Extracto
La sobreactivación de la vía Wnt /β-catenina en los tejidos adultos se ha implicado en muchas enfermedades, tal como cáncer colorrectal. Encontrar a sustancias químicas que pueden prevenir este fenómeno es un problema emergente. Recientemente, varios compuestos naturales se han descrito como inhibidores de Wnt /β-catenina y podrían ser agentes prometedores para el control de la carcinogénesis. A continuación, describimos dos sustancias naturales, derricin y derricidin, pertenecientes a la subclase chalcona, que muestran la inhibición de la transcripción potente de la vía /β-catenina vía. Ambos chalconas son capaces de afectar a la distribución celular de β-catenina, e inhibir la actividad de reportero Wnt-específica en células HCT116 y en
Xenopus
embriones. Derricin y derricidin también inhibió fuertemente la actividad de Wnt canónica
in vitro
, y rescataron el fenotipo doble eje inducida por Wnt en
Xenopus
embriones. Como consecuencia de la inhibición /β-catenina Wnt, los tratamientos derricin y derricidin reducir la viabilidad celular y conducen a la detención del ciclo celular en líneas celulares de cáncer colorrectal. Tomados en conjunto, nuestros resultados apoyan firmemente estos chalconas como nuevos moduladores negativos de la /vía β-catenina y el crecimiento de células de cáncer de colon Wnt
in vitro
Visto:. Fonseca BF, Predes D, Cerqueira DM, Reis AH, Amado GN, Cayres MCL, et al. (2015) y Derricin Derricidin de inhibición de Wnt /β-catenina y reprimir Colon Cancer Cell Growth
in vitro
. PLoS ONE 10 (3): e0120919. doi: 10.1371 /journal.pone.0120919
Editor Académico: Chunming Liu, de la Universidad de Kentucky, Estados Unidos |
Recibido: 25 Junio, 2014; Aceptado: 9 Febrero 2015; Publicado: 16 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Fonseca et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
financiación:. Este estudio fue financiado por agencias brasileñas de financiación Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico, Fundación de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro, y la Coordinación de Perfeccionamiento de Personal de Nivel Superior .
Conflicto de intereses: los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
señalización de Wnt /β-catenina es la principal causa de muchas neoplasias diferentes, y tiene. una estrecha asociación con el cáncer colorrectal (CCR). Aproximadamente el 80% de todos los CRCs tiene mutaciones en los componentes de Wnt, lo que resulta en la sobreactivación de la vía en las células del colon. Las mutaciones más comunes resultan en la pérdida de la función APC que son reguladores negativos de esta vía de señalización; y la ganancia de función mutaciones en β-catenina, la principal proteína efectora de esta señalización [1,2,3,4]. Estas mutaciones causan la sobreexpresión no controlada de varios oncogenes y genes del ciclo celular, particularmente en células derivadas de las criptas intestinales [5].
CRC es una enfermedad maligna con alta prevalencia, y el tercer cáncer más comúnmente diagnosticado en el mundo [6]. Es difícil de tratar; cirugía y adyuvante fármacos se usan comúnmente, pero curan sólo un pequeño porcentaje de los tumores [7]. CRC está fuertemente asociada con trastornos genéticos, lo cual es resultado de mutaciones en el ciclo celular y la apoptosis importante genes reguladores, como KRAS, BRAF y TP53 [8]. Además, CRC también puede ser resultado de los patrones nutricionales humanos. Se ha demostrado que el alto consumo de alimentos de origen vegetal está relacionada con una reducción de la incidencia de CCR, debido a las grandes cantidades de compuestos antitumorales naturales, tales como flavonoides y otros polifenoles [7,9].
Los flavonoides son compuestos polifenólicos encuentra en muchas plantas y tienen una amplia gama de efectos biológicos. Debido a que los flavonoides son una gran parte de la dieta humana, han sido intensamente estudiado en cuanto a sus efectos beneficiosos en muchas enfermedades humanas, tales como el cáncer. Tienen efectos antiproliferativos, anti-invasivos y pro-apoptóticos [10,11,12]. Muchos flavonoides descritos como inhibidores de Wnt tienen efectos interesantes sobre el control CRC y también contribuyen a la prevención de esta enfermedad [13,14,15,16,17]. El EGCG flavonoides quercetina y se han reportado como fármacos contra el cáncer prometedores [18,19]. Entre los efectos de estos flavonoides es la regulación de las vías que están estrechamente relacionados con el cáncer, tales como la señalización de Wnt /β-catenina señalización, aunque ninguno de ellos ha tenido éxito como un fármaco eficaz para el tratamiento del cáncer.
