Extracto
El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer tanto para hombres como para mujeres. El diagnóstico precoz del cáncer de pulmón tiene una tasa de supervivencia a 5 años del 48,8%, sin embargo, casi el 35% de los pacientes en estadio I reincide después de la resección quirúrgica, por tanto, que augura un mal pronóstico. Por lo tanto, la detección de cáncer de pulmón en etapa temprana y la identificación aún más los pacientes de alto riesgo permitiría la oportunidad de proporcionar la terapia adyuvante y posiblemente aumentar la supervivencia. Existe evidencia considerable de que el sistema inmune produce una respuesta de autoanticuerpos a las células neoplásicas. La detección de tales anticuerpos se ha demostrado que tienen valor diagnóstico y pronóstico. Aquí nos aprovechamos de la técnica de alto rendimiento Luminex para multiplexar un total de 14 autoantígenos asociados a tumores para detectar el autoanticuerpo de la sueros de pacientes. Los 14 antígenos se expresaron por el sistema /traducción in vitro de transcripción con HaloTag en N-terminal. Las proteínas de fusión se inmovilizaron covalentemente sobre las microesferas Luminex conjugados por el ligando de halo-link, eliminando así el procedimiento de purificación de proteínas. Las muestras de suero de pacientes con cáncer y controles sanos fueron interactuaron con el complejo antígeno-microesfera para medir los autoanticuerpos. Hemos desarrollado un sistema de detección multiplex rápido para la medición de la firma de autoanticuerpos de sueros de pacientes con mínima reacción cruzada. Un panel de siete biomarcadores de autoanticuerpos ha generado una AUC & gt; 80% en la distinción de los cánceres de pulmón de los controles sanos. Este estudio es el primer informe mediante la combinación de la plataforma Luminex y la tecnología para detectar HaloTag respuesta inmune humoral en pacientes con cáncer. Debido a la flexibilidad de la tecnología Luminex, este enfoque se puede aplicar a otros condiciones tales como infecciosa, neurológicos, y enfermedades metabólicas. Uno puede imaginar que este sistema Luminex múltiplex, así como el grupo de siete biomarcadores podrían ser utilizados para detectar la población de alto riesgo con la prueba de TC posterior basado en el resultado de la prueba de sangre
Visto:. Jia J, Wang W , Meng W, Ding M, Ma S, Wang X (2014) Desarrollo de un análisis de autoanticuerpos múltiplex para la detección de cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (4): e95444. doi: 10.1371 /journal.pone.0095444
Editor: Nupur Gangopadhyay, Universidad de Pittsburgh, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Octubre 2013; Aceptado: March 27, 2014; Publicado: 22 de abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Jia et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales (81172072), la Fundación Ciencia para la Distinguidos jóvenes estudiosos (R2101405), el Programa de Desarrollo de Infraestructura y de las instalaciones del Departamento de la provincia de Zhejiang Ciencia y Tecnología (2011F10015), comandante de la ciencia y el Proyecto de Innovación de Tecnología de Hangzhou ( 20112313A01), china. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer tanto para hombres y mujeres en todo el mundo. En 2012, se estimó que 226,160 personas serían diagnosticadas con cáncer de pulmón y 160,340 pacientes podrían morir a causa de su enfermedad. La tasa de supervivencia global a 5 años para los pacientes actual es del 16% hasta el año 2007, entre los más bajos de todos los cánceres, lo que ha mejorado sólo marginalmente en los últimos diez años [1]. La mayoría de los pacientes con cáncer de pulmón se diagnostican en las etapas finales de los años /distante por lo tanto con baja tasa de supervivencia, debido a la falta de síntomas perceptibles en las primeras etapas de la tumorigénesis [2].
Los datos sugieren que el diagnóstico de los cánceres de pulmón cuando se es pequeño y definido localmente puede aumentar las posibilidades de curación [3], [4]. El diagnóstico precoz del cáncer de pulmón podría mejorar significativamente la tasa de supervivencia a 5 años hasta el 48,8% frente al 3,3% en los últimos tiempos /lejana etapa [5]. Por lo tanto, la detección de cáncer de pulmón en etapa temprana y la identificación de pacientes de alto riesgo proporcionaría potencial terapia adyuvante y posiblemente aumentar la supervivencia.
