Extracto
En la terapia contra el cáncer mediado por un sistema de administración de fármacos basada en nanopartículas (DDS), en general eficacia depende de la eficiencia de liberación de cargas de las nanopartículas en las células cancerosas, así como la especificidad de la entrega al tejido tumoral. Sin embargo, DDS convencionales basadas en liposomas no tienen ningún mecanismo para liberar específicamente los cargos encapsulados dentro de las células cancerosas. Para superar esta barrera, hemos desarrollado nanopartículas que contienen un péptido desestabilización novela membrana liposomal (LMPD) que puede desestabilizar las membranas por escisión con proteasas intramembranosas sobre /en las células cancerosas. Calceína encapsulado en liposomas modificados con LMPD (LMPD-lipo) fue liberado de manera efectiva en la presencia de una fracción de membrana que contiene una proteasa LMPD escindible. La liberación fue inhibida por un inhibidor de la proteasa, lo que sugiere que LMPD-lipo podría liberar de manera efectiva su carga en las células en respuesta a una proteasa específica del cáncer. Por otra parte, cuando LMPD-lipo contenía lípidos fusogénicos, se aceleró la liberación de la carga, lo que sugiere que la fusión de LMPD-lipo con las membranas celulares fue el paso inicial en el suministro intracelular. observaciones microscópicas con lapso de tiempo demostraron que la liberación de la carga desde LMPD-lipo se produjo inmediatamente después de la asociación de LMPD-lipo con las células diana. En consecuencia, LMPD-lipo podría ser útil una nanopartícula capaz de alivio eficaz de los cargamentos específicamente en células cancerosas específicas
Visto:. Itakura S, Hama S, T Ohgita, Kogure K (2014) Desarrollo de nanopartículas La incorporación de una novela La desestabilización de la membrana liposomal péptido de liberación eficaz de cargas en las células cancerosas. PLoS ONE 9 (10): e111181. doi: 10.1371 /journal.pone.0111181
Editor: Pedro V. Baptista, Universidad Nova de Lisboa, Portugal
Recibido: 23 de julio de 2014; Aceptado: September 26, 2014; Publicado: 24 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Itakura et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por los números JSP KAKENHI Grant 25.860.030, 26 a 9314, y por el Fondo de la Universidad de Kyoto farmacéutica para la Promoción de la Ciencia Investigación. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En la terapia del cáncer, un sistema de administración de fármacos (DDS) que puede entregar específicamente diversos agentes terapéuticos a los tejidos del tumor es una poderosa herramienta para el logro de la terapia de células específicas de cáncer sin efectos adversos. El rápido progreso en la investigación genómica y proteómica ha llevado a la identificación de moléculas que median en el desarrollo y progresión del cáncer. Por lo tanto, se ha hecho posible el diseño de terapias más específicas contra las células cancerosas. En general, los fármacos altamente específicos tales como péptidos, anticuerpos, proteínas y ácidos nucleicos son agentes de alto peso molecular (HMW). Sin embargo, la aplicación clínica de muchos agentes de HMW es limitada debido a su rápida degradación por las enzimas en la sangre, así como su entrega inadecuada en las células en sus sitios de segmentación [1]. Para resolver estos problemas, los agentes de alto peso molecular ha de ser encapsuladas en nanopartículas, tales como liposomas o micelas poliméricas capaces de proteger las cargas de la degradación enzimática y lograr la entrega intracelular eficiente. En DDS actuales basados en nanopartículas, modificación con polietilenglicol (pegilación) es una estrategia esencial para su entrega al tejido tumoral a través de efectos de retención (EPR) aumento de la permeabilidad y como portadores PEGilados pueden circular por largos períodos [2], [3]. Sin embargo, sólo ~ 10% de las moléculas inyectadas alcanzar el tejido tumoral [4]. Por lo tanto, hay espacio para la entrega mejorada. Por otra parte, la entrega del tumor a través de efectos de EPR depende del número de vasos tumorales inmaduras. En consecuencia, la eficiencia en la entrega en los cánceres con baja densidad vascular, tales como cáncer de páncreas, es menos eficiente [5].
