Santa Cruz Biotechnology) a 4 ° C durante la noche. A continuación, las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario (1: 4.000 anti-conejo, Cell Signaling Technology) durante una hora, se lavó 3 veces con TBST y las bandas se visualizaron usando el reactivo ECL (Thermo Scientific) [30]
.
Los niveles totales de glutatión intracelular (GSH): perfil
contenido de GSH celular se analizó utilizando glutatión kit de cuantificación (Beyotime Instituto de Biotecnología). 5, 5'-ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) y GSH reaccionan para generar 2-nitro-5-tiobenzoico ácido y disulfuro de glutatión (GSSG). Dado que el ácido 2-nitro-5-tiobenzoico es un producto de color amarillo, la concentración de GSH en las muestras se puede medir a 412 nm de absorbancia con un lector de placa de múltiples pocillos. En resumen, las células fueron transfectadas con control negativo o tres duplex GCLC siRNA durante 24 horas, a continuación se cultivaron en medio de crecimiento normal durante 48 horas adicionales. Al final del tratamiento, se recogieron las células y después se sedimentaron por centrifugación a 1000 rpm durante 5 min, se resuspendieron en tampón de lisis que contiene 0,2% de Triton X-100. Los lisados celulares se centrifugaron a 13.000 g durante 10 min a 4 ° C, y los sobrenadantes se utilizaron para la determinación de las concentraciones de glutatión total. agotamiento de GSH en las células tratadas GCLC siRNA se indicó [31].
citotoxicidad medición
La citotoxicidad se determina a través de recuento de células. Hemos observado que la inhibición de la GCLC siRNA-1duplex es el más significativo entre los tres duplex GCLC siRNA. Por lo tanto, las células A549 fueron incubadas con control negativo o siRNA-1-GCLC específico y, a continuación expuestos a diferentes dosis de PNB durante 72 horas adicionales. Finalmente, las células se lavaron con PBS, se tripsinizaron con solución de tripsina /EDTA, y se resuspendieron a un volumen final de un medio de células 2 ml para una mayor medición de la viabilidad celular. El número de células en cada muestra se contaron bajo un microscopio utilizando una cámara de Set Counting (Qiujing Inc) [32].
intracelular de especies reactivas de oxígeno medida
La producción de ROS se midió usando 2, diacetato fluorescente 7-dichlorodihydro (DCFH-DA, Beyotime Instituto de Biotecnología). DCFH-DA entra pasivamente las células, esterasas celulares actúan sobre la molécula para formar el resto no fluorescente DCFH, que es de naturaleza iónica y, por tanto, atrapado dentro de las células. Una reacción con ROS conduce a una oxidación de DCFH a la dichloroflourescein compuesto altamente fluorescente (DCF). Brevemente, las células cultivadas en placas de 6 pocillos se transfectaron con el control negativo, GCLC siRNA-1 utilizando Thermo Scientific Dharma FECT transfección reactivos. Un día después, las células fueron tratadas con 20μM (PNB), PNB (20μM) y GSH exógeno (1 mM) o PNB (20μM) y ROS eliminador de N-acetil-L-cisteína (NAC, 1 mM) por un importe adicional de 72 h. Luego, las células se lavaron con PBS tres veces y posteriormente tratadas con 10μM DCFH-DA. Después se incubaron durante 30 minutos, las células se tripsinizaron, se recogió por centrifugación y se resuspendieron en PBS. La intensidad de fluorescencia de las células (50 000) de cada pocillo se midió con un espectrofotómetro de fluorescencia (Thermo Scientific), con longitudes de onda de excitación y emisión de 488 y 525 nm, respectivamente [33].
