Extracto
Hyaluronan-ligado proteína 1 (HAPLN1) que se ha demostrado ser altamente expresado en los mesoteliomas pleurales malignas (MPM), se detectó en el suero utilizando un método de superficie-imprinting electroquímica. En primer lugar, el método de detección se optimizó usando albúmina de suero bovino (BSA) como proteína modelo para imitar las condiciones óptimas requeridas para imprimir la HAPLN1 proteína de peso molecular similar. BSA se imprima en el electrodo de oro con terminados en hidroxilo alcanotioles, que formaron una monocapa auto-ensamblado (SAM) alrededor de BSA. entonces el analito (BSA) se elimina por lavado y se utilizó su huella (cavidad vacía con memoria de forma) para la detección de BSA en una solución, utilizando el método de potencial electroquímico de circuito abierto, es decir, la potenciometría. Los factores considerados para optimizar las condiciones incluyen el tiempo de incubación, la concentración de proteína, límite de detección y el tamaño del electrodo. se utilizó la matriz asistida por láser de desorción ionización de tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) para confirmar la selectividad de las improntas. Con los parámetros de control de impresión obtenidos, HAPLN1 fue impreso por duplicado y la detección de HAPLN1 púas se llevó a cabo con éxito en el suero
Visto:. Mathur A, S Blais, Goparaju CMV, Neubert T, H Pass, Levon K ( 2013) Desarrollo de un biosensor para la detección de mesotelioma pleural biomarcador del cáncer de Uso de impresión de datos de superficie. PLoS ONE 8 (3): e57681. doi: 10.1371 /journal.pone.0057681
Editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Estados Unidos de América
Recibido: 10 de mayo de 2012; Aceptado 28 de enero de 2013; Publicado: 13 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Mathur et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio ha sido financiado por una subvención del ejército (W911NF-09-1-0499) para la detección de patógenos Potentiomeric. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Una posible cura del cáncer sería más probable si la enfermedad podría ser detectado a tiempo para la optimización de los procedimientos terapéuticos. matriz extracelular (ECM) tiene su importancia no sólo para el soporte físico de diversas células, sino también en las interacciones célula-célula, la señalización celular y los procesos de reparación celular. Por lo tanto las proteínas ECM mismos presentan un potencial objetivo de seguimiento que reflejen los cambios en curso. Si los cambios se producen debido a la presencia de una enfermedad tal como el cáncer, la detección de estos cambios sería una divulgación presuntivo de cáncer antes de que aparezcan los síntomas. Como un ejemplo, la enzima heparanasa [1], una endo-ß-glucuronidasa, es una enzima multifuncional que influye pasos clave del desarrollo de numerosos tipos de cánceres tales como gástrico [2], no pequeñas de pulmón [3], de esófago [4] , cabeza y cuello [5], de mama [6] y de páncreas [7] cánceres como ejemplos.
escinde enzimáticamente heparanasa sulfato de heparina y con serina proteinasas y metaloproteinasas desempeña un papel crucial en la remodelación de la matriz extracelular asociada tanto con in situ tumores de crecimiento y la invasión relacionados con la metástasis de las células cancerosas. La forma enzimáticamente inactiva de la heparanasa se ha demostrado que afectan a la señalización celular, y aumentando así el crecimiento del cáncer con la regulación positiva de varios genes de expresión [8]. biomarcadores comerciales para supervisar la actividad de mesotelioma inducidas por el amianto son mesotelina y mesotelina soluble péptido relacionado (SMRP). La osteopontina (OPN) y CA125 de manera similar se han relacionado con la actividad heparanasa relacionadas con el cáncer, además de ácido hialurónico, TRA y ferritina. Los acontecimientos de remodelación de ECM pueden ciertamente ser una diana para el diagnóstico de las primeras etapas de la invasión del cáncer [9], así como objetivos para los tratamientos anti-cancerosos. El ácido hialurónico (hialuronano, hialuronato, HA) es una lineal, glicosaminoglicano muy alto peso molecular, es una de las proteínas más abundantes de ECM. HA se ha demostrado que existen en altos niveles en colorrectal, de ovario epitelial, y cánceres de mama [10] - [12], y también la inhibición del crecimiento del tumor se ha evidenciado cuando se han visto afectados motivos de unión de HA [13]. HA sobreexpresión depende en gran medida de la CD44, por lo que la regulación del crecimiento de cáncer de vejiga, la invasión y la angiogénesis se demostró que se produzca a través de la CD44 por HA sintasa-1 de expresión [14]. Como la expresión HA parece ser claramente superior a la aparición de cáncer, esto no es sorprendente que Ivanova et al han demostrado que también la proteína HAPLN1, que ayuda a unir proteoglicanos a un núcleo de HA, se ha demostrado ser elevados en células de cáncer.