A continuación, se investigó el efecto de dos flavonoides poco conocidos, y derricin derricidin, que se extrajeron del
Lonchocarpus sericeus
[20]. Derricin y derricidin son capaces de reducir el crecimiento de CRC
in vitro
, mediante el control de la progresión del ciclo celular. Por otra parte, derricin y derricidin doble eje inducida por Wnt8 inhibió fuertemente en
Xenopus
embriones, lo que indica claramente que estos flavonoides son moduladores de la vía /β-catenina vía.
Materiales y Métodos
celulares, productos químicos y reactivos
Todos los reactivos de cultivo celular fueron adquiridos de Gibco-Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). Sulfóxido de dimetilo (DMSO) y anti-β-catenina se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). Los anticuerpos secundarios fueron adquiridos de Life Technologies (CA, USA). Las líneas celulares utilizadas fueron HEK293T, células L, L-Wnt3a, HCT116, DLD-1 e IEC-18 (ATCC) y RKO-pBar /
Renilla
[21]. Las chalconas derricin y derricidin utilizados en este estudio fueron extraídos y purificados por Nascimento y Mors (1972) [20].
Wnt-Luciferase reportero ensayos
RKO-pBar /
Renilla
células se cultivaron en placas de 96 pocillos, con 1,0 x 10
4 células /pocillo en DMEM de alta glucosa con 10% de suero bovino fetal (Gibco). Después de la confluencia, las células fueron tratadas con derricin (10, 20 o 50 mM) o derricidin (10, 20 o 50 mM) en presencia de medio acondicionado Wnt3a [22], para un 24 h adicionales. De células L de medio condicionado se utilizó como control negativo. DMSO se añadió también como el control del vehículo. Después de 24 h de tratamiento, Firefly y
Renilla
actividades de luciferasa se detectaron de acuerdo con el protocolo del fabricante (sistema de ensayo de luciferasa Dual Reporter, Promega).
HEK293T y HCT116 se cultivaron en placas de 96 pocillos con 1,0 x 10
4 células /pocillo en DMEM-F12 con 10% de suero bovino fetal (Gibco). Después de alcanzar el 70% de confluencia, cada pocillo se transfectaron con 50 ng plásmidos FOP-flash TOP-Flash o, 5 ng TK
Renilla
-luciferase, con o sin β-catenina [23]. El reactivo de transfección utilizada fue Lipofectamine (Invitrogen). 15h después de la transfección, las células se trataron con chalconas en presencia de medio acondicionado Wnt3a, durante 24 h, con el 10, 20 o 30 M de derricin o 10, 20 o 30 M de derricidin. Al día siguiente, la luciérnaga y
Renilla
actividades de luciferasa se detectaron de acuerdo con el protocolo del fabricante (sistema Dual Luciferase reportero de ensayo, Promega). Las manipulaciones
embrión.
Experimentos
Rana se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices concedidas por el Comité de Cuidado de Animales y uso ética (Comissão de ética no uso de Mascotas-CEUA) de la Universidad Federal de Río de Janeiro y fueron aprobados por este comité bajo el número 152/13 permiso. Las ranas adultas (Nasco Inc., WI, EE.UU.) fueron estimuladas con gonadotropina coriónica humana (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.).
Xenopus
embriones fueron obtenidos por
in vitro
fertilización y por etapas de acuerdo a Nieuwkoop y Farber [24]. Todos los experimentos se realizaron a 22 ° C. Para mRNA xWnt8 sintético, el plásmido fue linealizado con NotI y se transcribió con ARN polimerasa SP6 utilizando el kit mMessage mMachine (Applied Biosystems). embriones de cuatro células etapa se inyectaron en la zona marginal ventral con el fin de inducir la formación de eje secundario. Además, los embriones de cuatro células etapa fueron co-inyectados con 10 pg /embrión de xWnt8 mRNA plus 0,4 pmol /embrión de cada chalcona o 250 pg de Wnt /β-catenina plásmido indicador de luciferasa (S01234-Luc) y 50 pg conocimientos tradicionales -
Renilla
para llevar a cabo los ensayos de luciferasa embrión. Después de la inyección, los embriones se mantuvieron en 0,1x Barth (NaCl 8,89 mM; KCl 0,1 mM; NaHCO 0,24 mM
3; MgSO 0,08 mM
4.7H
2O; Hepes 1 mM; mM Ca 0,03 (NO
3)
2,4H
2O; CaCl 0,04 mM
2,2H
2O; pH 7,7), hasta la etapa 27, cuando se analizaron los fenotipos o hasta gástrula etapa (St 10) cuando el la actividad luciferasa se detectó de acuerdo con el protocolo del fabricante (sistema Dual Luciferase reportero de ensayo, Promega).
ensayo MTT.