análisis de citometría de flujo de la apoptosis y necrosis
resultado de recuento de células mostró que tenía PNB función inhibidora sobre la supervivencia de las células transfectadas. Hemos investigado si el motivo de esta inhibición es o bien la apoptosis temprana o tardía de la apoptosis /necrosis. Estos efectos se determinaron con isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con AnnexinV y tinción PI (Invitrogen) por el análisis de citometría de flujo. Las células transfectadas se trataron con PNB, PNB y GSH, PNB y NAC. Después de 72 h, se recogieron las células y se lavaron dos veces con PBS, se incubaron con AnnexinV-FITC y PI durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Apoptóticas y células necróticas se evaluaron por citometría de flujo. Al menos 1 × 10
4 se analizaron las células por muestra, y la configuración de cuadrantes se basaron en las muestras de control. Las células vivas son negativos tanto para yoduro de propidio (PI) y Anexina V, las células apoptóticas son principios negativo PI, pero AnnexinV positivo, mientras que las células apoptóticas /necróticas finales son positivas para ambos PI y AnnexinV. Todo citometría de flujo análisis se realizaron utilizando el software disponible comercialmente Cell Quest (BD Bioscience).
potencial de membrana mitocondrial e intracelular exfoliados caspasa-3 ensayo
JC-1 (5, 50, 6, 60-tetracloro-1, 10, 3, yoduro de 30-tetraethylbenzamidazolocarbocyanin, Beyotime Instituto de Biotecnología) se utilizó para evaluar el cambio en el potencial de membrana mitocondrial, como se describe anteriormente [24]. células A549 en la fase de crecimiento logarítmico se sembraron en placas de cultivo celular de 6 pocillos y se incubaron durante 24 horas, y a continuación, transfectadas con el control negativo o siRNA-1 GCLC-específico. Las células transfectadas se trataron con o sin PNB (20μM) durante 72 horas, posteriormente se recogieron y se incubaron con JC-1 durante 30 minutos en la oscuridad a 37 ° C las células. Después de la tinción, las células se lavaron dos veces con PBS y se analizaron por citometría de flujo [34].
Para intracelular exfoliados caspasa-3, se recogieron y se fijaron con paraformaldehído al 4% de las células transfectadas que se trataron con o sin PNB. Después se trató con 0,1% Triton X-100 y se bloqueó con 1% de BSA, las células se incubaron con anticuerpo exfoliados caspasa-3 (Asp175) (Alexa Fluor 488 conjugado, Cell Signaling Technology) durante 30 minutos. A continuación, las células teñidas se analizaron mediante citometría de flujo [24].
El análisis estadístico
Se evaluaron las diferencias estadísticas mediante análisis de la varianza (ANOVA) y la prueba T de Student con el software Prism (GraphPad Software, Inc.). P & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo, y los datos fueron marcados con (*) para p & lt; 0,05, (**) para p & lt; 0,01, y (***) para p & lt; 0,001, respectivamente. Cada grupo se analizó por triplicado, y todos los experimentos se realizaron al menos tres veces.
Resultados
La eficacia de siRNAs contra las subunidades catalíticas GCL
Para investigar el efecto de la caída tres secuencias de 19-nucleótidos para las subunidades catalíticas de GCL, las células A549 fueron transfectadas con control negativo o GCLC siRNA durante 24 horas, seguido por cultivaron durante 48 horas más en medio de crecimiento normal. Se realizó semicuantitativo análisis de RT-PCR para examinar la expresión GCLC mRNA. Los niveles de mRNA de GCLC se redujeron significativamente en células A549 transfectadas con siRNA GCLC. Por el contrario, el control negativo siRNA fue menos potente (Fig. 1A). En todas las células transfectadas con siRNA GCLC, los niveles de mRNA de GCLC fueron homogéneos y sin una desviación significativa. Mientras tanto, se estimó la eficacia de la GCLC siRNA ensayando su capacidad para interferir con las proteínas expresadas por Western blot. Como se muestra en la Fig. 1B, GCLC siRNA inhibió significativamente la expresión de la proteína GCLC en células A549. Los tres tipos de siRNA para las subunidades catalíticas GCL diferencialmente interrumpe la expresión de la GCLC en comparación con el control negativo siRNA y la GCLC siRNA-1 fue uno de los más eficaces.