Los métodos actuales para el diagnóstico de cáncer de pulmón requieren una biopsia y el examen patológico de la tejido por lo general después del descubrimiento de la lesión en la radiografía de tórax o tomografía computarizada. Actualmente no existe una prueba de sangre para el cáncer de pulmón. Varios enfoques han sido desarrollados para identificar biomarcadores para el diagnóstico de cáncer de pulmón [6], [7]. Entre éstos, el sistema inmune se ha demostrado para producir autoanticuerpos contra las células neoplásicas, así como antígenos asociados a tumores dysregulated [8], [9], por lo tanto, la detección de tales anticuerpos tienen valor diagnóstico y pronóstico [10], [11]. Lo más importante, las respuestas inmunes humorales existen varios meses o años antes de los síntomas clínicos, por lo tanto los autoanticuerpos se podrían utilizar para el diagnóstico precoz de pacientes con cáncer [7], [9], [12]. Además, se ha informado que las células B y los anticuerpos asociados a células B de novo promueven la carcinogénesis [13], lo que sugiere que la respuesta inmune humoral puede jugar un papel directo en la progresión del cáncer.
(1) Los HaloTag amina ligandos se conjugaron con perlas magnéticas Luminex a través del ácido carboxílico activado de grupo radical COOH. Diferente color representa diferentes tipos de perlas Luminex. (2) Los recombinantes proteínas etiquetadas-halo se inmovilizaron covalentemente sobre las perlas Luminex conjugados con ligando HaloTag a través de enlazadores cloroalcano reactivos en ligandos. Cada cuenta se inmovilizó con diferentes proteínas por separado. (3) - (4) debido a la unión covalente, cada complejo grano-proteína fue individualmente a través de lavar vigorosamente y luego se combinan para hacer que la piscina de microesferas. (5) La piscina de microesferas acoplado a proteína fue entonces igualmente alícuotas en una placa de 96 pocillos. Cada pocillo contiene múltiples biomarcadores autoantígeno y se puede utilizar para una sola muestra de suero. (6) Los autoanticuerpos en sueros unidos a las microesferas de antígeno conjugado, y se detectaron por conjugado R-ficoeritrina anticuerpo anti-humano. La señal se leyó en Luminex 200 Bioanalyzer.
En este estudio, se describe un sistema de diagnóstico no invasivo en la plataforma Luminex xMAP para detectar autoanticuerpos en suero para el diagnóstico de cáncer de pulmón. Los autoantígenos candidatos fueron seleccionados de la literatura y expresadas por sistema de traducción in vitro de transcripción /usando HaloTag en N-terminal. Sin purificación, las proteínas recombinantes se inmovilizaron covalentemente en Luminex talón. Las muestras de suero se incubaron con el complejo grano-autoantígeno para medir la cantidad de autoanticuerpos. Un panel de siete antígenos, a saber, p53, NY-ESO-1, de Livin, Ubiquilin1, BIRC, p62 y PRDX, se utilizaron en un modelo estadístico multivariante para distinguir a los pacientes de cáncer de controles sanos. Este es el primer estudio de detección de autoanticuerpos en la tecnología multiplex Luminex.
Materiales y Métodos
La expresión de proteínas recombinantes
El ADNc durante 14 autoantígenos se clonaron en el vector de Flexi ( Promega, EE.UU.) con un HaloTag en N-terminal. El halo etiquetada proteínas recombinantes se expresaron por el sistema in vitro de transcripción /traducción (Promega). La proteína HaloTag también fue producido como proteína negativa. Las proteínas se detectaron por transferencia de Western usando anticuerpo de conejo anti-HaloTag (Promega).
Western Blot Ensayo
halo etiquetada proteínas recombinantes se expresaron por
in vitro
de transcripción /traducción sistema, y después se somete a Western Blot. Brevemente, un total de 3 l de lisado de proteína se cargó en 12% SDS-PAGE, después se transfirieron electroforéticamente a membrana de PVDF (GE). El lisado de proteína con la proteína HaloTag única (31 kDa) estaba cargando como control. Después del bloqueo, las membranas se transfirieron con anticuerpo de conejo anti-HaloTag (Promega), seguido de incubación con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (Proteintech). Las señales de la proteína fueron detectados por ECL reactivo (GE), y se fotografiaron usando el sistema de análisis de imágenes de quimioluminiscencia Alpha INNOTECH Fluor Chem FC2 (Alpha Innotech).