el mesotelioma pleural maligno es una neoplasia poco frecuente causada por la exposición al amianto, que tiene un mal pronóstico. El cartílago proteína de enlace HAPLN1 está siendo estudiado como un biomarcador candidato, que se encuentra sobreexpresada en la etapa mesotelioma 1 junto con una osteopontina biomarcadores de cáncer altamente expresado (OPN1) situado en el mismo conjunto de genes [15]. Los inmunoensayos se usan comúnmente para la detección de biomarcadores de cáncer, ya que muestran selectividad superior, pero puede ser largo y costoso. Las características biológicas de marcadores como heparanasa enfatizan la importancia de diseñar métodos eficaces de costes que permiten la detección temprana de tales biomarcadores en suero y tejidos tanto para fines de diagnóstico y pronóstico, así como para el seguimiento de tratamientos contra el cáncer.
También detección de muy baja concentración de tales biomarcadores con las pruebas de ELISA es difícil. Por lo tanto, hay una necesidad urgente para el desarrollo de nuevas tecnologías, que son rápida y muy sensible para detectar bajas concentraciones de biomarcadores. El diagnóstico precoz proporcionará más tiempo para el tratamiento del cáncer, que es crucial para salvar una vida. polímeros de impresión molecular están siendo considerados como un sustituto adecuado para sistemas basados en anticuerpos como biosensores, debido a la mayor estabilidad y capacidad de reutilización de las superficies bio-reconocimiento [16]. Los biosensores se componen de dos componentes, elemento bio-receptor y de componentes de transducción de señales. Una superficie de bio-receptor hecha con polímeros de impresión molecular sería de dos órdenes de magnitud más barato que los anticuerpos. Como el precio del polímero hidroxilado alcanotiol costaría alrededor de $ 0,2-0,6 mg
-1 en comparación con los anticuerpos, que varían en función del objetivo. Los anticuerpos generados para dirigir la proteína humana HAPLN1 costaría alrededor de $ 900- $ 1000 mg
-1. Incluso baja densidad de tales anticuerpos en los cartuchos de inmunoafinidad tienen precio más alto que los polímeros de impresión molecular, con un costo de entre $ 10 a $ 100 mg-1. Alto precio de anticuerpos HAPLN1 aumentar el costo de los kits de Elisa HAPLN1 disponibles en el mercado a $ 10 /prueba. Mientras que un chip sensor recubierto de oro impresa (1 cm x 1 cm) costaría aproximadamente $ 1.2 /prueba y puede ser utilizado en varias ocasiones para múltiples ensayos a diferencia de los anticuerpos, los cuales no pueden ser reutilizados.
En nuestro estudio pretendemos desarrollar una herramienta para la detección temprana de los biomarcadores. moléculas de proteína diana co-adsorben en la superficie del electrodo de oro con los tioles y que juntos forman una monocapa bien-empacado. La eliminación de las moléculas proteicas de las cavidades de la forma de impresión SAM y el grupo de cabeza hidroxilo funcional de los tioles proporcionar especificidad a la cavidad. La complementariedad en tamaño, forma y la hidrofobicidad proporciona afinidad hacia la misma molécula, que ha sido impresa.
El electrodo impreso se utiliza entonces para ensayar la plantilla en tampón usando potenciometría. Como la molécula de proteína cargada en tampón se une a las cavidades que cambia el potencial del electrodo de detección. Síntesis de la superficie de huella es sencillo y no requiere ninguna tecnología cara para la preparación. Es un viejo pero prometedora tecnología, que se ha venido desarrollando con los desafíos que ha enfrentado en el pasado.