3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difenil bromuro de tetrazolio (MTT) se utilizó para ensayar la actividad mitocondrial en las células viables. Las células se sembraron a una concentración de 1,0 x 10
4 células /pocillo en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos en DMEM F-12 medio que contiene 10% de suero bovino fetal y se cultivaron durante 24 h antes del tratamiento con chalconas (10, 20, 30, 50, o 100 mM) para 0, 24, 48, o 72 h. MTT se añadió a cada pocillo a una concentración final de 150 mg /ml durante 4 h antes de la cosecha de células. El producto de reacción de formazano se disolvió con DMSO y se cuantificó espectrofotométricamente a 570 nm (lector de microplacas multimodo Módulo II).
inmunotinción.
células HCT116 se fijaron en paraformaldehído al 4%, se lavaron con PBS, y permeabilizaron con 0,1% Triton X-100. Las muestras fueron luego bloqueados durante 1 h con 5% de albúmina de suero bovino. Un anti-β-catenina de conejo (1: 200) de anticuerpo primario se incubó durante la noche. anticuerpos secundarios específicos conjugados con fluorocromo Cy3 (1: 5000) se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Después de lavados con PBS, la tinción DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) (Cell Signaling) se realizó durante 5 minutos, y luego portaobjetos se montaron con Fluorsave (Calbiochem) y se observaron en un Nikon TE 2000-S microscopio invertido (Melville , Nueva York, EE.UU.). Las imágenes fueron capturadas utilizando una CoolSNAP-Pro (Media Cybernetics, Bethesda, MD, EE.UU.) cámara digital, con un zoom de 100x y 600x.
La proliferación celular ensayo
Para el ensayo de proliferación celular, 5 , 0 x 10
4 células se sembraron en el día anterior y se tratan con 30 mM o 50 mM derricin o derricidin durante 24 h. Click-iT EdU (Ciencias de la Vida) de ensayo se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. DMSO se utilizó como vehículo para solubilizar los flavonoides y se añadió a controlar las condiciones de culturas en el 0,5%.
Análisis del ciclo celular.
El análisis del ciclo celular se realizó mediante citometría de flujo. Las células se enjuagaron brevemente con PBS y calcio y separadas con tripsina a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, 1 × 10
se suspendieron 6 células en 0,5 ml de solución Vindeløv enfriado con hielo [25] que contiene 0,1% de Triton X-100, tampón de citrato 0,1%, 0,1 mg /ml de RNasa y 50 mg /ml de yoduro de propidio ( Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.). Después de 15 minutos, las células se analizaron para el contenido de ADN utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA, EE.UU.). Se analizaron las células vivas de acuerdo ADN contenido. Células que muestran el ADN y posibles dobletes fragmentados se excluyeron del análisis. Las células con contenido de ADN diploide (2n, fase G0-G1), síntesis de ADN (& gt; 2n pero & lt; 4n, S de fase), y duplicados de ADN (4n, fase G2 /M) se adquirieron y analizaron utilizando CellQuest y WinMDI 2.9 software, respectivamente.
análisis estadístico.