Las muestras de suero de pacientes
El estudio fue aprobado por el Junta de Revisión institucional de la Academia de Ciencias de Zhejiang de Medicina. Todos los participantes que proporcionaron sueros dieron su consentimiento informado por escrito.
Los pacientes con cáncer de pulmón se recogieron localizada en el Departamento de Oncología, el hospital primeros de la gente Hangzhou desde agosto de 2010 hasta marzo de 2012. Un total de 117 muestras de pacientes cumplido los siguientes criterios de elegibilidad para este estudio: 1) por cáncer de pulmón clínicamente localizado confirmado por biopsia, 2) sin la terapia del cáncer de pulmón antes, 3) fecha de suero tomada fue inmediatamente antes de la fecha de la cirugía, 4) no hay otras enfermedades malignas concurrentes y autoinmunes enfermedades. De estos 117 muestras, 44 muestras fueron escogidos al azar para ser utilizado en el desarrollo y la validación de la plataforma Luminex, mientras que 25 muestras se utilizaron para la selección de biomarcadores, y se utilizaron los de descanso de 48 muestras para el análisis de biomarcadores multiplex. Del mismo modo, para servir como sujetos de control, el hospital proporcionó 110 muestras de suero en el rango de edad de 29 a 76, sin antecedentes de cáncer recogidos entre 2011 y 2012. Estas 110 muestras también fueron divididos aleatoriamente en tres grupos en este estudio, en concreto 35 muestras para el desarrollo de Luminex, 25 muestras para la selección de biomarcadores y 50 muestras para el análisis multiplex.
Conjugación del HaloTag amina ligando a Luminex microesferas
la cantidad mínima de HaloTag amina (O4) ligando (Promega, EE.UU.) para la máxima eficiencia de conjugación en las microesferas Luminex (Luminex Corp.) se determinó de la siguiente manera. Un total de 5 × 10
6 microesferas magnéticas Luminex se conjuga con una serie de dilución de HaloTag amina Ligando: 0,0016 mg, 0,008 mg, 0,04 mg, 0,2 mg, 1 mg. Brevemente, las microesferas se suspendieron en una solución de 100 MES mmol /L (pH 6,0), que contiene 5 mg /ml de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (Thermo Scientific) y HaloTag amina ligando. Después de una incubación de 2 horas en la oscuridad, las microesferas se lavaron y se resuspendieron en 100 MES mmol /L (pH 4,5), y se almacenaron a 4 ° C.
Las microesferas Luminex junto con HaloTag ligando se incubaron con proteína HaloTag purificada en una serie de dilución de 0 mg a 5 mg. El MFI (intensidad media de fluorescencia) representa la señal de unión y se detectó mediante el anticuerpo anti-HaloTag.
Desarrollo y Validación de la proteína-microesfera Complejo
El complejo ligando-microesfera en diferentes regiones del grano se incubó separadamente con proteínas de fusión recombinantes HaloTag a temperatura ambiente en oscuridad durante 60 minutos. Después de la incubación, las microesferas se lavaron con PBS que contenía 0,1% de BSA y 0,5% de Tween 20, y se resuspendieron en PBS que contenía 0,1% de BSA para su validación.
La cantidad de proteína conjugado con la microesfera se midió usando anticuerpo comercial ( anticuerpo anti-p62 de conejo, anticuerpo de conejo anti-p53, Santa Cruz) contra cada proteína diana. Brevemente, diluciones en serie de cada anticuerpo (que van de 0 a 5 g /ml en PBS, 1% BSA) se incubaron con 3.000 microesferas conjugadas con diferentes proteínas en una placa de 96 pocillos durante 1 hora. Después del lavado con PBS /1% de BSA, las microesferas se incubaron con R-ficoeritrina anticuerpo secundario conjugado durante 30 minutos. El complejo resultante se lavó de nuevo y se resuspendió en PBS /BSA al 1% antes de seguir leyendo Luminex 200 Bioanalyzer (Luminex Corporation). El valor de MFI representa la señal de unión.