En 1930 un científico soviético MV Polyakov demostró que gel de sílice preparado en presencia de un aditivo disolvente preferido mostraron unión para el mismo disolvente [17]. Linus Pauling y Frank Dickey publicaron en 1949 que la sílice muestra especificidad para colorantes impresos en la superficie [18]. Importante avance en la molecular se llevó a cabo en 1972, cuando Gunter Wulff preparado polímeros orgánicos de impresión molecular utilizando el método de unión covalente, que puede diferenciar entre los enantiómeros del ácido glicérico [19]. Wulff et al. se utiliza un enfoque, que se convirtió en el más famoso de los estudios de impronta molecular durante la década de los 70 hasta que otra teoría fue introducida en 1981 por Mosbach y compañeros de trabajo. Ellos crearon huellas moleculares basados en la unión con la plantilla [20] no covalente. Era la simplicidad de este enfoque que desencadenó una explosión en 90 de los polímeros de impronta molecular. Hemos utilizado enfoque de unión no covalente introducido por Wulff et al. para imprimir el biomarcador HAPLN1 mediante el uso de grupos funcionales hidroxilo de tioles que forman interacciones débiles con la proteína y un molde bien equipada alrededor de la misma. Esto proporciona más especificidad a la cavidad, haciendo así la eliminación de HAPLN1 de la cavidad más fácil. Las condiciones de impresión se optimizaron para la potenciometría utilizando BSA (66 kDa) proteína (Figura 1), debido a su similitud de tamaño con biomarcadores de cáncer HAPLN1 (65 kDa). Hemos probado la especificidad de las cavidades impresas, utilizando MALDI-TOF, mediante la realización de pruebas para demostrar que una proteína relativamente menor mioglobina (17 kDa) no se une a las impresiones de la BSA.
(A-C) Inserción de la proteína dentro de la SAM. (D) de lavado. (E-F) La unión de la proteína analito BSA, como control de hemoglobina no específica.
Materiales y Métodos
Principio de la detección potenciométrica
En nuestra tecnología, hemos utilizado para la detección de la potenciometría HAPLN1 analito diana. Un potenciómetro mide la diferencia de potencial entre un electrodo de referencia (Ag /AgCl) y el electrodo de trabajo. El analito se une a la superficie bioreceptor en el electrodo de trabajo en una solución tampón, lo que resulta en un cambio en la diferencia de potencial entre los dos electrodos. Este cambio se mide a continuación por el sistema. iones biomacromoleculares más pequeñas no dan lugar a una tensión y cuando se mantengan en equilibrio con el electrolito.
Los sólidos resultados de respuesta de tensión de los macroiones de unión a través de enlaces de hidrógeno extensa macromolecular alrededor de la huella en el electrodo de trabajo (chip de silicio recubierto de oro ), un gran HAPLN1 recombinante biomacromolécula, 65 proteína de tamaño kDa ensambla con tioles, que forman una manera organizada, densa SAM alrededor del analito. Los tioles tienen la tendencia a la auto montar en la superficie de oro como el grupo de azufre en el extremo de la cola de tioles forma un enlace azufre-metal con oro [21]. Organizado SAM es un importante 'del sellador contra interferentes y puntos de aguja de corriente parásita. La macromolécula se lava a continuación de la superficie, lo que resulta en la formación de cavidades. El electrodo impreso actúa como el elemento bioreceptor del biosensor. Por lo tanto electrodo Imprinted trabaja con mismos principios que electrodos selectivos de iones comercial, que tienen un ionóforo específico para reconocer el ion analito. Se demuestra que la potenciometría se puede utilizar con una buena sensibilidad y selectividad para detectar el biomarcador de cáncer diana en solución tampón y en el suero de púas. La respuesta electroquímica obtenida con esta técnica es debido al cambio de potencial después de la unión de la proteína plantilla. El cambio en el potencial se mide con respecto a una referencia de Ag /AgCl electrodo [22], [23].