Cada experimento se llevó a cabo al menos tres veces. Los ensayos de luciferasa, el ciclo celular y MTT se realizaron por triplicado. cuantificación tinción celular se realizó contando el número de DAPI y el número de células teñidas de β-catenina no nucleares y nucleares en campos microscópicos elegidos al azar, a continuación, se calculó el porcentaje de células no nucleares y nucleares de las células totales. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de la t de Student para datos independientes. En los ensayos de MTT, se utilizó ANOVA de dos vías después de un post-test de Bonferroni (GraphPad Prism versión 5.00, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE.UU.). En el
Xenopus
reportero de ensayo /β-catenina vía se utilizó un modelo lineal tras una Kruskal-Wallis (GraphPad Prism versión 6.00, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE.UU.). La significación estadística se pone a * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01 y *** P & lt; 0,001
Resultados
Derricin y derricidin inhibir la proliferación de líneas celulares de CRC
Muchos compuestos naturales, incluidos los flavonoides, son capaces de afectar a la proliferación celular y la apoptosis y por lo tanto son candidatos importantes para el control del cáncer. Se realizó un bajo rendimiento de ensayo indicador de Wnt específico para detectar compuestos naturales extraídos de diferentes plantas brasileñas (datos no mostrados). Entre los inhibidores, se encontró una actividad de inhibición de Wnt /β-catenina detectable mostrada por las chalconas derricin y derricidin (Fig. 1). En este caso, se utilizaron dos líneas celulares de CRC, HCT116 y DLD-1, y se investigó si derricin y derricidin podrían afectar el crecimiento de las células del colon. También se investigó el efecto de chalconas en la norma IEC-18, una línea de células no transformadas derivadas del epitelio del intestino de rata. En primer lugar, se trataron estas células a diferentes concentraciones (10 a 100 mM) de estos chalconas para diferentes periodos de tratamiento (0-72 h), y se analizaron la viabilidad celular, a través de ensayo de MTT. En HCT116, se observó una disminución significativa en la viabilidad celular a 100 M de derricin en las primeras 24 horas de tratamiento. Después de 48 h de tratamiento, 20 M de derricin fue capaz de reducir la absorbancia MTT (Fig. 2A). Derricidin tuvo efectos similares en HCT116 y también redujo la viabilidad celular de una manera de la concentración y dependiente del tiempo (Fig. 2B). Por otra parte, el tratamiento con derricin y derricidin disminuyó el número de células HCT116, el logro de aproximadamente 58% y 65% de reducción de los núcleos teñidos con DAPI con 50 M de derricin y derricidin, respectivamente (Fig. 2C). En DLD-1, derricin podría reducir la viabilidad celular a una concentración de 100 mM con un efecto más suave a las 18 h y una reducción intensa después de 48 h de tratamiento (Fig. 2D). Derricidin, por otro lado, tenía un efecto más fuerte en DLD-1, tal como 50 mM de esta chalcona fue suficiente para disminuir fuertemente la viabilidad celular después de 18 h de tratamiento (Fig. 2E). Estas chalconas también fueron capaces de disminuir el número de células DLD-1 en cultivo, alcanzando aproximadamente el 50% y el 70% de reducción con 50 M de derricin y derricidin, respectivamente (Fig. 2F). Cuando analizamos el efecto de derricin y derricidin de la viabilidad celular de las células IEC-18, se pudo observar que tanto los flavonoides disminuyen absorbancia MTT, a partir de las 18 h de tratamiento a 100μM. Curiosamente, no se detectaron efectos en la viabilidad celular a concentraciones más bajas (Fig. 2G, H). Por otra parte, 50 M de derricin y derricidin tratamiento resultó en una reducción máxima del 32% y el 38% de la IEC-18 número de células (Fig. 2I).