(A) los niveles de mRNA en GCLC células A549 después de 24 horas transfectadas con siRNA control negativo, GCLC siRNA-1, GCLC siRNA-2 y GCLC siRNA-3. GCLC siRNA redujo significativamente los niveles de mRNA GCLC en las células A549. (B) los documentos representativos de gel de Western Blot para GCLC y datos resumidos que muestran que la eficiencia del silenciamiento génico de GCLC de siRNA. proteínas citosólicas se aislaron a partir de células transfectadas. los niveles de proteína GCLC en extractos de células se midieron mediante análisis de transferencia Western y se normalizaron a beta-actina niveles de expresión. *** P & lt;. 0.001, en comparación con el control negativo
Efecto de GCLC siRNA en los niveles intracelulares de GSH en las células A549
GCLC es esencial para la biosíntesis de glutatión, que mantiene las concentraciones de glutatión en células intactas. Hemos demostrado que el siRNA dirigidos contra las subunidades catalíticas GCL a disminuir los niveles de mRNA de GCLC e inhiben la expresión de la proteína GCLC en células A549. Para corroborar adicionalmente la especificidad y la eficacia de GCLC siRNA, el efecto de GCLC siRNA en los niveles de GSH intracelular se midió [32]. Como era de esperar, en comparación con el grupo control negativo, GCLC siRNA obviamente disminuyó los niveles de GSH y la GCLC siRNA-1 es el más significativo (Fig. 2), que es la correspondencia con los resultados que hemos observado anteriormente. En vista de estos resultados, se utilizó GCLC siRNA-1 en los próximos experimentos. Knock-down experimentos demostraron que GCLC siRNA influyen en la expresión de GCLC y dieron lugar a una reducción significativa de la producción de GSH.
El citosol se aisló a partir de células transfectadas con siRNA control negativo, GCLC siRNA-1, GCLC siRNA-2 y GCLC siRNA-3. Los niveles de GSH intracelulares se determinaron a 412 nm de absorbancia con un lector de placa de múltiples pocillos. Los datos representan la media del porcentaje de control negativo (n = 3) ± SD para 4 experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** P & lt;. 0,01, en comparación con el control negativo
El GCLC siRNA regula la muerte celular inducida por PNB
El contenido total de GSH se redujo de manera significativa en células A549 transfectadas con siRNA GCLC. Cuando se utilizó BSO para disminuir la expresión de glutatión en las células A549, PNB mostró citotoxicidad evidente a las células [32]. Sin embargo, el efecto de GCLC siRNA sobre la citotoxicidad de los PNB es aún desconocido. A continuación, se investigó si los PNB alteran la supervivencia de células A549 tras la interrupción mediada por ARNsi de la actividad GCLC. Con base en los resultados de los experimentos de la precipitación, las células A549 fueron transfectadas con el control negativo-siRNA o GCLC siRNA-1, y luego expuestas a varias concentraciones de PNB. Como experimento de control, GCLC siRNA no indujo citotoxicidad notable en células A549 (S1 Fig.). Mientras, se observó que los PNB dependiente de la dosis inhibió el crecimiento de las células A549 tratadas previamente con GCLC siRNA-1. En comparación con el grupo control negativo, el tratamiento de células A549 con 50 micras PNB resultó en una disminución significativamente la población de células viables después de ozono GSH intracelular (Fig. 3).
Las células A549 se transfectaron con el control negativo o GCLC siRNA- 1 para 24 horas, seguido por cultivaron durante 3 días adicionales en ausencia de PNB, posteriormente cosecharon y se contaron. Cada barra representa la media (± SD n = 4) de determinaciones por triplicado. * P & lt;. 0,05 frente al control negativo
PNB inducida por citotoxicidad se asocia con la elevación de ROS intracelular en las células tratadas GCLC siRNA
Desde ROS ha sido sugerido como un factor crítico en el determinación de modo de muerte celular. Además, investigó si ROS participan en la regulación de la muerte celular inducida por PNB cuando las células fueron transfectadas con siRNA GCLC. Como se muestra en la Fig. 4, después de silenciamiento de la expresión GCLC con siRNA-1, PNB resultó en un aumento de aproximadamente 7 veces de los niveles de ROS en comparación con la del grupo de control negativo. Sin embargo, cuando las células fueron tratadas con GCLC siRNA solo, la influencia de la producción de ROS no se observó en ausencia de PNB (S2 Fig.). Exógena GSH y NAC suprimió de forma significativa la producción de ROS inducida por PNB, que podría proteger GCLC siRNA células tratadas de la citotoxicidad de los PNB. Estos resultados significan que la citotoxicidad de los PNB está asociado al menos parcialmente con el aumento de los niveles de ROS en GCLC-1 siRNA células pretratadas (Fig. 4).