Para probar la capacidad de detección del sistema Luminex, 44 cáncer y 35 muestras de suero de control de la salud fueron seleccionados al azar, y el autoanticuerpo NY-ESO-1 se midió por el sistema Luminexe. En pocas palabras, las diferentes microesferas conjugadas con recombinante NY-ESO-1 y HaloTag por separado se combinaron y se dividen en partes alícuotas en una placa de 96 pocillos. Las muestras de suero se diluyeron en 1:200 en PBS /1% BSA y se incubaron con las perlas durante toda la noche a 4ºC con agitación. Las señales de autoanticuerpos fueron detectados por R-ficoeritrina anticuerpo policlonal anti-humana conjugada (Rockland) durante 0,5 horas con agitación constante. Después de tres lavados, el complejo de reacción se volvió a suspender en PBS /1% de BSA para la lectura en Luminex 200 Bioanalyzer. Los valores de MFI estuvieron representados por las IFM (NY-ESO-1) menos IMF (HaloTag).
Las intensidades de fluorescencia se compararon también con un kit ELISA comercial (biovalor, EE.UU.). El experimento se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La detección de autoanticuerpos en el suero
Diferentes microesferas conjugadas con proteínas recombinantes y HaloTag por separado se combinaron y se dividió en alícuotas en una placa de 96 pocillos para detectar la de autoanticuerpos en el suero. Las muestras de suero se diluyeron en 1:200 en PBS /1% BSA y se incubaron con las perlas durante la noche a 4 ° C con agitación. Las señales de autoanticuerpos fueron detectados por Luminex como se ha descrito anteriormente.
Análisis estadístico
Tanto los análisis se utilizaron univariados y multivariados. Las diferencias entre los dos grupos se evaluaron mediante la prueba t de Student. La correlación entre los sistemas de un solo complejas y multi-plex o entre ELISA y Luminex sistema de un solo complejo se evaluó mediante el coeficiente de correlación de Pearson (R). Clase de predicción fue examinada usando el paquete de herramientas BRB-Array (versión 3.6), disponible en http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html. Todos los cálculos se realizaron utilizando el lenguaje de programación R estadística (http://cran.r-project.org/) y los paquetes de Bioconductor. El análisis estadístico se realizó utilizando el software SPSS 13.0 (SPSS), GraphPad Prism 5.0 y Excel. p & lt; 0,05 se consideró como estadísticamente significativa
Resultados
El enfoque general del estudio se representa en la Fig.. 1 |
Con el fin de inmovilizar covalentemente las proteínas recombinantes para la microesfera Lumimex, el ligando amina HaloTag se conjugó primero en las microesferas Luminex a través del ácido carboxílico activado del grupo radical COOH a diferentes concentraciones (Fig. 2A). La eficacia de acoplamiento aumentó de una manera dependiente de la concentración como se detecta por HaloTag proteína estándar (Fig. 2A). Además, la IMF llegó a la meseta a 0,2 mg y 1 mg de ligando de amina, lo que indica la saturación del ligando de amina en la superficie de la perla. En este estudio, se utilizó 0,2 mg de ligando para conjugar la microesfera.
(A) La titulación del HaloTag amina ligando conjugado en las microesferas Luminex. La proteína estándar HaloTag purificada se utilizó para detectar la eficacia de la conjugación de una serie de concentraciones. El MFI (intensidad de fluorescencia media) representa la señal de unión detectada por el anticuerpo anti-HaloTag. (B) Validación del complejo de microesferas Luminex junto con HaloTag Amina ligando. Las perlas Luminex se acoplaron con 0,2 mg de la HaloTag ligando y las señales se detectaron como (A).
La microesfera Luminex conjugado por 0,2 mg de ligando amina se confirmó adicionalmente usando proteína estándar HaloTag a diferentes concentración. Los datos demostraron que el máximo IMF incluso a 1,25 g de la proteína estándar que demuestra la condición óptima conjugación (Fig. 2B)
.