Materiales requeridos para la medición electroquímica
albúmina de suero bovino (BSA) a partir de sangre bovina ( Mw = 66,3 K), mioglobina de músculo equino esquelético (Mw = 17,6 K), 11-mercapto-1-undecanol (97%) (tiol), etanol absoluto, metanol, isopropanol y se adquirieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). HAPLN1 humana (64,68 kDa) de larga duración ORF (AAH57808, A. A. 1-354) proteína recombinante con etiqueta de GST en N-terminal se adquirió de Abnova Corporation (Walnut, CA) y se almacenó a -80 ° C. Se utilizaron todas las proteínas y los productos químicos que se recibió. Hay dos tipos de electrodos se utilizan como el electrodo de detección: el oro (50 nm) bombardeo iónico de obleas de silicio recubierto (1 cm x 2 cm) y electrodos de oro (2 mm
2) comprado a BASi (West Lafayette, IN). Las mediciones potenciométricas se hicieron en 10 ml de 1X PBS en vial de vidrio de 20 ml, equipado con un agitador magnético. Cuando se diluye a una concentración 1X, tamponada con fosfato solución salina 10 X adquirido de Sigma Aldrich (St Louis, MO) dió una concentración de tampón de fosfato de 0,01 M y una concentración de cloruro sódico de 0,154 M con pH 7,4. El sistema de dos electrodos consistió en un Ag /AgCl como electrodo de referencia y el electrodo de oro chip de oro revestido de silicio como el electrodo de trabajo. Los potenciales del electrodo de trabajo frente al electrodo de referencia se midió con un potenciómetro Accumet AR15 comprado en Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) y CEM 16 canales electroquímicos interfaz adquirió de Lawson Labs (Malverin, PA)
Materiales necesarios para MALDI TOF
placa de oro objetivo fue adquirido de Bruker Daltonics (Billerica, MA). solución de TA (0.1% trifluoroacético ácido /acetonitrilo, 02:01, vol:vol) y ácido sinapínico se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) para la preparación de la matriz para inmovilizar la proteína unida en la superficie de la placa del objetivo . Bruker Autoflex MALDI-TOF comprado de Bruker Daltonics (Billerica, MA) se utilizó para determinar la especificidad de la proteína de unión a las respectivas huellas en la superficie de la placa del objetivo. PTFE conformable (teflón) Cinta resistente a productos químicos se adquirió de la empresa CS Hyde (Lake Villa, IL). El gas nitrógeno fue suministrada por Presto-O-Ventas y Servicios (LIC, NY).
fabricación de sensores de BSA
Los chips de silicio se limpiaron por ultrasonidos en agua desionizada, metanol e isopropanol. Los chips de silicio se dejaron secar durante la noche y a continuación por bombardeo iónico recubrieron con oro. A continuación, las patatas fritas con recubrimiento de oro se lavaron con agua desionizada y se secaron con gas nitrógeno puro. Del mismo modo los electrodos de oro se limpiaron con 0,1 y 0,05 micras de alúmina y después se sonicaron con agua desionizada para eliminar cualquier partícula de alúmina consolidados. Dado que las proteínas se desnaturalizan en solución no acuosa y tioles muestran una pobre solubilidad en las proteínas en disolución acuosa se disolvieron en agua desionizada mientras que los tioles se disolvieron en etanol absoluto. Comprometer soluciones mixtas de 19:01 y 18:02 (etanol water:) con concentración de tiol final de 0,1 mM y 0,2 mM se prepararon en recipientes de vidrio limpias y comparativamente estudió para lograr una buena solubilidad de los tioles y evitar la precipitación de proteínas. El electrodo recubierto de oro se sumerge entonces en el interior de la solución mezclada para formar el auto monocapa ensamblado de proteínas y tiol. El espacio de cabeza del recipiente se llena con gas inerte de nitrógeno y se cubrió con Parafilm. El tiempo de incubación del chip en la solución mixta se varió para una mejor superficie impresa. El chip de oro se enjuaga a fondo con agua desionizada para eliminar la proteína unida. También diferentes concentraciones de proteína de 30 g /ml, 10 ng /ml y 1 ng /ml se usaron para formar las impresiones y se compararon los resultados de unión. Los electrodos preparados fueron utilizadas para comprobar la respuesta de unión con concentraciones variables de BSA en la solución tampón.