(A, B, D, E, G, h) Los gráficos muestran los niveles de absorbancia de MTT en HCT116, líneas DLD-1 e IEC-18 células, después del tratamiento de hasta 72 h con 10-100 M de derricin o derricidin. (A) en las células HCT116, se observa reducción significativa en la viabilidad celular después de 100 M de derricin durante 24 h y 20 M de derricin durante 48 h (B) Después de derricidin tratamiento, la reducción de la viabilidad celular se produjo a 100 M de derricidin después de 24 hya 30 mM después de 72 h. (D) En las células DLD-1, se observa un efecto más suave en 100 mM después de 18 h de tratamiento. De lo contrario, se detecta una intensa reducción de MTT absorbancia después del tratamiento 48h con 100 mM de derricin. tratamiento (E) Derricidin reduce significativamente DLD-1 la viabilidad celular después del tratamiento 18 h con 50 M de flavonoide y a 20 mM después de 72 h. (G) En células IEC-18, se observó una reducción de la viabilidad con 100 M de derricin, a partir de las 18 horas de tratamiento. (H) Un perfil similar se observa después de derricidin tratamiento. (C, F, I) núcleos DAPI-manchado se contaron después del tratamiento 24h con derricin y derricidin. (C) 30 y 50 micras de derricin reducido aproximadamente 30% y 58% el número de núcleos HCT116, respectivamente; mientras derricidin reducido aproximadamente 39% y 65%, respectivamente. (F) DLD-1 núcleos se redujeron aproximadamente 44% y 50% después de derricin tratamiento a los 30 y 50 micras concentraciones, respectivamente. tratamiento Derricidin disminuyó aproximadamente 50% y 70%, respectivamente. (I) IEC-18 núcleos también se redujeron, con valores de 25% y 32% de reducción con 30 y 50 micras de derricin, respectivamente, y 40% y 38% con 30 y 50 micras de derricidin, respectivamente. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt;. 0.001
Nuestros primeros análisis revelaron que derricin y derricidin fueron capaces de disminuir la viabilidad celular, lo que sugiere que ambos flavonoides afectan el crecimiento de células de cáncer . Para probar si derricin y derricidin podrían inhibir la proliferación de líneas celulares de CRC, se realizó un ensayo de Edu-incorporación. Observamos que ambas chalconas fueron capaces de reducir el número de células proliferantes, a los 30 y 50 micras, en todas las líneas celulares (Fig. 3 A-O '). Después de la cuantificación, era posible observar que 30 M de ambos chalconas inhiben aproximadamente el 40% de la proliferación celular en HCT116 y aproximadamente 50% en DLD-1 (Fig. 3 P, Q). Curiosamente, 30 M de ambos flavonoides fueron capaces de inhibir sólo un 20% de la proliferación celular en IEC-18, que indican una diferencia en la regulación de la división celular de líneas celulares tumorales y no tumorales (Fig. 3R).
Edu incorporación en las células del colon después del tratamiento con 30 y 50 micras de derricin y derricidin durante 24 h. (A, A ', B, B', C, C ') En las condiciones de control, se observó un número considerable de células Edu-positivos. (D, D ', E, E', F, F ', G, G', H, H ', I, I') Después del tratamiento con derricin, se observa un menor número de células Edu-positivos. (J, J ', K, K', L, L ', M, M', N, N ', O, O') Derricidin tratamiento también reduce las células Edu-positivos. (P, Q, R) Cuantificación de las células Edu-positivas en HCT116, DLD-1 y IEC-18. La barra de escala 50 micras, ** p & lt; 0,01, *** p & lt;. 0.001
A continuación pregunta si estos efectos podrían estar relacionados con la detención del ciclo celular. Para ello, se trataron HCT116, DLD-1 y células IEC-18 con cada uno de flavonoides durante 96 horas y se cuantificó el porcentaje de células en diferentes fases del ciclo celular (Fig. 4). células HCT116 tratados con DMSO eran en su mayoría en G1 /G0 fase del ciclo celular (Fig. 4A, en la región M1). tratamiento Derricin induce una perturbación significativa en estas células diploides, que disminuyeron recuento de células en la fase G1 /G0 a 67,6% y 54% cuando son tratados con 30 y 50 M de este flavonoide, respectivamente (Fig. 4A, en la región M1). Derricin afectado el ciclo celular de una manera dependiente de la dosis, teniendo en cuenta que 30 micras detuvieron el ciclo celular en la fase S y 50 mM detuvieron el ciclo celular en la fase G2 /M (Fig. 4A, D). Derricidin también se evaluó por su capacidad de controlar el ciclo celular. El tratamiento con 30 mM y 50 mM de derricidin redujo el porcentaje de células diploides a 53,8% y 35,5%, respectivamente, e indujo una detención del ciclo celular significativa en la fase G2 /M en ambas concentraciones (Fig. 4E). La frecuencia de células DLD-1 que contiene el contenido de ADN duplicado fue de aproximadamente 50% en las células control y aumentó a 30,3% y 59,3% de las células después del tratamiento con 30 mM y 50 mM de derricidin. Por otro lado, DLD-1 células de adenocarcinoma acumulado en fase G0 /G1 del ciclo celular después de 30 mM y 50 mM de derricin (Fig. 4B, en la región M1) viviente. 31,6% de las células estaban en fase G0 /G1 en condiciones no tratados o tratados con DMSO. Este número alcanza 66,9% y 65,7% de las células en 30 micras y 50 micras, respectivamente, de derricin. Estos resultados también indican una respuesta a la dosis no dependiente de tratamiento derricin (Fig. 4F). Se observaron efectos similares cuando tratamos estos línea celular con derricidin a ambas concentraciones (Fig. 4B, en la región M1, 4G). Curiosamente, IEC-18 presenta una modulación de fase del ciclo celular débil en ambos tratamientos derricin y derricidin, excepto para un efecto más suave en 50 mM de derricin (Fig. 4C, H, I). Tomados en conjunto, estos datos muestran un efecto anti-proliferativo de derricin y derricidin, que actuó con la detención del ciclo celular en HCT116 y DLD-1 líneas celulares tumorales.