A la pantalla de forma rápida los autoantígenos candidatos, un panel de 14 proteínas se expresa por
vitro
sistema de transcripción /traducción in. Después de confirmada por Western blot (Fig. 3A), las proteínas de fusión recombinantes con la HaloTag se incubaron directamente con el complejo de microesferas-ligando sin la purificación de proteínas. El enlace covalente entre HaloTag y formas de ligando rápidamente bajo condiciones fisiológicas generales y es altamente específica y esencialmente irreversible, produciendo un complejo que es estable incluso en condiciones rigurosas. La cantidad de proteína inmovilizada a la microesfera Luminex individuo se examinó a continuación utilizando los anticuerpos comerciales contra las proteínas antigénicas correspondientes. Como se muestra en la Fig. 3B, las señales de las IFM se midieron en una forma dependiente de la concentración detectada por los anticuerpos anti-p62 y anti-HaloTag.
(A) El representante de Western Blot de los autoantígenos recombinantes con HaloTag en el extremo N-terminal expresada por in vitro la transcripción /sistema de traducción. (B) Validación de las microesferas Luminex, junto con las proteínas recombinantes HaloTag. Las proteínas inmovilizadas se detectaron por los anticuerpos anti-p62 y anti-HaloTag por separado y las señales eran de una manera dependiente de la concentración. (C) Comparación de la autoanticuerpo NY-ESO-1 en el suero detectada por Luminex y ELISA. Un total de 44 cánceres de pulmón y 35 controles sanos fueron seleccionados al azar para comparar el autoanticuerpo NY-ESO-1 medido por el sistema Luminex y el ensayo ELISA. R
2 = 0,92 indica la alta correlación entre las plataformas de Luminex y ELISA para la detección de NY-ESO-1 de autoanticuerpos.
Para investigar si el sistema Luminex puede detectar el autoanticuerpo del espécimen humano, 44 de pulmón cáncer y 35 muestras de suero sanos fueron seleccionados al azar y el autoanticuerpo NY-ESO-1 se comparó con el sistema Luminex y un kit de ELISA comercial (biovalor, EE.UU.). Ambas plataformas ensayo detectó la cantidad significativamente mayor de autoanticuerpo NY-ESO-1 en pacientes con cáncer en comparación con los controles sanos (Fig. 3C). análisis de regresión lineal unario reveló que el coeficiente de correlación (Pearson r) fue de 0,92 para los anticuerpos NY-ESO-1 medidos por ambas técnicas Luminex y ELISA, lo que sugiere que dos métodos tenían un alto grado de acuerdo en la detección de NY-ESO-1 autoanticuerpo (
p
. & lt; 0,01)
A continuación desarrolló el sistema Luminex multiplexado. Cuatro complejos de proteínas en microesferas (NY-ESO-1, p53, p62, y PRDX), así como una perla conjugada HaloTag como control de referencia fueron igualmente combinaron y se distribuyeron en una placa de 96 pocillos. El anticuerpo anti-p53 se utilizó para detectar la microesfera p53 en este sistema multiplex. Los datos mostraron que las señales de las IMF están altamente correlacionados con los del sistema de cuentas individuales (single-plex) (Fig. 4A) demostrando el sistema múltiplex es válida para la detección de autoanticuerpos. Además, salvo la microesfera p53, todos los demás microesferas incluyendo NY-ESO-1, p62, PRDX producen las señales de fondo que indican que no había reactividad cruzada entre las perlas en este sistema multiplex (Fig. 4B).
(a) Comparación de las perlas de p53 acoplado en un sistema multiplex (múltiples cuentas) singleplex (perla individual) y. El valor MFI se detectó mediante una dilución serie de anticuerpo p53. (B) No reactividad cruzada entre diferentes biomarcadores en el sistema multiplex. Un sistema multiplex que contiene cinco microesferas, junto con NY-ESO-1, p53, p62, PRDX y HaloTag separado se incubó con anticuerpo p53, y sólo las microesferas p53 reaccionó con el anticuerpo anti-p53, mientras que otras microesferas detectan los valores de fondo IMF. (C) La correlación de la señal de las microesferas de p53 en el sistema singleplex y multiplex. (D) Igual que (C) pero utilizando microesferas p62 acoplado.