células en crecimiento exponencial se transfectaron con control negativo y GCLC siRNA- 1 durante 24 horas, transcurridas las tratadas con 20μM (PNB), PNB (20μM) y GSH (1 mM), PNB (20μM) y NAC (1 mM). Se midieron los niveles de ROS. Los gráficos indican ROS (determinado por DCF) los niveles (%) en comparación con células de control negativo. Cada barra representa la media (± SD n = 4) de determinaciones por triplicado. ** P & lt; 0,01
PNB iniciar la apoptosis y necrosis en las células transfectadas con siRNA GCLC
La evidencia de que nosotros PNB inducen la muerte celular y mejoran la producción de ROS intracelulares llevó a examinar más si PNB causan apoptosis y necrosis en las células tratadas GCLC siRNA. tinción dual de las células con anexina V-FITC y PI se utilizó para distinguir las células apoptóticas y necróticas de las células normales. Como se muestra en la Fig. 5, PNB aumentó la proporción de células AnnexinV-manchado cuando los niveles de GSH disminuyeron en un silenciamiento de la expresión GCLC. La población de células positivas PI en total, que comprende la apoptosis y la necrosis, también se incrementó significativamente en GCLC siRNA y PNB células tratadas. El tratamiento con siRNA GCLC por sí solo no aumentó la población de la apoptosis y necrosis en comparación con el grupo control (S3 Fig.). Estos datos mostraron que PNB relativamente afectan Anexina número de células teñidas V-PI en células transfectadas con siRNA GCLC. Para probar si la apoptosis o necrosis se activó por ROS, se empleó el GSH y NAC exógeno. El tratamiento con GSH y NAC tanto suprimió significativamente la aparición de células con anexina V y PI positivas inducidas por PNB en las células tratadas GCLC siRNA (Fig. 5). Estos resultados indicaron que los PNB iniciar la apoptosis y la necrosis mediante la elevación de los niveles intracelulares de ROS en células de cáncer de pulmón tratados previamente con GCLC siRNA.
Las células fueron transfectadas con el control o bien no objetivo siRNA o siRNA-1 GCLC-específico. Un día después, las células fueron tratadas con PNB (20μM), PNB (20μM) + GSH (1 mM) y PNB (20μM) + NAC (1 mM) durante 72 horas adicionales. células AnnexinV-FITC y PI se midieron con citometría de flujo. (A) El patrón de fluorescencia de las células A549 AnnexinV-FITC y PI-manchado después del tratamiento. (B) Los porcentajes de células positivas positivas o PI Anexina V para diferentes tratamientos. Cada barra representa la media (± SD n = 3). ** P & lt; 0,01, *** P & lt;. 0.001, versus control
PNB causan la despolarización del potencial de membrana mitocondrial en GCLC siRNA células tratadas
Debido a la despolarización del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) juega un papel fundamental en la apoptosis [35], se examinó si los PNB alterados potencial de membrana mitocondrial en las células transfectadas con siRNA GCLC-1. La sonda fluorescente JC-1 tinte se utilizó para evaluar el cambio de potencial de membrana mitocondrial y el cambio de fluorescencia (rojo a verde) de las muestras se midió por citometría de flujo. Hemos observado que la PNB causó un aumento en la intensidad de fluorescencia verde /rojo en las células tratadas GCLC siRNA (Fig. 6). Si bien, las células transfectadas con siRNA GCLC en ausencia de PNB no mostraron cambios de potencial de membrana mitocondrial como comparar con el grupo de control (S4 Fig.). Estos resultados indican que la inducción de apoptosis y necrosis por PNB en GCLC siRNA células pretratadas está estrechamente asociado con el potencial de membrana mitocondrial
.