(A, D, E) En HCT116, sin tratar células mostraron aproximadamente 75% de las células en la fase G1 /G0, mientras que 30 y 50 M de derricin reducido esta proporción a 67,6% y 54%, respectivamente, lo que resulta en la detención del ciclo celular en S y G2 /M fases, respectivamente. Derricidin redujo este porcentaje al 53,8% y 35,5%, respectivamente, y también inducida por la detención del ciclo celular en la fase G2 /M. (B, F, G) Por otro lado, las células DLD-1 acumulados en la fase G0 /G1 del ciclo celular después de 30 M y 50 M de derricin o derricidin. (C, H, I) y Derricin derricidin tratamiento tuvieron efectos más leves en la progresión del ciclo celular de las células IEC-18, a excepción de un paro ligeramente en G2 /M con 50 M de derricin. Los gráficos de barras representan el porcentaje de células según el tratamiento y los datos significativos fueron representados en la figura. Las barras negras: G0 /G1 fase; Las barras blancas: la fase S; y Gray: bares. G2 /M fases
Derricin y derricidin como potentes inhibidores de Wnt /β-catenina señalización
La desregulación de la señalización de Wnt canónica está estrechamente relacionado con las células de cáncer de colon [ ,,,0],1,3]. Por ejemplo, las células HCT116 tienen una mutación en un gen que codifica la proteína CTNNB1 β-catenina, y por lo tanto tienen una alta actividad de la vía Wnt /β-catenina [2]. Nos preguntamos si la viabilidad celular y la detención del ciclo celular efectos de derricin y derricidin en células HCT116 se debieron a la modulación de la señalización /β-catenina vía. Se analizó en primer lugar la distribución celular de β-catenina. En las células no tratadas o tratadas con DMSO, la proteína β-catenina se encontró en núcleos de casi el 50% de las células (Fig. 5A, B, C, J). Sin embargo, cuando las células tratadas con derricin, sólo el 25% de las células mostraron tinción nuclear con β-catenina (Fig. 5D, E, F, J). En el caso de derricidin, 26% de las células mostró β-catenina nuclear, que era también una reducción significativa de la tinción nuclear (Fig. 5G, H, I, J). Debido a que estos resultados apoyan una posible inhibición de Wnt /β-catenina, se abordó el estado de activación vía Wnt más directamente, mediante la realización de ensayos de reportero específicos de Wnt /β-catenina en HCT116 transfectadas con el plásmido TOPflash. En consonancia con los datos anteriores, derricin y derricidin reportero de la actividad de Wnt inhibe específicamente (Fig. 5K). Estos resultados muestran que derricin y derricidin fueron capaces de inhibir la vía /β-catenina Wnt en la línea celular de tumor HCT116.