A continuación trató de probar la correlación de ambos sistemas Luminex de una o varias complejas mediante la comparación de las señales de autoanticuerpos de muestras de suero seleccionadas al azar detectado por ambos sistemas por separado. Como se muestra en la Fig. 4C y la Fig. 4D, el coeficiente de correlación (Pearson r) fue de 0,84 para la microesfera p53 (
p
& lt; 0,01), mientras que 0,81 para la microesfera p62 (
p
& lt; 0,01), El Pearson r también estaba por encima de 0,80 para otros complejos de proteínas en microesferas (datos no mostrados), indicando la alta correlación entre los sistemas de una o varias complejas.
con base en el sistema Luminex múltiplex, que examinaron un grupo de 14 candidatos a autoantígenos detectar los anticuerpos circulantes de cáncer de pulmón 25 independiente y 25 controles sanos seleccionados al azar de la cohorte de la muestra en este estudio. Siete autoantígenos, incluyendo p62, BIRC, de Livin-1, p53, PRDX, NY-ESO-1 y ubiquilin, produjo los notablemente más altas señales IMF en pacientes con cáncer de pulmón en comparación con los controles sanos (Mann-Whitney de valor p & lt; 0,05) (Fig . 5).
a continuación se determinó si el panel de 7 biomarcadores podría utilizarse para la detección no invasiva de pacientes con cáncer de pulmón. Se seleccionaron 48 cánceres de pulmón independientes y muestras de suero de control 50 con varios tipos de cáncer de pulmón y las etapas por el sistema multiplex Luminex. Los parámetros básicos de los pacientes de cáncer 48 y 50 controles se resumen en la Tabla 1, incluyendo la edad, el sexo, el tabaquismo y el estado de la bebida. Después de la separación en cáncer y de control de las clases, la precisión de la predicción resultado binario se estimó utilizando diferentes algoritmos de aprendizaje automático disponibles en BRB Herramientas matriz. El valor de cada muestra para cada uno de esos 7 biomarcadores se multiplica por los coeficientes correspondientes derivados de regresión logística univariada en el conjunto de entrenamiento con el cáncer /control como una variable de respuesta binaria, y luego se sumaron los valores. Las puntuaciones de índice creados se evaluaron a continuación por la curva ROC, que proporcionó un índice puro de la precisión de una prueba por el trazado de la sensibilidad contra 1- especificidad para cada valor resultado de la prueba. Tres algoritmos de predicción se utilizaron para generar la República de China, incluyendo el compuesto predictor de covarianza (PCC), diagonal análisis discriminante lineal (DLDA), y el compuesto bayesiano predictor de covarianza (BCCP). En particular, el análisis arrojó un ROC muy comparable para los tres algoritmos con AUC de 0,82 (CCP), 0,81 (DLDA), 0,81 (BCCP), respectivamente (Fig. 6), lo que demuestra la fuerte poder de discriminación de los 7 biomarcadores. No hay correlación con la edad, el sexo, se observó el estado de fumar o beber para este panel de biomarcadores.
Discusión
La detección de los anticuerpos circulantes contra antígenos asociados a tumores es un enfoque prometedor para el diagnóstico precoz del cáncer, y las tecnologías han sido ampliamente desarrollado [14], [15]. Hasta la fecha, ELISA es el método convencional para la detección de autoanticuerpo en suero, pero su aplicación en la firma de autoanticuerpos multiplexación es limitado. Recientemente, las tecnologías de microarrays de proteínas y Luminex xMAP se adoptaron para medir el panel serológica de autoanticuerpos [16], [17].
Luminex xMAP es una plataforma de alta a lo largo con una sensibilidad superior y la especificidad de ELISA [18], [19 ], [20]. En este estudio, hemos descrito un método simple de Luminex basado en la tecnología HaloTag para detectar los autoanticuerpos de sueros de pacientes. Las proteínas HaloTag se unen covalentemente a los ligadores cloroalcano conjugados con las microesferas [21], [22]. Debido a la unión covalente específica, el halo-etiquetados lisados de proteínas de fusión en bruto se inmovilizan de forma selectiva a las perlas Luminex y posteriormente pasan a través de la etapa de lavado vigoroso, omitiendo así el procedimiento de purificación de proteínas tedioso.