Preparación de Impresiones en MALDI-TOF de destino placa
A excepción de la superficie que contiene 384 pozos, el resto de la tablilla de puntería de oro (8 cmx12.5 cm) estaba cubierta con cinta adhesiva de teflón no reactivo. La superficie objetivo de oro se limpió con etanol y agua desionizada. flujo controlado de gas inerte de nitrógeno se utilizó para secar la superficie objetivo. La solución A se preparó con una mezcla 19:01 de 16,17 mg de mioglobina (es decir, 1,7 M) en 540 ml de agua desionizada y 0,22 g 11-mercapto-1-undecanol (es decir, 2 mM) en 540 ml de etanol absoluto. se formó Esta solución para crear impresiones de mioglobina en un medio de placa objetivo de oro. Solución B contenía 19:01 mezcla de relación (etanol water:) de 16,17 g de albúmina de suero bovino (es decir 0,432 M) disuelto en 540 ml de agua desionizada y 0,22 g 11 mercapto1-undecanol (es decir, 2 mM) en 540 ml de etanol absoluto. Esta solución se preparó para crear impresiones de BSA en la otra mitad de la placa objetivo de oro. La mitad de la placa de Au se sumergió en la solución A durante 12 horas a co-absorber la proteína y tiol, después de lo cual se secó con gas nitrógeno puro. Del mismo modo que la otra mitad de la placa objetivo de oro se sumerge en la solución B durante 12 horas y se secó con gas nitrógeno puro. Las concentraciones de proteína y tiol se mantuvieron mismo que el utilizado para la impresión en el electrodo de oro para la potenciometría. Cavidades que son complementarias con las proteínas de la plantilla fueron creados en la monocapa mediante la eliminación de las moléculas de proteínas a través de enjuague repetido con agua desionizada. La solución C se preparó con la mezcla equimolar de 1 ng /ml de BSA y mioglobina en 540 ml de agua desionizada. Esta solución se formó a la proteína de ensayo de unión para dos tipos diferentes de cavidades en la superficie de la placa objetivo de oro. Wells sobre la superficie del blanco se dividieron en cuatro cuadrantes (Figura 2) y pocillos de la fila I (1-24) a P (1-24) se sumergieron durante 10-15 minutos en la solución C. La superficie se enjuagó suavemente y se dejó secar el uso de gas nitrógeno. Luego 1 l de matriz SA se añade a la diana y se dejan secar. Así en la línea A (1-24) a H (1-24) se utilizaron para los estudios de control. A continuación se utilizó la placa del objetivo para el análisis MALDI-TOF.
Las columnas (1-12) para la mioglobina y columnas (13-24) para los sitios de impronta BSA. Filas I a P se sumergieron en la solución de analito C que contiene ambas proteínas analitos.
fabricación de sensores HAPLN1
HAPLN1 proteína se sobreexpresa en la mayoría de los mesoteliomas y por lo tanto ser considerada como una biomarcador potencial para la detección de cáncer. En un recipiente de vidrio limpio 20 g de HAPLN1 (64,68 kDa) proteína se disolvió en se disolvió en 10 ml de etanol 10 ml de agua desionizada (es decir, 0,03 M) y 4 mg 11-mercapto-1-undecanol (es decir, 0,1 mM) . Una solución mixta se forma, mediante la disolución de ambos en las soluciones 19:01 ratio (etanol water:), de manera que la concentración final de tiol en la solución se vuelve de 0,1 mM. Tres electrodos de oro A, B y C se sumergieron en la solución durante 12 horas y luego los electrodos se aclararon a fondo con agua desionizada para eliminar la proteína unida en la superficie.
respuesta del sensor a HAPLN1 pinchos muestras de suero
HAPLN1 impresos-también se utilizaron para la respuesta potenciométrica para el biomarcador del cáncer de pinchos en el suero. La solución 100 nM de valores en 01:08 suero y tampón relación se preparó diluyendo 100 l de suero humano con 650 l de solución de PBS 1X y con 250 l de la solución comercial 102 mg /ml HAPLN1 (es decir, un total de 25,5 g de HAPLN1). La concentración HAPLN1 en la solución madre era entonces 6,5 mg /ml (100 nM). 10 l de solución se utilizó para la titulación en 10 ml de tampón de PBS, y la mayor concentración de proteína es 10
-9 normas restantes M. Se prepararon manteniendo la misma tasa de dilución (1:08) de suero en tampón pero analito la concentración se redujo diez veces con una serie de 6,5 mg /ml (100 nm) con púas solución estándar.