(AI) β-catenina inmunotinción de las células HCT116 tratadas con 30 mM de cada chalcona para 24 marido. (A-C) En las condiciones de control, la mayoría de las células muestran la tinción de β-catenina del núcleo. (D-F) Después del tratamiento con derricin, esta tinción se pierde y la mayoría de las células muestran β-catenina en el citoplasma y membrana. tratamiento (G-I) Derricidin también reduce la tinción nuclear de β-catenina. (J) La cuantificación de la inmunotinción mostró que ambos chalconas reducen β-catenina nuclear. (K) de Wnt /β-catenina ensayo indicador específico de TOPflash /
Renilla
transfectaron células HCT116. Ambos chalconas reducen la actividad del indicador Wnt después del tratamiento 30 y 50 M durante 24 h. Barra de escala:. 50 M, * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001
Nuestros experimentos utilizando HCT116 sugieren fuertemente que derricin y derricidin son potentes inhibidores de la señalización de Wnt canónica . Para hacer frente a este efecto, más concretamente, hemos realizado experimentos clásicos para analizar la regulación vía Wnt, es decir, la luciferasa ensayos de reportero de genes en RKO-pBar /
Renilla
células y células HEK293T. Estas células se trataron con 10, 20 o 50 M de derricin en presencia de medio acondicionado Wnt3a. Derricin disminuyó la actividad de reportero Wnt de una manera dependiente de la concentración en ambas líneas celulares (Fig. 6A, C). Derricidin tratamiento también fue capaz de disminuir la actividad de reportero Wnt, aunque la inhibición más alta solamente se logra cuando las células fueron tratadas con 50 mM (Fig. 6B, D). Se ha observado una ligera reducción en la actividad de reportero Wnt después del tratamiento con derricidin 20 mM. Para saber si derricin y derricidin acto aguas arriba o aguas abajo de la proteína efectora β-catenina, que activan la señalización Wnt mediante la transfección de las células HEK293T con β-catenina y se evaluaron los efectos de inhibición de chalconas. Derricin fue capaz de inhibir la activación β-catenina de la vía de Wnt, mientras que derricidin no era, lo que sugiere que derricin actúa aguas abajo de β-catenina, mientras derricidin actos aguas arriba (Fig. 6E). Estos datos muestran que derricin y derricidin se comportan como inhibidores de la vía de señalización /β-catenina Wnt, pero en diferentes concentraciones y en diferentes niveles de esta señalización.
(A, C) Derricin inhibe Wnt-reportero actividad de partida a los 10 M en ensayos de luciferasa de RKO-pBar /
Renilla
y de HEK293T. (B, D) Derricidin inhibe ligeramente la actividad de Wnt-reportero en 20 mM de RKO-pBar /
Renilla Opiniones y HEK293T. En RKO-pBar /
Renilla
, mayor inhibición se consigue a 50 M de derricidin (B). (A, B) 10, 20, 50 mM de cada uno de chalcona. (C, D) 10, 20, 30 mM de cada uno de chalcona. (E) la activación de Wnt HEK293T señalización a través de la transfección de β-catenina se suprime por tratamiento derricin, pero no derricidin. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt;. 0.001
Derricin y derricidin inhibir la formación de doble eje en
Xenopus
embriones y suprimir Wnt /β-catenina la actividad de luciferasa
in vivo
El eje de la formación secundaria inducida por Wnt en
Xenopus
está relacionada con la sobreactivación de la señalización /β-catenina vía durante el desarrollo de
Xenopus
embriones, y por lo tanto, los moduladores negativos de esta vía son capaces de revertir o reducir la doble eje fenotipo [26,27]. Como nuestros datos indican fuertemente que estos flavonoides son inhibidores de la señalización de Wnt canónica, hemos decidido analizar la capacidad de derricin y derricidin para afectar la formación del eje doble inducida por Wnt en
Xenopus
embriones. Nos embriones con coinyecta
x
Wnt8 ARNm y derricin o derricidin en los blastómeros ventrales de 4 celdas etapa
Xenopus
embriones. Se observó que aproximadamente el 73% de los embriones muestra un eje secundario después de
x
inyección Wnt8 (Fig. 7B, E, F). Sin embargo, la co-inyección de
x
Wnt8 con derricin o derricidin reduce la inducción de eje ectópico (Fig. 7C, D). Co-inyección con derricin fue capaz de reducir el doble eje en un 43%, mientras que derricidin se redujo en un 41% (Fig. 7E, F). Además, hemos realizado experimentos de luciferasa mediante la inyección del plásmido S01234-Luc en el lado ventral del
Xenopus
embriones. Este
Siamois
-Reporter es capaz de responder a la activación de señalización de Wnt inducida por la co-inyección de xWnt8 ARNm. Hemos inyectado de forma concomitante 0,4 pmol /embrión de derricin y derricidin para probar si pueden inhibir la activación reportero. Como resultado, ambos chalconas redujeron la actividad de reportero significativamente (Fig. 7G). Estos datos indican que derricin y derricidin también pueden inhibir la vía Wnt /β-catenina
in vivo
en el
Xenopus laevis embriones
modelo.