Está bien establecido que la multiplexación biomarcadores individuales (es decir, de autoanticuerpos de perfiles) podrían aumentar significativamente la sensibilidad y especificidad de biomarcadores de cáncer en la discriminación de los pacientes de cáncer de controles sanos [23]. El objetivo de este estudio fue para tomar ventaja de la técnica de Luminex para multiplexar un panel de 14 autoantígenos asociados a tumores en la detección de pacientes con cáncer de pulmón. Se seleccionaron estos autoantígenos en base a su rendimiento en la distinción de tipos de cáncer de los controles sanos descritos en la literatura. Por ejemplo, se detectó autoanticuerpo p53 en aproximadamente el 15% de los pacientes con cáncer [24], [25]. Ubiquilin 1 se encontró que era un biomarcador prometedor para el cáncer de pulmón con un AUC de más de 0,7 [26]. Livin-1 autoanticuerpos se informó en 19 de 37 pacientes con cáncer de pulmón (51,3%) [27]. Además, 25 (47%) de 53 pacientes con CPNM se dio positivo para autoanticuerpos contra PRDX en el suero [28]. Autoanticuerpos a NY-ESO-1, BIRC y p62 también fueron detectados en pacientes con cáncer de pulmón con un 20%, 19,5% y 18,8%, respectivamente, la sensibilidad [29], [30], [31].
Multiplex la antígenos asociados a tumores han sido ampliamente explorado por ELISA [32], [33], [34], [35], [36] o de microarrays [37]. Este estudio es el primer informe mediante la combinación de la plataforma Luminex y la tecnología para detectar HaloTag respuesta inmune humoral en pacientes con cáncer de pulmón. El panel de biomarcadores 7 alcanza más del 80% de precisión en la detección de cáncer de pulmón de los controles sanos. Estos autoanticuerpos, sin embargo, no tienen ninguna asociación con la histología del tumor, las etapas y tipos debido al límite de tamaño de la muestra. Por lo tanto, se requerirá estudio de seguimiento en una gran cohorte de pacientes con una mezcla de tipos de tumores y etapas para validar el rendimiento de los autoanticuerpos a través de histologías tumorales y tipos, sobre todo, la correlación entre la malignidad de la enfermedad y el título de autoanticuerpos. Uno puede imaginar que este sistema Luminex multiplex, así como el grupo de siete biomarcadores se podrían utilizar para detectar la población de alto riesgo con la posterior prueba de CT basado en el resultado de la prueba de sangre.
Explotación de la respuesta inmune a los tumores ofrece una oportunidad única para el desarrollo de nuevas herramientas para la detección serológica de cáncer, así como una ventaja para la terapia. Una prueba basada en la demostración de autoanticuerpos frente a antígenos tumorales en el suero de los pacientes podría ser de gran importancia para la detección precoz del cáncer debido a la evolución en el tiempo prolongado de la carcinogénesis y debido a que un nivel detectable de anticuerpos contra el estímulo carcinógeno podría formar bien antes de que el fenotipo tumoral surge. Al igual que otros tipos de cáncer, el cáncer de pulmón se desarrolla como los resultados de la descarrilamiento de los procesos de regulación heterogéneos y múltiples. Por lo tanto, no es un solo biomarcador que necesita ser dilucidado. patrones de biomarcadores multiplexadas tienen un valor predictivo positivo significativamente mayor que los marcadores individuales en pacientes enfermos discriminantes de controles sin cáncer.
El análisis de autoanticuerpos es una gran promesa, pero mucho más investigación con muestras amplias es necesario para confirmar la fiabilidad de la prueba y adaptar la técnica para la detección de masas. Además, los médicos también necesitan aprender si el diagnóstico precoz mejora el pronóstico para los pacientes con cáncer de pulmón, lo que ayuda a producir anticuerpos para el tratamiento de la enfermedad. Por lo tanto, reduciendo la brecha entre la ciencia básica y la práctica clínica representa el principal objetivo en un futuro próximo para permitir a los médicos adaptar las estrategias de detección y tratamiento de riesgo ajustada para pacientes con cáncer de pulmón actuales.