Resultados
Optimización de los parámetros de BSA sensor
Las moléculas de proteína BSA impresa con la tioles terminados en hidroxilo de alcano en la superficie de oro. Como tioles forman una monocapa organizada con el tiempo en la superficie de oro que era crucial para estudiar el tiempo de incubación del chip de silicio recubierto de oro dentro de la solución de proteína-tiol para lograr impresiones estables. En este experimento la concentración de BSA en la solución mixta era 30 mg /ml y la Figura 3a muestra el efecto del tiempo de incubación sobre la estabilidad de las impresiones. Tres electrodos se prepararon manteniendo las fichas dentro de la solución durante 2, 6 y 12 horas. La solución mezclada en este experimento tenía una proporción de 18:02 (etanol water:) con 0,2 mM 11 mercapto1-undecanol. Todas las mediciones se realizaron en solución salina tampón de fosfato (pH 7,4) en una solución de 10 ml. Un incremento logarítmico de potencial se observó con el aumento de la concentración de BSA en tampón sólo con el electrodo, que se incubó durante un máximo de 12 horas. Los resultados indicaron que se formaron huellas más estables cuando el chip se mantuvieron en solución durante 12 horas. Los experimentos se llevaron a cabo a continuación, para optimizar las condiciones para lograr impresiones de proteínas estables. La respuesta potenciométrica se estudió mediante la variación de la concentración de BSA impreso sobre el electrodo para formar las cavidades. En este experimento dos electrodos se preparan utilizando dos diferentes concentraciones de 30 mg /ml y 1 ng /ml de BSA en soluciones mixtas de proteínas y tiol.
A. Efecto del tiempo de inmersión de 2 horas (___), 6 horas (...) y 12 horas (---). B. Efecto de la concentración de proteína de 30 mg /ml (▴, x) y 2 ng /ml (◊, △). C. Efecto de la concentración de proteína de 10 ng /ml (□) y 1 ng /ml (▴), y controles del SAM única (x, ◊).
Estas soluciones mixtas se prepararon con un 19 :1 ratio (etanol water:) que tiene una concentración final de 0,1 mM 11-mercapto-1-undecanol. El tiempo de incubación se mantuvo a 12 horas, ya que esto se demostró para apoyar la formación de los sellos más estables.
Como se muestra en la Figura 3b, un incremento logarítmico de la variación de potencial se lleva a cabo con aumento de la concentración de proteínas . La respuesta de electrodo preparado con /ml de concentración de proteína de impresión 30 g es mucho mayor en comparación con el otro electrodo preparado con una concentración de proteína de impresión inferior. Esto demuestra que el número de cavidades formadas en la superficie aumenta a medida que más proteína se adsorbe en la superficie. El punto isoeléctrico de una proteína se define como el pH al que la carga neta en una superficie de la proteína es cero. Dado que las moléculas de BSA tienen un punto isoeléctrico de 4,7 tienen una carga negativa neta en una solución tampón con pH 7,4. Como moléculas más cargados se unen a la superficie del electrodo que conduce a un cambio drástico en potencial. Los resultados se repitieron con éxito para su confirmación. La figura 3b también demuestran un cambio potencial más alta con una relación de 19:01 (etanol water:) en comparación con una relación de 18:02 de la Figura 3a. Este resultado indica que se forman más cavidades como la concentración de tiol en la solución se reduce. Para reducir la escala del proceso y preparar electrodos más sensibles, bajas concentraciones de impronta de 1 ng /ml y 10 ng /ml fueron seleccionados en base a los datos experimentales anteriores. Los experimentos se llevaron a cabo con electrodo de oro del área de superficie mucho más pequeña (2 mm
2). El electrodo de trabajo se preparó en una relación 19:01 (etanol water:) con una concentración final de 0,1 mM 11-mercapto-1-undecanol. Como se muestra en la figura 3c el electrodo muestra una buena respuesta de unión de 15 a 20 mV con concentraciones muy bajas de BSA en comparación con una respuesta de unión de baja de 2-4 mV observó con electrodos de control preparadas que sólo tienen la SAM en su superficie.