Aunque el desarrollo de cáncer DDS rápidamente ha progresado, no existe una estrategia alternativa capaz de mejorar la entrega de nanopartículas por efectos EPR. Por lo tanto, es necesario para maximizar la eficacia terapéutica de los agentes contra el cáncer encapsulados para compensar la baja eficiencia de entrega de tejido tumoral. Cuando los agentes anti-cáncer se encapsulan en nanopartículas, la eficacia terapéutica depende de la cantidad de agentes libres liberados de las nanopartículas. Por lo tanto, la eficiencia de liberación de cargas a partir de nanopartículas es un paso clave en la mejora de la eficacia terapéutica. Para lograr la toxicidad específica de la célula del cáncer, sin efectos secundarios no deseables, los cargos encapsuladas en nanopartículas deben ser liberados únicamente cuando las nanopartículas se entregan al tejido tumoral, y no durante su circulación. En el pasado, para conseguir una liberación específica de tumor de cargas, diversas nanopartículas han sido diseñados para hacer uso del medio ambiente del tumor. Por ejemplo, las nanopartículas que pueden liberar en ambientes extracelulares ácidos específicos de tumores se han desarrollado [6] - [8]. Sin embargo, cuando una nanopartícula responde al medio extracelular, la carga se libera fuera de las células. Este diseño crea un nuevo problema técnico debido a que muchos agentes de HMW, tales como ácidos nucleicos y proteínas deben ser entregados y se liberan dentro de las células tumorales. Además, la liberación específica de un bajo peso molecular (LMW) agente anticáncer dentro de las células tumorales mostraron actividad contra el cáncer más eficaces que la liberación extracelular [9].
En este sentido, un portador DDS capaz de liberar una carga en las células cancerosas se han desarrollado. Por ejemplo, un portador de ácido nucleico depende de la proteína quinasa Cα (PKCa), que se sobreexpresa en células de cáncer [10], [11]. Este portador es un complejo de ácidos nucleicos y polímeros catiónicos que incorporan una secuencia de sustrato que puede ser objetivo de PKCa. Su interacción electrostática se reduce por la fosforilación de la secuencia de sustrato sobre el polímero por PKCa, después de lo cual se libera el ácido nucleico. Un enfoque diferente se aprovecha de la concentración de ATP elevada en las células cancerosas. Es decir, un agente encapsulado en chaperonina se libera después de un gatillo mediada por ATP [12]. Sin embargo, en estos sistemas de liberación, la administración de agentes es limitada y
in vivo
aplicación es difícil. Por lo tanto, se necesitan más mejoras en la farmacocinética y la dinámica intracelular. En este sentido, los liposomas pueden encapsular fármacos HMW y agentes de BPM. agentes hidrófobos se pueden realizar en la membrana de lípidos y agentes hidrófilos pueden ser retenidos en la fase acuosa [13]. Por lo tanto, la versatilidad de los liposomas hace intrigante para el diseño de nuevo DDS.
En cuanto a la liberación de cargas de liposomas, muchos sistemas se han desarrollado para inducir la fusión de las membranas liposomales con membranas endosomal-lisosomal en el ambiente ácido del endosoma-lisosoma [14]. Sin embargo, cuando la eficiencia de escape del endosoma es baja, las drogas pueden someterse a la degradación lisosomal y reciclaje endocítica [15]. Por lo tanto, se necesitan mejoras en la liberación del fármaco a través de la fusión de membranas. Con ese fin, hemos desarrollado un sistema que desestabiliza la membrana liposomal durante la fusión con las membranas celulares de cáncer. Nos centramos en la membrana intrínseca de proteínas γ-secretasa de las células cancerosas. Esta proteasa intramembranous puede escindir el dominio transmembrana de la proteína Notch sustrato [16], [17]. Para utilizar este mecanismo, incorporamos péptidos que imitan el dominio transmembrana de Notch en la membrana lipídica de los liposomas. Por lo tanto, cuando la membrana del liposoma se fusiona parcialmente con la membrana celular, cargas encapsulados se liberan en las células mediante la desestabilización de las membranas liposomales por intramembranous γ-secretasa. El uso de este concepto, hemos incorporado un péptido desestabilización de la membrana liposomal (LMPD) en liposomas (LMPD-lipo) que imitaban el dominio transmembrana de Notch. Aquí, demostramos que la liberación de cargas de LMPD-lipo respondía a gamma-secretasa en las membranas celulares de cáncer.
