Extracto
La falta de tres dimensiones (3-D) ensayos de alto rendimiento (HT) de detección diseñado para identificar fármacos contra el cáncer de invasión es un obstáculo importante en la reducción de la mortalidad relacionada con el cáncer, con el reto clave es la estandarización del ensayo. Se presenta el desarrollo de un nuevo ensayo de invasión 3-D con potencial HT que implica que rodea las esferas de células de colágeno dentro de colágeno para crear un entorno 3-D a través de la cual las células pueden invadir. Normalización se logró mediante el diseño de una placa de 96 pocillos labrado para crear un lugar designado precisamente para las esferas de células de colágeno y mediante el uso de dextrano dialdehído para inhibir la contracción de colágeno, el mantenimiento de tamaño y forma uniforme. Esto permite la lectura automatizada para la determinación del efecto de los compuestos inhibitorios sobre la invasión de células de cáncer. La sensibilidad se demuestra por la capacidad para distinguir diferentes niveles de invasión de líneas celulares de cáncer, y la robustez se determinó mediante el cálculo de la Z-factor. A Z-factor 0,65 se obtuvo mediante la comparación de los efectos de DMSO y el anticuerpo anti-β1-integrina, un reactivo de inhibidor, en la invasión de células de cáncer de Du145, lo que sugiere este nuevo ensayo es adecuado para el descubrimiento de fármacos a gran escala. Como prueba de principio, la Biblioteca Compuesto Diversidad NCI se proyectó contra las células cancerosas invasivas humanos. Se identificaron nueve compuestos que muestran alta potencia y baja toxicidad, incluyendo DX-52-1, un compuesto se informó anteriormente para inhibir la migración celular, un determinante crítico de la invasión del cáncer. Los resultados indican que esta innovadora plataforma de HT es un simple, preciso y fácil de replicar ensayo de invasión 3-D para el descubrimiento de fármacos contra el cáncer
Visto:. Evensen NA, Li J, Yang J, Yu X, Sampson NS, Zucker S, et al. (2013) Desarrollo de un ensayo de invasión de Alto Rendimiento tridimensional para Anti-Cancer Drug Discovery. PLoS ONE 8 (12): e82811. doi: 10.1371 /journal.pone.0082811
Editor: Ming Tan, de la Universidad del Sur de Alabama, Estados Unidos de América
Recibido: 12 de septiembre de 2013; Aceptado: 6 de Noviembre de 2013; Publicado: Diciembre 11, 2013
Derechos de Autor © 2013 Evensen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está apoyado en parte por la Fundación de mama Baldwin cáncer y el Instituto Nacional del cáncer (1R01CA166936). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la metástasis es la causa principal de muerte en los pacientes con cáncer y uno de los procesos biológicos más complejos en enfermedades humanas [1]. Un reto importante en el desarrollo de fármacos contra el cáncer dirigidos a la prevención de la metástasis es la falta de herramientas efectivas para el descubrimiento de fármacos. programas de descubrimiento de fármacos se han centrado principalmente en el cribado basado en objetivos, lo que ha dado lugar a nuevas categorías de agentes farmacológicos, inhibidores de la quinasa de tirosina principalmente y anticuerpos monoclonales [2]. Sin embargo, ya que la mayoría de los tipos de cánceres se desarrollan numerosas mutaciones durante la progresión tumoral [3], los clones de células de cáncer individuales a menudo eludir compuestos inhibidores se centraron en moléculas individuales dirigidas [4]. El fracaso en la comercialización de muchos descubrimientos de drogas por objetivos financiados con fondos públicos está impulsando la necesidad de nuevos enfoques para acelerar el desarrollo de fármacos para el cáncer metastásico. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas herramientas que pueden utilizarse para identificar fármacos eficaces dirigidas a la fenotipo invasivo de las células cancerosas, un requisito en la primera etapa de la metástasis [5], y la etapa posterior de la recurrencia del cáncer debido a la auto-siembra a partir de micro /macro tumores con metástasis [6], es imprescindible en la conversión de esta enfermedad que amenaza la vida a un ser crónica.