Validación mediante MALDI-TOF
en este experimento se colocó 1 l de matriz en la parte superior de cada pocillo de la placa impresa Maldi y se dejan secar. El software de análisis placa MALDI con un algoritmo para recopilar datos con una velocidad de barrido de láser de tiro 2000 /s para cada punto en un pozo fue seleccionado. Desde media de 384 pocillos de la placa MALDI se imprime BSA y la otra mitad con la proteína mioglobina, al azar cinco pozos fueron seleccionados de pozos mioglobina impreso y de manera similar cinco fueron seleccionados de la BSA impreso pozos, para ensayar la proteína unida a las cavidades. Como se muestra en la Figura 4, símbolo de tres caracteres m /z en el eje x se usa en espectroscopia de masas para denotar la cantidad sin dimensiones, formada por la división de la masa de un ion en unidades de masa atómica unificadas por su número de carga.
A. Mioglobina pozos impresos y B. BSA impresas pozos.
Y-eje muestran la intensidad de la señal, pero en lugar de utilizar cuentas por segundo (cps), el procedimiento común es relacionar la intensidad de la abundancia relativa con un uso si un patrón interno. Como se muestra en la Figura 4a mioglobina que tiene un peso molecular de 17 kDa se observó en obligarse a los pocillos solamente impresos mioglobina como un pico aparece en 17 kDa para cada pocillo y no se observó la mioglobina en cavidades BSA como se muestra en la Figura 4b. BSA se observó a ser de un peso molecular demasiado grande bajo estas condiciones de ionización.
Sensor HAPLN1
Después de los estudios de BSA para la optimización de las condiciones requeridas para la impresión biomacromoléculas, HAPLN1 impresa electrodos fueron fabricados por la baja concentración detección del biomarcador. Se estudiaron tres electrodos impresos para verificar la respuesta después de la detección. Dos experimentos independientes muestran un drástico cambio 25 mV en el potencial a concentraciones muy bajas de HAPLN1 10
-12 M como el HAPLN1 se tituló en la solución tampón (Figura 5a). Como control, BSA también se valoró en las mismas condiciones que muestran una respuesta potencial muy baja a altas concentraciones de BSA. A continuación, el experimento se realizó en suero con una concentración HAPLN1 púas. La figura 5b muestra que el electrodo impreso tiene una alta desviación en suero, pero muestra un potencial cambio notable en el 10
-9 M de concentración de HAPLN1 en el suero.
A. HAPLN1 unión a HAPLN1 huellas (dos experimentos independientes), la respuesta de control de BSA para improntas HAPNL1. solución de suero analito B. claveteado HAPLN1 a HAPLN1 huellas.