Materiales y Métodos
Materiales
fosfatidilcolina de huevo se obtuvo de NOF Corporation (Tokio, Japón). propano 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio (DOTAP) y 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) se adquirieron de Avanti Polar Lipid (Alabaster, AL, EE.UU.). Cell Rastreador de CM-Dil se obtuvo de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). hemisuccinato de colesterilo (CHEMS) y calceína se adquirieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Bio-Beads SM-2 Los adsorbentes fueron adquiridos de BIO-RAD (Hercules, CA, EE.UU.). HUEhT-2 células, una línea inmortalizada umbilical células endoteliales de vena humana (HUVEC) establecido por electroporación de pIRES-hTERT-HygR, las células HeLa, una línea celular de carcinoma epitelioide de cuello uterino humano, y las células MCF-7, una línea celular de tumor mamario humano, se obtuvieron del Banco de células JCRB (Osaka, Japón). las células A549, una línea celular de adenocarcinoma de pulmón humano, fueron proporcionados por el Banco de la célula Riken (Saitama, Japón). El péptido desestabilización de la membrana liposomal (LMPD), LHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRR, fue sintetizado por SCRUM (Tokio, Japón). Un sustrato peptídico de fluorescencia de enfriamiento rápido, Nma-GGVVIATVK (DNP) RRR-NH
2 y un inhibidor de la γ-secretasa, N- [N- (3,5-Difluorophenacetyl) -L-alanil] -S-fenilglicina t éster terc (DAPT), se obtuvieron de la Peptide Institute, Inc. (Osaka, Japón). 3 - [(3-colamidopropil) dimetilamonio] -2-hidroxipropansulfonato (CHAPSO) se adquirió de Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japón)
aislamiento de membrana de células
Se preparó la fracción de membrana de acuerdo. con los informes anteriores [18]. Todos los procedimientos se llevaron a cabo en hielo. Las células cultivadas HeLa, células A549, células MCF-7 y HUEhT-2 células (aproximadamente 1 x 10
8 células) se sedimentaron. Las células se resuspendieron en un tampón que contiene Hepes 20 mM, pH 7,5, KCl 50 mM, EGTA 2 mM, y cóctel inhibidor de proteasa, Complete Mini (Roche Applied Science), y se homogeneizaron usando 15 golpes de un homogeneizador Dounce con una mano de mortero ajustada. Los homogeneizados celulares se centrifugaron a 800 ×
g
durante 10 minutos y volvió a homogeneizar como anteriormente. Los sobrenadantes se centrifugaron a 100.000 x
g
de 1 h y se resuspendieron en el mismo tampón y recogido por centrifugación a 100.000 x
g
de 30 min utilizando un Optima XL-90 (Beckman Coulter) . Las membranas se resuspendieron en HEPES 20 mM, pH 7,0, KCl 150 mM, EGTA 2 mM, 1% (w /v) CHAPSO, y Completo Mini y solubilizan a 4 ° C durante 1 h con rotación de extremo a extremo. Las membranas solubilizadas se centrifugaron a 100.000 x
g
durante 1 h, y los sobrenadantes se recogieron. La concentración de proteína total se determinó con un kit de ensayo de proteína BCA (Thermo Scientific).
γ-secretasa medición de la actividad
Para medir la actividad de γ-secretasa, preparaciones de membranas solubilizadas (15 mg de proteína total) se incubaron con sustrato de péptido de fluorescencia de enfriamiento ocho mu M a 37 ° C durante la noche y se centrifugó a 16.100 ×
g
para 15 min. La fluorescencia del sobrenadante se midió mediante la Plata Infinito M200 (TECAN) con una longitud de onda de excitación de 355 nm y longitud de onda de emisión de 440 nm.
Preparación de LMDP lipo-
delgadas películas lipídicas compone de EPC , EPC /DOPE /DOTAP (4/4/1), EPC /DOPE /CHEMS (4,5 /4,5 /2) en un tubo de vidrio se hidrataron en PBS (-) o 30 mM solución de calceína en PBS (-) durante 10 min , seguido por sonicación durante 5 minutos en un sonicador de tipo baño (NEY). Los liposomas se mezclaron con 1% de Triton X-100 y se incubaron extremo sobre extremo durante 1 h. Una LMPD mM disuelto en 1% de Triton X-100 se añadió a la solución de liposomas (3-5% mol) y se incubaron extremo sobre el extremo de 1 h. Después, se añadieron SM-2 Bio-cuentas a la solución de lípido-LMPD-detergente durante 1 h a una relación de perlas a detergente de 30 (w /w) con el fin de eliminar el detergente. La solución resultante se centrifugó a 16.000 ×
g
de 10 min y la solución sobrenadante se recogió liposoma. Para los liposomas que contienen calceína, la calceína libre se eliminó usando una columna de Sephadex G-50 equilibrada con PBS (-). La concentración de lípidos de los liposomas se determinó con el método de colina oxidasa-DAOS (fosfolípidos C-test kit Wako). tamaño de partícula y potencial de la superficie de los liposomas preparados se midieron con un Zetasizer nano (Malvern Ins. Ltd.).