Después transfectadas con ARNsi de control negativo o GCLC siRNA-1, las células se trataron con PNB (20μM ) durante 72 horas adicionales y luego recogidos y teñidas con JC-1 en la oscuridad a 37 ° C, enjuagados por PBS. El cambio de fluorescencia (rojo a verde) de las muestras se midió por citometría de flujo. Cada barra representa la media (± SD n = 4) de determinaciones por triplicado. *
p
. & Lt; 0,05, en comparación con el grupo control negativo
PNB inducen la activación de la caspasa-3 en las células transfectadas con siRNA GCLC
apoptosis
mitocondrial dependiente se inicia por el reclutamiento y la activación de la caspasa [36]. Por lo tanto, nos preguntamos, además, si la caspasa-3 se activa durante PNB indujo apoptosis en células tratadas GCLC siRNA. Cuando la piscina GSH citosólico lábil se agotó por GCLC siRNA, las células se cultivaron con o sin PNB. La activación de la caspasa-3 se midió usando anticuerpos específicos que reconocen la forma particularmente escindido y activados por citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 7, PNB aumentó significativamente la caspasa-3 en las células tratadas actividades GCLC siRNA. GCLC siRNA solo apenas se ve afectada la actividad de Cascase-3 en comparación con el grupo control (S5 Fig.). Por lo tanto, PNB indujo apoptosis principalmente a través de la ruta de la caspasa mitocondrial dependiente.
La activación de la caspasa-3 se midió usando anticuerpos específicos por citometría de flujo. Intracelular GSH se agotó por GCLC siRNA-1, después de aproximadamente 72 horas de tratamiento PNB, se recogieron las células, se trataron con 0,1% Triton X-100 y se bloquearon con 1% de BSA, después se incubaron con anticuerpo exfoliados caspasa-3 (Asp175) ( Alexa Fluor 488 conjugado) durante 30 minutos. La intensidad de fluorescencia se midió por citometría de flujo. Cada barra representa la media (± SD n = 4) de determinaciones por triplicado. *
p
. & Lt; 0,05, en comparación con el grupo control negativo
Discusión
Durante los últimos años, la inducción de apoptosis debido a alteraciones en el estado redox intracelular por cierto oxidativa o no oxidativa estímulos se ha convertido en un foco de la investigación extensa [23, 25, 37, 38]. ROS y GSH son los dos principales factores determinantes del equilibrio redox celular. ROS a menudo causan daño celular y conducen a la muerte celular, especialmente a alta concentración. Farmacológico agotamiento GSH por BSO altamente sensibiliza a las células tumorales a la apoptosis inducida por agentes quimioterapéuticos. Por lo tanto, la manipulación del estado redox celular representa una estrategia viable para la inducción de apoptosis por agentes anti-cáncer. Mientras tanto, las nanopartículas de oro en el diagnóstico y tratamiento del cáncer se han convertido en el punto caliente de investigación internacional. Anteriormente, hemos encontrado que la ruta metabólica de GSH está directamente implicado en la detoxificación de los PNB [24]. Cuando la expresión intracelular de GSH fue inhibida por BSO, la citotoxicidad de los PNB era evidente. PNB inducir la muerte celular mediante la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) en las células A549 con bajos niveles de glutatión intracelular [24, 32]. Geng F y sus colegas han informado de que la interacción de la radiación de rayos x con PNB indujo niveles elevados de la producción de ROS es uno de los mecanismos por los que los PNB pueden mejorar la radioterapia en el cáncer de ovario [39]. El estrés oxidativo contribuye a oro citotoxicidad de nanopartículas inducida en la leucemia humana (HL-60) y las células de hepatoma (HepG2) [40]. Estos resultados proporcionaron pruebas claras de que se pueden emplear PNB no sólo como portadores sí mismos, sino también como potenciales agentes terapéuticos, explotando su capacidad para disminuir la expresión intracelular de GSH y generar respuestas citotóxicas. En este estudio, adoptamos GCLC-siRNA para inhibir la expresión de GCLC y dar lugar a una disminución significativa en la producción de GSH, a continuación, se detectó la citotoxicidad de los PNB. Después del tratamiento con siRNA GCLC, ROS se detectó en presencia de PNB en células A549. El resultado mostró que PNB pueden afectar los niveles de ROS en células tratadas GCLC siRNA. GSH y NAC pueden eliminar el ROS para neutralizar la citotoxicidad de los PNB en células de cáncer de pulmón transfectadas con siRNA GCLC. Estos resultados acusados que después derribando de GCLC por siRNA, ROS atribuirse a la muerte celular inducida por PNB en células de cáncer de pulmón.