La orientación eficaz de la invasión de células de cáncer requiere una tecnología susceptible de imitar
in vivo
condiciones. la creciente evidencia ha demostrado que en tres dimensiones (3-D) matrices para el cultivo de células de cáncer más de cerca
in vivo
condiciones imitan en comparación con las condiciones de cultivo de células en 2-D. Por lo tanto, la detección de las condiciones de cultivo en 3-D ofrece un mayor valor predictivo para la futura eficacia clínica de fármacos potenciales y permite una mejor optimización [7,8]. Actual 3-D de alto rendimiento (HT) ensayos de selección se centran principalmente en la identificación de compuestos que inhiben el crecimiento y la proliferación [9-15] tumoral. Se han hecho intentos para desarrollar ensayos de invasión en 3-D con capacidad de HT [16-18]. Sin embargo, el uso de estos ensayos para el descubrimiento de fármacos invasión de células anti-cáncer se ha visto obstaculizada debido al alto coste de la detección a gran escala [16,17], un requisito para largos tiempos de incubación (por ejemplo, 3 a períodos de incubación de 5 días ) para las lecturas de punto final determinado por una señal baja: Índices de fondo [17], procedimientos engorrosos [16,18,19], y /o la falta de técnicas estandarizadas y automatizadas para la cuantificación de la invasión de células [20].
Aquí, nos proporciona una nueva herramienta de detección basados en gel de colágeno esferoide 3-D invasión TH para identificar fármacos que muestran capacidades anti-invasión. Mediante la utilización de una placa de repujado de manera innovadora, junto con dextrano dialdehído mezclado con colágeno para evitar la contracción, este novedoso ensayo de invasión en 3-D permite la estandarización y la lectura automatizada, que son requisitos fundamentales para la detección HT. Ofrecemos pruebas de que nuestro ensayo de invasión en 3-D es reproducible, eficaz, fácil y rápido de realizar, y lo suficientemente sensibles como para identificar compuestos que inhiben la invasión de células cancerosas. El potencial de estos accesos activos para tener un impacto positivo en los pacientes con cáncer mediante la prevención de la diseminación apoya el uso de este ensayo en los programas de descubrimiento de fármacos actuales.
Materiales y Métodos
Materiales
colágeno de tipo I (tipo nativo acético ácido extraído I colágeno a partir de tendón de cola de rata) y yoduro de propidio (PI) se compraron de BD Bioscience Descubrimiento Los aparatos de laboratorio. inhibidor tisular recombinante de la metaloproteinasa-2 (TIMP-2) y anticuerpo de dominio hemopexina anti-MT1-MMP se adquirieron de Chemicon International, Inc. RNAi-Ready Psiren Retro-Q vector para el silenciamiento de genes específicos y pQCXIP retroviral vector para la generación de las células estables se adquirieron de Clontech. Hoechst tinción nuclear fue adquirido de Invitrogen. El anticuerpo anti-integrina β1 se adquirió de GE Healthcare. La estaurosporina, paclitaxel, y dextrano (Mw = 500.000) se adquirieron de Sigma.
Líneas celulares y tratamiento de las células
fibrosarcoma humano HT-1080, cáncer de próstata humano LNCaP, Du145 y PC3, cáncer epitelial de mama humano líneas de células MDA-MB-231 se adquirieron de ATCC. Las células LNCaP que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) o MT1-MMP-GFP ADNc quiméricos se describe anteriormente [21]. Las células se mantuvieron en DMEM de alta glucosa o medio RPMI 1640 (Invitrogen) que contiene 10% de FBS y 1% Pen /Strep. El SK-3
RD células y la formación de mammosphere fueron descritas anteriormente [22]. En pocas palabras, estas células se cultivaron en placas de ultra-bajas de fijación (Corning) en suspensión con DMEM-F12 (Cellgro) suplementado con B27 (01:50, Invitrogen), EGF (20 ng /ml BD Biosciences), suero bovino 0,4% albúmina (Sigma), y 4 mg /ml de insulina (Sigma) [22].
3-D de la célula Dispersión Ensayo
Este ensayo se realizó como se describió anteriormente [21]. Brevemente, suspensiones de células individuales de células LNCaP (4x10
4 células /ml) que expresan GFP o MT1-MMP-GFP se mezclaron con colágeno tipo I (2,5 mg /ml de concentración final). Se dejó que las culturas de gel de células de colágeno para solidificar en placas de 24 pocillos. Después de la solidificación, se añadió medio completo con o sin inhibidores indicados. capacidad de dispersión celular se monitorizó con un microscopio Nikon durante 6 días.