LMPD actividad de escisión por γ-secretasa
Para estudiar la escisión LMPD por γ-secretasa, se evaluó el efecto inhibidor competitivo de LMPD o LMPD-lipo en la escisión del sustrato peptídico (el mismo que el utilizado en 2.2). Las preparaciones de membranas solubilizadas de A549 (16,5 mg de proteína total) se incubaron con sustrato de 5 mM péptido y 0, 5, 10, 50 o 100 mM LMPD o LMPD-lipo como la concentración LMPD se mantuvo constante a 37 ° C durante la noche. A continuación, la intensidad de fluorescencia se midió como se describe en 2.2
.
La escisión de LMPD fue también evaluada por el ensayo de HPLC. Las preparaciones de membranas solubilizadas de A549 (16,5 mg de proteína total) se incubaron con 100 LMPD M o LMPD-lipo a 37 ° C durante 1 h. LMPD a una concentración de 100 mM tenía efectos inhibidores en los estudios de inhibición competitiva y el tiempo de incubación (1 h) se corresponden con las condiciones de reacción en el ensayo de liberación de calceína. LMPD-lipo se solubilizó con 1% de Triton X-100, y el LMPD que permanece en solución se detectó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utilizando el sistema Alliance (Waters, Milford, MA, EE.UU.) conectado a una columna de SunFire C18 ( 5 m, 4,6 x 150 mm, Waters, Milford, MA, EE.UU.). La fase móvil consistía en 0,1% de TFA en H
2O (fase móvil A) /y acetonitrilo en 0,1% TFA (fase móvil B). El gradiente se inició con una relación inicial de 80% de fase móvil A y 20% de fase móvil B, seguido de un gradiente lineal de 80 a 10% de fase móvil A durante 20 min. El caudal fue de 0,3 ml /min y la longitud de onda de detección fue de 220 nm.
ensayo de liberación de calceína
Para estudiar la liberación de cargas de liposomas, Control-lipo-lipo o LMPD conteniendo calceína fueron se incubaron con las membranas solubilizadas (lípido /proteína = 2.0 (w /w)) o PBS o 1% de Triton X-100 a 37 ° C durante 1 h en presencia o ausencia del inhibidor de DAPT γ-secretasa. Las membranas solubilizadas se preincubaron con DAPT inhibidor γ-secretasa (10 mM) a 37 ° C durante 30 min antes del tratamiento con liposomas. La calceína liberada se ensayó midiendo la intensidad de la fluorescencia utilizando una placa de Infinito M200 (TECAN) con una longitud de onda de excitación a 490 nm longitud de onda y emisión a 515 nm. El porcentaje de liberación de calceína se calculó mediante la siguiente fórmula:
calceína de lanzamiento (%) = [(F-F
0) /(F
100-F
0)] × 100, donde F, F
0 y F
100 eran las intensidades de fluorescencia de calceína después de la incubación en presencia de una fracción de membrana, en PBS y en 1% de Triton, respectivamente.