Imágenes representativas de embriones CO- inyectados con mRNA xWnt8 más DMSO (B) o ARNm xWnt8 más derricin o derricidin (C, D). Observar la formación de doble eje incompleta o ablación eje secundario en embriones inyectados con chalconas. (E-F) Los gráficos muestran porcentajes de fenotipos de embriones. Observe que la co-inyección de chalconas con xWnt8 mRNA redujo el porcentaje de embriones con doble eje, y el aumento de la proporción de embriones normales, con un eje. (G)
Xenopus
embriones inyectados con el reportero S01234 +
Renilla
, xwnt8 (10 pg) con DMSO o las chalconas (0,4 pmol /embrión). La activación del reportero fue impedido por inyección chalcona. Puntas de flecha: glándula de cemento; flecha: doble eje incompleta; A-P: antero-posterior del eje
Discusión
consumo de flavonoides ha sido durante mucho tiempo asociado con la prevención, control y tratamiento de varios cánceres humanos [28].. En relación con el cáncer colorrectal, muchos flavonoides se han asociado con el control y la prevención de esta enfermedad [9,16-18]. Chalconas, por ejemplo, pueden ofrecer ventajas como agentes antitumorales, en comparación con otros flavonoides, porque tienen poca interacción con el ADN y por lo tanto un bajo riesgo de mutagénesis [29]. En este estudio, hemos demostrado que dos flavonoides (Fig. 1), de la subclase chalcona, tienen efectos antiproliferativos potentes en líneas celulares tumorales de colon, HCT116 y DLD-1. Derricin y derricidin ambos fuertemente inhibida recuento total de células y la viabilidad de estas células
in vitro
(Fig. 2) y también redujo la proliferación de células HCT116 y DLD-1 en niveles similares después de 24 h (Fig. 3). También se analizaron los efectos derricin y derricidin en IEC-18, una línea de células epiteliales no transformadas. La viabilidad celular sólo se veía afectada en concentraciones más altas, a diferencia de lo que ocurre en HCT116 y DLD-1 células. Por otra parte, 30 micras de ambos chalconas tuvo un efecto ligeramente en la proliferación de células IEC-18, mientras que se observó una reducción de aproximadamente 50% en HCT116 y células DLD-1. Estos resultados sugieren un posible efecto más restringido a las células de CRC.
Derricin y derricidin efectos están relacionados con la modulación de la progresión del ciclo celular, principalmente mediante el cambio del porcentaje de células en las fases G2 /M y S de ciclo celular en HCT116 y G0 /G1 en DLD-1 (Fig. 4). Curiosamente, derricin y derricidin detención del ciclo celular se produce en diferentes fases del ciclo celular en cada línea celular. Estos efectos pueden estar relacionados con un efecto de flavonoide específica en la modulación de varias proteínas reguladoras del ciclo celular, y las diferencias en el fondo de los genes mutados en cada línea celular pueden explicar estos efectos distintos [30]. Además, derricin y derricidin no tuvieron efectos significativos en IEC-18, una línea celular no tumoral. Estos resultados se pueden correlacionar con otros informes de importantes efectos citotóxicos de estos flavonoides [31,32]. Otros chalconas poseen efectos antiproliferativos y apoptóticos [33,34,35].
Los estudios recientes han mejorado la comprensión de los mecanismos de acción de los flavonoides. Por ejemplo, muchos flavonoides son moduladores de diferentes vías de señalización, tales como Wnt /β-catenina, que se asocia comúnmente con tumor colorrectal progresión [1,2,3,5,36]. En este estudio se observó que los efectos antitumorales de derricin y derricidin pueden estar relacionados con la modulación de la vía Wnt, ya que reducen significativamente la localización nuclear de β-catenina y reducción de la activación Wnt-reportero en las células HCT116 (Fig. 5). Para comprender mejor el efecto de la señalización de Wnt en estas chalconas, hemos realizado ensayos de gen reportero-en-RKO pBar /
Renilla Opiniones y líneas de células HEK293T, que se utilizan clásicamente para investigar esta vía [21,26]. Derricin inhibió fuertemente la señalización a una concentración de 10 mM, mientras que derricidin alcanzado niveles inhibitorios similares sólo a 50 micras en ambas líneas celulares (Fig. 6A, C) Wnt. Además, derricin y derricidin inhibir la señalización de Wnt a través de diferentes mecanismos, ya derricin es capaz de contrarrestar β-catenina vía de señalización de activación, mientras que no es derricidin (Fig. 6E). Esta diferencia en los efectos relacionados con la concentración de los dos chalconas podría estar relacionado con sus estructuras químicas y /o a la forma en que interactúan con los componentes de Wnt o compartimentos celulares, que tienen profundos efectos en su potencia y selectividad.