3-D Multi-esferoide de células invasión Ensayo
Para generar agregados de células, SK-3
RD células (1000 células /ml) se cultivaron en platos de cultivo de ultra-baja adherencia durante 12 días. Esferas se transfirieron a placas de 24 pocillos que contienen colágeno de tipo I. Los esferoides empotrados fueron cultivadas durante 3 días en condiciones de normoxia o condiciones de hipoxia. Para las condiciones de hipoxia, las células se incubaron utilizando un conjunto BioSpherix ProOx C21 al 1% de O
2 y 5% de CO
2. Para el método de esferoide de múltiples celdas utilizando glóbulos microportadores de vidrio, las células que expresan LNCaP MT1-MMP-GFP se cultivaron con los granos durante 24 horas con agitación. Los agregados de células en perlas se transfirieron a continuación y embebidos en colágeno tipo I y se cultivaron durante 3 días más.
3-D Invasión Ensayo
Las células cancerosas (8x10
7 células /ml ) se mezclaron con un volumen igual de 3 mg tipo neutralizado /ml de colágeno I en hielo, seguido de la adición de solución de dialdehído dextrano (final de 0,25% del volumen total). Después, la mezcla de células de colágeno estaba salpicada en los hoyos en el centro de cada pocillo de una placa de 96 pocillos. El tamaño óptimo del pozo en cada pocillo es de 2 mm de diámetro y requiere 4,18 mm
3 (l) [4 /3πr³, r = 1 mm] de la mezcla de células de colágeno para crear un punto esférica dentro de la fosa. Después de la solidificación de puntos de células de colágeno a 37 ° C, una capa de tipo I neutralizado colágeno (80 l, 1,5 mg /ml de concentración final) se añadió para cubrir los hemisferios de células de colágeno. Después de una incubación de 10 minutos a 37 ° C, el complejo de la invasión de células ensamblada fue cubierta con 80 l de medio con inhibidores o vehículo añadido.
Observación de células invadidas
células de cáncer invadidas se tiñeron con tanto Hoechst 33342 (25 mg /ml) para la tinción nuclear de las células totales y PI (2,5 mg /ml) para la tinción de las células muertas, seguido de un lavado extensivo con PBS. La invasión de las células cancerosas se examinó a continuación mediante microscopía fluorescente. Para automatizar la cuantificación de células invadidas, se obtuvieron imágenes de contraste de fase y Hoechst para toda la placa. Un umbral de la imagen de contraste de fase de un control (sin tratar o tratados con vehículo) y de la placa de 96 pocillos se ajustó en base a la diferencia de contraste entre el exterior y el interior de la fosa para crear dos capas binarias. La capa binario fuera del pozo fue copiado para formar una región de interés (ROI), que después se aplica a las imágenes Hoechst. Las células invadidas en el retorno de la inversión fueron entonces automáticamente contaron usando recuento de objetos. Esto se hizo mediante NIS-Elements 3.2 Software Br.
La oxidación de dextrano al Formulario dialdehido dextrano
2,5 g de dextrano se disolvió en 100 ml DIH
2O. peryodato de sodio (NaIO
4) (1,65 g) se añadió durante 18 horas de incubación, con agitación, a temperatura ambiente. Para apagar la reacción, se añadió 1 ml de etilenglicol. La solución se dializó con DIH
2O durante 3 días, se liofilizaron, y se reconstituyó con DIH
2O a una concentración final de 2,5% de dextrano dialdehído. Se determinó
Ensayo de Proteasa
Total actividad proteolítica celular utilizando un kit de detección fluorescente (Sigma). Brevemente, los lisados celulares se incubaron durante 20 horas a 37 ° C con isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con sustrato de caseína. Los lisados fueron ácido tricloroacético (TCA) precipitó. Los sobrenadantes que contienen fragmentada FITC-caseína se combinaron con tampón de ensayo y su intensidad de fluorescencia se midió con excitación a 485 nm y emisión a 535 nm usando un SpectraMax Gemini EM (Molecular Devices) lector de placas fluorescente.
Análisis estadísticos
Student de dos caras t-test se utilizó para evaluar las diferencias con valores de p & lt; 0,05 considerado estadísticamente significativo. Los datos combinados se presentan como media ± desviación estándar para todos los análisis de tres experimentos independientes. el software GraphPad Prism 5 se utilizó para este análisis.