confocal escaneo láser observaciones microscópicas de LMPD-lipo
células A549 se cultivaron en 0,002% de poli-L-lisina (PLL) recubierto de 96 pocillos placas de imagen (BD Falcon) a una densidad de 1 × 10
4 células /pocillo durante 24 h en DMEM que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS). Después de lavar con PBS (-), las células se trataron con control-lipo o LMPD-lipo que contiene 0,2 mol% CM-Dil y 30 mM de calceína por 1 h en DMEM libre de suero. CM-Dil y calceína se excitaron con él /Ne (543 nm) y Ar (488 nm) láser, respectivamente. Se obtuvo una serie de imágenes de microscopía de barrido láser confocal (CLSM) (LSM 510 META, Carl Zeiss Co. Ltd., Jena, Alemania) equipado con una lente de objetivo de inmersión en aceite (Plan-Apocromático 63 /NA1.4). Para inhibir la actividad de γ-secretasa y la vía endocítica, las células A549 se cultivaron como anteriormente y las células se pre-incubaron en DMEM libre de suero que contiene 50 mM DAPT o 0,4 M de sacarosa a 37 ° C o 30 min, amilorida 2,5 mM a 37 ° C durante 10 min y 5 mg /ml FilipinIII a 37 ° C durante 1 h, seguido de tratamiento con liposomas a 37 ° C durante 1 h y observado por CLSM, como se describe anteriormente. Para un estudio detallado de la liberación de calceína, los liposomas fueron observados por time-lapse de liposomas en las células A549 viviente. Las células se cultivaron en placas con fondo de vidrio 35 mm con recubrimiento de PLL (Iwaki) a una densidad de 2 × 10
5 células /placa durante 24 h en DMEM que contenía 10% de FBS. Las células se lavaron con PBS (-) y tratados con LMPD-lipo que contiene 0,2 mol% CM-Dil y 30 mM de calceína a 4 ° C durante 10 minutos en DMEM libre de suero. Después de la eliminación de los liposomas, las células se lavaron 3 veces con PBS (-) seguido de la adición de DMEM libre de suero fresco. imagen de lapso de tiempo fue adquirido usando una Nikon A1 CLSM (Nikon Instruments Inc., Melville, EE.UU.) equipado con una lente de objetivo de inmersión en aceite (Plan Apo VC 60X 1,4 N. A.). Las muestras se mantuvieron a 37 ° C y 5% de CO
2 durante todos los experimentos de formación de imágenes. La luz del láser a 488 nm y 561 nm se utilizaron para excitar calceína y Dil, respectivamente. adquisición de lapso de tiempo se ha configurado para tomar imágenes del mismo campo cada 30 segundos durante 30 minutos. La proyección de imagen de lapso de tiempo de aproximadamente 3 puntos /celular durante 5 células de cada muestra se analizó usando el software de NIS-Elements (Nikon Instruments Inc., Melville, EE.UU.).
El análisis estadístico
La significación estadística se determinó mediante pruebas t de Student y de Tukey-Kramer HSD-pruebas. Las diferencias con los valores de p inferior a 0,05 se consideraron significativos
Resultados
Diseño del sistema:. Liberación de cargas en las células a través de la escisión γ-secretasa dependiente de LMPD incorporado en la membrana liposomal
Hemos ideado un sistema en el que un péptido de sustrato de γ-secretasa se incorporó en las membranas liposómicas. Tales liposomas deben ser capaces de transportar una carga y de manera eficiente su liberación en las células cancerosas. El péptido, como se muestra en la Fig. 1, estaba compuesto de 29 residuos de aminoácidos que componen un sitio hidrófilo dentro de la célula y una secuencia hidrófoba del dominio transmembrana de Notch. Se denomina "membrana liposomal La desestabilización de Péptidos" (LMPD). La estructura secundaria de LMPD se predijo usando software SOSUI [19]. Como se ilustra en la Fig. 1, se demostró que 23 residuos del extremo N-terminal supone una estructura helicoidal y penetraron la membrana, y 6 residuos de la parte C-terminal fueron altamente hidrófilo y se encuentran fuera de la membrana de lípidos. Por lo tanto, la LMPD fue diseñado para penetrar en la bicapa lipídica. Además, el LMPD podría ser escindida en 3 puntos por γ-secretase [17]. Con el fin de determinar la especificidad de LMPD para γ-secretasa, se realizó una búsqueda de homología de LMPD por BLAST. No había ninguna proteína que tiene una alta homología con LMPD. Por lo tanto, LMPD podría no ser un sustrato para proteasas altamente expresados por las células cancerosas, tales como metaloproteinasas de matriz. Por lo tanto, cuando se incorpora en liposomas (LMPD-lipo), la escisión de LMPD debería desestabilizar la bicapa lipídica por la fusión de membranas de activación, seguido de la liberación de cargas en la célula.
Esta imagen representa el concepto de los portadores incorporan LMPD en la membrana liposomal (LMPD-lipo). La membrana de bicapa lipídica de LMPD-lipo se desestabiliza por escisión LMPD como un disparador para la fusión de membranas. La desestabilización promueve la liberación de cargas en la célula.