Discusión
La detección de biomarcadores de cáncer con un bajo costo y método fácil de usar es importante para el monitoreo continuo de múltiples marcadores. HAPLN1 es un ejemplo de creciente importancia en el campo como, por ejemplo, Nelson et al [24] recientemente completó un análisis del transcriptoma en vascular arterial (BEC) y las células endoteliales linfáticas (LEC) y el análisis de agrupación mostró la expresión de genes claramente diferenciado para las BEC y los LEC . HAPLN1 fue el segundo más alto correspondiente gen en los LEC y como tumores tienen la ventaja de estas moléculas Incrementar el potencial metastásico, la expresión alta HAPLN1 observado puede conducir a nuevos tratamientos terapéuticos para la metástasis del cáncer a los ganglios linfáticos. tecnología de impresión molecular bidimensional ha sido utilizado con éxito para imprimir y detectar moléculas pequeñas [25] - [29] péptidos similares pero macromoléculas imprinting quedaba una tarea difícil. Las macromoléculas biológicas como las proteínas tienen un peso molecular alto y por lo tanto su gran tamaño impide la adsorción en la superficie y la eliminación de la huella ya hecho [30] - [33]
El gran número de sitios de unión y funcional. grupos en la superficie de la proteína pueden aumentar los problemas relacionados con la unión no específica con proteínas de impresión molecular (MIP) que conducen a una escasa selectividad [34]. Por lo tanto es importante optimizar todos los parámetros y condiciones necesarias para mantener la estabilidad de este tipo de estructuras grandes durante todo el proceso de impresión. Seleccionamos proteína BSA (65 kDa) para el proceso de optimización debido a su tamaño similar al candidato biomarcador del cáncer HAPLN1. En la Figura 3a y la Figura 3b impresiones más estables se forman con el tiempo de incubación 12 horas y un aumento en la respuesta se produce cuando más moléculas diana se estampan en 30 g /ml en comparación con 1 ng /ml de concentración. Condiciones similares fueron utilizados por Wang et al [35] para mostrar cómo las impresiones formadas con diferentes proteínas de tamaño son altamente específicos de su respectivo electrodo de pie de imprenta usando la detección potenciométrica. técnica de MALDI TOF se ha utilizado como un método novedoso en nuestro trabajo para confirmar la especificidad del sitio pie de imprenta, que también se muestra por la detección potenciométrica. La Figura 4 muestra las proteínas de mioglobina se unen específicamente a sus cavidades impresas y no a las cavidades de la BSA. Creemos que ya que las proteínas mioglobina son mucho más pequeños en tamaño (17 kDa) en comparación con BSA, mioglobina no encajaría en el molde BSA y por lo tanto no se une a BSA cavidades más grandes. Los resultados de especificidad BSA no pudieron ser confirmados con MALDI-TOF debido a la mala sensibilidad del equipo hacia proteínas de alto peso molecular. Hemos utilizado la detección potenciométrica para la optimización de cavidades con BSA y para la detección de HAPLN1 en tampón y en el suero de púas. Nuestros resultados en la Figura 5A muestran 25 mV respuesta de HAPLN1 a HAPLN1 electrodo impreso en comparación con baja respuesta por la proteína BSA en tampón y se obtuvieron resultados similares en el suero de púas. Aunque se muestra la respuesta potenciométrica obtenida es específica a la proteína impreso y es el resultado de la proteína de unión, una comprensión clara actualmente se carece de la señal electroquímica (cambio de potencial) inducida por la adsorción de proteínas. Se han sugerido varios mecanismos incluyendo por Thompson et al. Propone factores, que podrían contribuir a cambiar en función de trabajo [36] de oro cuando la proteína se une a la superficie de oro y por lo tanto muestran cómo el cambio en los resultados de función de trabajo en el cambio de potencial de superficie. En experimentos futuros tenemos la intención de evaluar posteriormente la especificidad de la proteína de unión a HAPLN1 cavidades de impresión por tecnología de resonancia de plasma superficial (SPR) y también para obtener datos clínicos para su validación.
Conclusiones
Nuestros datos demuestran la uso de la formación de SAM alcanotioles hidroxilados solubles en agua para imprimir biomacromoléculas. BSA ha demostrado ser una proteína modelo eficaz para optimizar los parámetros de control tales como concentración de proteína, la relación de los componentes moleculares, y el tiempo de incubación de la viruta para reducir la escala del proceso de la impronta para la detección de bajas concentraciones de proteínas. biosensor basado impresión molecular fue construido con éxito a reconocer pleural maligno HAPLN1 biomarcador del cáncer de mesotelioma y alta sensibilidad demostrada por la detección de una baja concentración de biomarcador en la solución de suero /tampón. El sensor mostró un límite de detección de las concentraciones picomolares con un tiempo de respuesta de 2-5 minutos. El bajo coste del sensor se basa en la falta de anticuerpos monoclonales caros, moléculas adicionales de etiquetado y en la simplicidad de la medición del potencial de circuito abierto con un potenciómetro, que también es muy fácil de usar (similar a metro pH).