Resultados
Limitaciones de la actual invasión ensayos Hindering HT capacidades de detección
Actualmente se utiliza ensayos de invasión en 3-D se basan en la célula de vigilancia dispersión de capacidad y se puede montar de varias formas. Sin embargo, todos ellos carecen de los atributos clave que se requieren para la capacidad de detección HT. Por ejemplo, algunos ensayos no pueden distinguir entre inhibidores de la proliferación celular y la invasión. En estos tipos de ensayos, las células individuales embebidos en matrices, como el colágeno tipo I, se examinaron por su comportamiento invasivo basado en su patrón de crecimiento de dispersión después de la proliferación. En la figura-a 1A, células LNCaP, una línea celular de cáncer de próstata humano menos invasiva, que expresan establemente tipo de membrana 1 de metaloproteinasas de matriz (MT1-MMP) fusionada con una proteína fluorescente verde (GFP) (MT1-GFP) muestran un patrón de crecimiento de dispersión, indicativo de comportamiento invasivo, en comparación con las células de control GFP que en vez forman un agregado de células dentro del gel. Esto es coherente con los informes anteriores que demuestran que la MT1-MMP puede inducir la invasión de tipos de células no agresivas [23]. Sin embargo, se requieren tanto la invasión y proliferación de las células para formar el patrón de crecimiento disperso y hay una falta de estandarización que dificulta la lectura automatizada. Por lo tanto, este ensayo la dispersión de células individuales no es adecuado para el descubrimiento de fármacos anti-cáncer HT enfocada a las metas invasión del cáncer.
A) a. ensayo de dispersión de una sola célula: Individual, células LNCaP aisladas se mezclaron con colágeno y examina diariamente. MT1-GFP-células que expresan visualiza gradualmente un patrón de crecimiento de dispersión después de 6 días de cultivo en comparación con el crecimiento agregado de células que expresan GFP. segundo. ensayo de dispersión de agregados: SK-3
RD células fueron cultivadas durante 12 días para formar mammospheres, transferidos y embebidos en el colágeno, y luego cultivadas en normoxia o hipoxia. Un patrón disperso fue visto después de 3 días en condiciones de hipoxia. do. Microportadores ensayo de dispersión del grano: MT1-GFP expresando células LNCaP fueron cultivadas con granos durante 24 horas, luego transferidos y embebidos en colágeno. células invadidas fueron vistos como una forma dispersa en el día 3. Las barras de escala = 20 micras. B) Evaluación de la capacidad de invasión de células de cáncer usando novela ensayo de invasión 3-D: células LNCaP que expresan de control de vector (a) o MT1-MMP (b), las células PC3 de cáncer de próstata humanas (c), y Du145 células (d) se suspendieron en colágeno , salpicado en el pocillo de una placa de 96 pocillos, y se cubre con colágeno seguido por los medios de comunicación. Después de 18 h de incubación, PC3 y Du145, así como células que expresan LNCaP MT1-MMP, mostró número de células invadidas aumentado en comparación con las células de control del vector LNCaP. Barra de escala = 50 micras.
Con el fin de evitar estos obstáculos, se introdujo el método esferoide de múltiples celdas [20], que ha sido reconocida por tener potencial para ser utilizado como un ensayo de invasión HT. Sin embargo, como se ha demostrado mediante el uso de SK-3
RD células cultivadas en condiciones hipóxicas, que se sabe que aumenta el tráfico de MT1-MMP a la superficie celular [22], la formación de esferoides hasta el punto final de evaluación de la invasión requiere cultivo a largo tiempos, en general, teniendo 6 a 12 días, y carece de uniformidad de tamaño (Figura 1-b). Para evitar la variación del tamaño, glóbulos microportadores de vidrio con tamaños idénticos se pueden utilizar como andamios para la formación de esferoides [24], como se muestra en la Figura 1A-c usando células que expresan LNCaP MT1-GFP. Sin embargo, la ubicación de las perlas que contienen las células después de la transferencia a una matriz no puede hacerse uniforme. Aunque estos ensayos se pueden usar para la invasión de células de cáncer de supervisión, los tiempos de ejecución largos y la falta de estandarización y capacidades de lectura automatizada dificultan su utilización como instrumentos de evaluación HT.