La escisión de LMPD por γ-secretasa
Para confirmar que el LMPD se escindió por γ-secretasa, elegimos A549 (pulmón humano carcinoma), en la que se había informado de líneas celulares MCF-7 (cáncer de mama humano) y HeLa (cáncer cervical humano) alta actividad de γ-secretase [20] - [22]. La actividad γ-secretasa en la fracción de membrana de estas células se ha investigado el uso de sondas de péptido sustrato fluorescente que podrían ser escindidos por γ-secretasa. Además, HUEhT-2 (una línea celular endotelial vascular humano) también se examinó como un control normal. Antes de la escisión, la fluorescencia de los péptidos de sustrato se interrumpió debido a la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) entre un grupo de enfriamiento (DNP) y un grupo fluorescente (NMA) en el extremo N-terminal del péptido a través del sitio de escisión. Por lo tanto, la fluorescencia se apareció por eliminación de FRET debido a la escisión de los péptidos. Tales sondas de péptidos a menudo se utilizan para la evaluación de la actividad de γ-secretase [18]. Se encontró que las actividades de gamma secretasa fueron casi los mismos en las células HeLa y células normales HUEhT-2, pero fueron significativamente mayores en las células A549 (Fig. 2a) MCF-7 y. Además, la expresión de la presenilina-1, que es un centro activo de γ-secretasa, se examinó por citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. S1, se observó expresión de la presenilina-1 en los mismos niveles en todas las células. La actividad específica de γ-secretasa (actividad γ-secretasa /presenilina-1 de expresión) y se calculó la actividad de γ-secretasa fue mayor en las células MCF-7 y las células A549 que en otras líneas celulares. Dado que las células A549 tenían áreas de membrana de plasma de más de células MCF-7, que estaban preferido para ensayos de liberación intracelular.
(a) La actividad γ-secretasa en células cultivadas. La sonda de fluorescencia del péptido se incubó con fracciones de membrana a partir de células A549 HUEhT-2, HeLa, MCF-7 y. (B) la inhibición competitiva de LMPD. La sonda de péptido y se incubaron a LMPD las concentraciones indicadas en la fracción de membrana de las células A549 a 37 ° C durante la noche. Los valores y las barras representan las medias y SD, respectivamente. (C) cromatogramas representativos de LMPD con o sin la fracción de membrana como se determina por análisis de HPLC a partir de tres experimentos independientes. *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; ***, P & lt; 0,001 frente a HUEhT-2 (a), 0 M LMPD (b), n = 3.
La fracción de membrana se aisló a partir de células A549 y se evaluó para la actividad de escisión LMPD . Para evaluar la interacción de LMPD con γ-secretasa, se analizó la inhibición competitiva de la LMPD en la escisión de la sonda péptido sustrato fluorescente por una fracción de membrana que contiene la γ-secretasa. La intensidad de fluorescencia de la sonda de sustrato se redujo significativamente en una manera dependiente de la concentración LMPD (IC
50:29 mu M) (Fig. 2b). Este resultado sugiere que la escisión del péptido sustrato fluorescente con γ-secretasa se impidió competitivamente por LMPD. Una disminución significativa en la intensidad de fluorescencia no se observó cuando se examinó de la misma manera usando un polipéptido diferente que tenía un tamaño similar (30 residuos) (Fig. S2). Estos resultados sugieren que la secuencia LMPD fue reconocida específicamente por el γ-secretasa.
La escisión de LMPD por γ-secretasa fue examinada por HPLC siguiente. El área del pico de LMPD se redujo aproximadamente 22,6 ± 10,5% en presencia de una fracción de membrana que tiene actividad de γ-secretasa (Tabla 1), confirmando así la escisión de LMPD. Higo. 2c muestra un cromatograma representativo de LMPD tratada con o sin la fracción de membrana. Estos resultados sugieren que LMPD sintético se escinde por una fracción de membrana de células A549 que posee alta actividad γ-secretasa.