Se sabe que las vías de muerte celular divergentes coexisten en células de mamífero y su activación depende de la tipo y la intensidad del estímulo. Mucha importancia se le ha dado a la muerte de las células apoptóticas y necróticas en la terapia antitumoral [41-44]. Múltiples modos de muerte celular son inducidas al mismo tiempo en las células de cáncer de pulmón PNB-expuestas con baja GSH intracelular, incluyendo la apoptosis y la necrosis. Hemos observado que la PNB puede inducir la apoptosis y la necrosis simultáneamente cuando el GCLC fue silenciada por siRNA en células de cáncer de pulmón. Estos hallazgos sugieren que tanto la apoptosis y la necrosis son importantes mecanismo de la muerte celular inducida por PNB.
Para concluir, las nanopartículas de oro y juegan más papel más importante en la aplicación de la investigación anti-tumoral. Las nanopartículas de oro una vez conjugados con siRNA-GCLC específica pueden inducir eficazmente la muerte de las células tumorales. Se necesitan estudios sin embargo, más extensas y animales de diferentes especies animales a tomar hallazgos de esta investigación para ensayos clínicos.
Apoyo a la Información
S1 Fig. Efecto de GCLC siRNA sobre la supervivencia celular en células A549.
Las células fueron sembradas antes transfectadas con siRNA GCLC, y después se cultivaron en medio de crecimiento normal. El número de células se contaron a intervalos de 48 h para células de viabilidad. Cada barra representa la media (± SD n = 3) de determinaciones por triplicado
doi:. 10.1371 /journal.pone.0118870.s001 gratis (TIF)
S2 Fig. la producción de ROS en las células A549 transfectadas con siRNA GCLC.
Las células cultivadas en placas de 6 pocillos se transfectaron con el control negativo o GCLC siRNA. Un día después, las células se cultivaron en medio de crecimiento normal para adicional de 48 h y posteriormente tratadas con 10μM DCFH-DA. La intensidad de fluorescencia de las células se midió con un espectrofotómetro de fluorescencia. Las barras representan la media (± n = 3) de determinaciones por triplicado
doi:. 10.1371 /journal.pone.0118870.s002 gratis (TIF)
S3 Fig. Apoptótica y necrótica respuesta de las células A549 transfectadas con siRNA GCLC.
Después desmontables de expresión GCLC, las células se tiñeron con Anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) y se analizaron por citometría de flujo. Los resultados de citometría de flujo representativos se muestran como gráfico de puntos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0118870.s003 gratis (TIF)
S4 Fig. Efecto de GCLC siRNA en el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) en células A549.
Las células tratadas con el control negativo o GCLC siRNA se tiñeron con JC-1 durante 20 min a 37 ° C. a continuación se detectó el cambio de fluorescencia (rojo a verde) de muestras de citometría de flujo. Los datos representan la media (± SD n = 3) de tres experimentos independientes
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S5 Fig. Efecto de GCLC caída en la actividad de la caspasa-3 en células A549.
Veinticuatro horas después de la transfección con el control negativo o GCLC siRNA, las células se mantuvieron en medio de crecimiento normal durante 48 horas adicionales. Caspasa-3 actividades en las muestras se determinaron utilizando anticuerpo exfoliados caspasa-3 (Asp175) (Alexa Fluor 488 conjugado) por citometría de flujo. Los valores se expresan como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes
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Agradecimientos Los autores agradecen> Dr. Xiaohu Gu y el profesor Ding Yi de la Facultad de Química de la Universidad de Shandong e Ingeniería Química, para apoyar las nanopartículas de oro.