Construcción de LMPD-lipo
LMPD fue incorporado en las membranas liposómicas por un detergente método de eliminación. LMPD se solubilizó con un agente tensioactivo (1% Triton X-100) y se mezcló con fosfolípido. Entonces, el agente tensioactivo en la mezcla de lípido /LMPD se eliminó para preparar liposomas que incorporan LMPD por un método de adsorción de perlas como se describe en los Materiales y Métodos. Se determinó que el 2,3 ± 0,2% LMPD se incorporó en los liposomas mediante análisis por HPLC. Calceína se utilizó como carga de modelo y se encapsuló dentro de los liposomas. Se evaluó la fuga de calceína en la presencia de una fracción de membrana de células A549. Al incorporar LMPD en liposomas que consisten en EPC, no hubo diferencia en la tasa de fuga de calceína en comparación con liposomas sin LMPD (Fig. 3). En este sistema, el dominio transmembrana del péptido sustrato en las membranas liposómicas tiene que ser escindido por gamma-secretasa en la membrana celular. Debido a que era necesario optimizar la composición lipídica de los liposomas, se intentó dar a la capacidad de los liposomas fusión de membranas.
Control-lipo constaba de EPC o EPC /DOPE /DOTAP (DOTAP), o EPC /DOPE /CHEMS (chems). LMPD-lipo contenía 5% en moles LMPD. Ellos se incubaron con la fracción de membrana a partir de células A549 a 37 ° C durante 1 h. columnas blancas y negras indican Control-lipo y LMPD-lipo, respectivamente. Los valores representan las medias de tres experimentos individuales. Las barras representan SD. *, P & lt;.
0,05
Por lo tanto, DOPE fue incluido en la composición lipídica. Además, dado que LMPD tenía un dominio transmembrana hidrófobo y un sitio hidrófilo con aminoácidos básicos (arginina y lisina) (Fig. 1), que conjeturado que la interacción electrostática entre la carga superficial de los liposomas y la carga del sitio hidrófilo afectaría tanto la incorporación de LMPD en liposomas y su funcionalidad. Por lo tanto, hemos preparado liposomas de fusión de membrana con cargas positivas o negativas que contenía DOTAP o CHEMS en EPC /DOPE e incorporamos el LMPD en cada uno.
La fuga de la calceína encapsulado de la EPC /DOPE carga negativa /chems liposomas aumentó de tres veces en la presencia de una fracción de membrana que contiene γ-secretasa. Por otro lado, cuando la composición incluye el DOTAP lípido catiónico, filtración de calceína fue no aumentó por LMPD (Fig. 3). Los resultados sugirieron que era necesaria la inclusión de CHEMS y DOPE con EPC para optimizar la funcionalidad del LMPD. Las propiedades físico-químicas de los liposomas y sus composiciones se resumen en la Tabla 2.
El mecanismo de liberación del fármaco por LMPD-lipo
Se determinó en primer lugar si LMPD se escindió por γ-secretasa cuando se incorporó en los liposomas. Por lo tanto, hemos probado la capacidad de LMPD-lipo para inhibir competitivamente la escisión de una sonda de sustrato fluorescente por gamma-secretasa. Verificamos que la escisión de la sonda péptido fluorescente se inhibió significativamente, incluso cuando se añadió LMPD-lipo a la fracción de membrana que contiene la γ-secretasa (Fig. 4a). Aunque el efecto inhibidor de LMPD-lipo era menos de LMPD solo, se confirmó que LMPD en las membranas liposómicas podría reaccionar con γ-secretasa. La escisión de LMPD en las membranas liposómicas también se evaluó por HPLC en presencia de la fracción de membrana que contiene γ-secretasa. El área del pico de LMPD en los liposomas se redujo en alrededor de 36,8 ± 7,0%, y la escisión de LMPD se muestra en la presencia de una fracción de membrana (Tabla 3). Higo. 4b muestra los cromatogramas representativos de LMPD-liposoma con o sin la fracción de membrana.
(a) Inhibición competitiva de la LMPD en liposomas. La sonda de péptido de fluorescencia se incubó con Control-lipo (EPC /DOPE /CHEMS) o LMPD-lipo (EPC /DOPE /CHEMS /3 mol% LMPD) a las concentraciones LMDP indicados en presencia de la fracción de membrana de las células A549 en 37 ° C durante la noche. columnas blancas y negras indican Control-lipo o LMPD-lipo, respectivamente. (B) cromatogramas representativos de LMDP-liposomas, con o sin la fracción de membrana como se determina por análisis de HPLC a partir de tres experimentos independientes. distribución (c) Tamaño de los liposomas en presencia de la fracción de membrana obtenida a partir de células A549 con o sin inhibidor de la γ-secretasa se midió usando el nano Zetasizer. línea continua y la línea de puntos indican Control-lipo y LMPD-lipo, respectivamente. (D) índice de polidispersidad (PDI) del pico utilizando Control-lipo o LMPD-lipo. Blanco, columnas grises y negros indican los liposomas solos, los liposomas en presencia de una fracción de membrana de células A549 o liposomas en presencia de una fracción de membrana con 10 mM DAPT, respectivamente. (E) distribución Abundancia del pico para el Control-lipo (círculos negros) y LMPD-lipo (triángulos negros) en las mismas condiciones que (d). (Los valores y las barras representan las medias y SD, respectivamente *, P & lt;. 0,05 y ***, P & lt; 0,001 frente al 0 M LMPD (a), Control-lipo (c, d), n = 3.
a continuación, se evaluó el cambio de tamaño de partícula LMPD-lipo en presencia de la γ-secretasa que contiene-fracción de membrana. también se evaluó la influencia del tamaño de las partículas en presencia de N- [N- (3, 5-difluorophenacetyl) -L-alanil] -S-fenilglicina éster t-butilo (DAPT), un inhibidor de la γ-secretasa. El efecto inhibidor de DAPT se confirmó mediante el uso de una sonda de péptido sustrato. Específicamente, la actividad de γ-secretasa fue inhibida en un 60% mediante la adición de DAPT (Fig. S3). la Fig. 4b muestra que la distribución de tamaño de partícula de LMPD-lipo se amplia en comparación con el control-lipo en presencia de una fracción de membrana. Esta amplia distribución se inhibió por tratamiento con DAPT. el índice de polidispersidad (PDI) de LMPD-lipo se incrementó significativamente en presencia de la fracción de membrana en comparación con el control-lipo, una diferencia que se redujo mediante el tratamiento con DAPT. Además, el PDI en Control-lipo se trató con la fracción de membrana se incrementó ligeramente en comparación con el de Control-lipo sin la fracción de membrana. Sin embargo, este aumento no fue cambiado por co-tratamiento con el inhibidor de la γ-secretasa, DAPT, lo que sugiere que el aumento de la PDI en Control-lipo se debió a la presencia de la fracción de membrana. (Fig. 4c). La distribución de la abundancia del pico principal de los liposomas se comparó en la ausencia o presencia de la fracción de membrana. La abundancia del pico principal de LMPD-lipo se redujo significativamente en presencia de la fracción de membrana. Estos cambios fueron suprimidos por DAPT, y no se observó en el control-lipo (Fig. 4d). Estos resultados sugieren que la distribución del tamaño fue alterado porque LMPD se escindió por γ-secretasa, causando la desestabilización de la membrana liposomal y el cambio de tamaño de partícula.
liberación γ-secretasa dependiente de cargas de LMPD-lipo
Hemos examinado si la liberación de cargas depende de la actividad de γ-secretasa. Por lo tanto, LMPD-lipo calceína encapsular se mezcló con la fracción de membrana a partir de células A549, células HeLa, las células MCF-7 o HUEhT-2 células. Cuando LMPD-lipo se mezcló con fracciones de membranas aisladas de células A549 y células MCF-7 con actividades muy altas gamma-secretasa, la fuga de calceína aumentó en comparación del control-lipo. El aumento de las fugas se suprimió significativamente por el tratamiento con DAPT. Por otra parte, las fugas de calceína no aumentó cuando se usaron fracciones de membrana de células HeLa y células normales HUEhT-2 (actividad γ-secretasa ligeramente alta o baja, respectivamente) (Fig. 5). Por lo tanto, los resultados sugieren que la liberación de cargas de LMPD-lipo es dependiente de alta actividad γ-secretasa en células de cáncer.
Control-lipo (EPC /DOPE /CHEMS) o LMPD-lipo (EPC /DOPE /CHEMS /5% molar LMPD) se incubó en presencia de la fracción de membrana de HUEhT-2 células (columnas blancas), células HeLa (columnas punteadas), células MCF-7 (columnas rayadas), células A549 (columnas negras) , o células A549 con 10 DAPT mu M (columnas grises) a 37 ° C durante 1 h. Los datos representan la media ± S. D. (N = 3-7) *, P & lt; 0,05, **, P & lt; 0,01 y ***, P & lt;. 0.001
liberación intracelular de cargas de LMPD-lipo
a continuación examinó la transferencia de cargas desde LMPD-lipo en células cultivadas utilizando la línea A549. Los resultados en la Fig.