Establecimiento de un ensayo de invasión en 3-D para la evaluación cuantitativa del Cáncer la invasión de células
al reconocer la necesidad de un ensayo HT 3-D que pone a prueba la capacidad invasiva de las células con un tiempo de ejecución más rápido, hemos desarrollado un ensayo de invasión en 3-D con base de gel de colágeno rápida. Para demostrar la capacidad de nuestro ensayo para detectar diferencias en la capacidad invasiva de varios tipos de células cancerosas, líneas celulares de cáncer de próstata humano con diferentes niveles de agresividad, incluyendo independientes de andrógenos (Du145 y PC3) y (LNCaP) las líneas celulares dependientes así como MT1 -MMP que expresan las células LNCaP, fueron examinados. Las células cancerosas indicados se combinaron con tipo nativo neutralizada de colágeno I, punteado en el centro de cada pocillo de una placa de 96 pocillos, y se deja solidificar, en última instancia, la formación de un punto /hemisferio de células de colágeno con un límite y forma distinta. Después de la solidificación, los hemisferios de células de colágeno fueron incorporados dentro de una cubierta de capa de tipo I colágeno neutralizada y se deja solidificar. Los medios se añadieron luego a cada pocillo y se dejó que las células para invadir la matriz circundante durante 18 horas. Como se muestra en la Figura 1B, las células Du145 y PC3 metastásicas mostraron número de células invasoras que sobresalen más allá de los límites de células de colágeno original de aumentaron, mientras que las células LNCaP que expresan ADNc de control de vector no pudieron mostrar la invasión de células. Además, el efecto de la expresión de MT1-MMP en la invasión de células se determinó fácilmente por un aumento en el número de células invadidas en MT1-MMP que expresan las células LNCaP en comparación con células de control de vector (Fig 1Ba & amp;. B).
A fin de comparar directamente nuestro nuevo ensayo invasión 3-D a la celda de ensayo de dispersión de 3-D utilizado en la actualidad, el efecto inhibidor del inhibidor tisular de la metaloproteinasa-2 (TIMP-2, un inhibidor endógeno de MT1- MMP) [25] y el anticuerpo anti-PEX (dirigido contra el dominio hemopexina MT1-MMP) [26] en MT1-GFP invasión de células LNCaP inducida se probaron. Para el ensayo de invasión novela 3-D, las células se establecieron como se describe para la Figura 1B con la adición de TIMP-2 o el anticuerpo anti-PEX al medio de cultivo celular. La cuantificación de células invadidas reveló 61% y la reducción de 76% de MT1-GFP invasión celular inducida por TIMP-2 y el anticuerpo anti-PEX, respectivamente (Figura 2A). El ensayo de dispersión de células 3-D, que se muestra en la Figura 2B, cualitativamente demuestra la inhibición de la invasión de células de MT1-GFP inducida a través del tratamiento con anticuerpo TIMP-2 o de la anti-PEX. Esta comparación indica que a pesar de estos ensayos de dispersión de los datos cualitativos, proporcionan claras que demuestran la invasión de las células cancerosas, que no son adecuados para los programas de descubrimiento de fármacos que requieren HT resultados cuantitativos, que nuestro ensayo puede proporcionar
A & amp.; B) Comparación de la novela ensayo de invasión 3-D y 3-D de células de ensayo de dispersión: El efecto de la IgG control (Conejo, 10 g /ml), inhibidor tisular de la metaloproteinasa-2 (TIMP-2) (10 nM), o anti-MT1-MMP-hemopexina anticuerpo de dominio (anti-PEX Ab) (10 mg /ml) en la invasión de células LNCaP inducida por MT1-GFP se evaluó mediante el ensayo de 3-D invasión (a) y ensayo de células de dispersión 3-D ( SEGUNDO). Un patrón de crecimiento invasivo fue fotografiado en el día 1 (A) y el día 6 (B), respectivamente. TIMP-2 y el anti-PEX Ab disminuyeron la célula invasiva capacidad /dispersión de MT1-GFP células que expresan. Barra de escala = 20 micras. C) la inhibición dependiente de la dosis de cáncer de mama humano células MDA-MB-231 por el anticuerpo de integrina anti-β1: MDA-MB-231 la invasión de células se examinó usando el ensayo de invasión de 3-D en presencia del anticuerpo de integrina anti-β1 en diferentes concentraciones frente a IgG de control. células invadidas se examinaron microscópicamente (panel izquierdo) y contado (panel derecho). Las barras representan la media + SD.
Para determinar la eficacia de nuestro ensayo, se realizó una prueba de respuesta a la dosis usando MDA-MB-231, una línea celular de cáncer de mama invasivo, y un anticuerpo anti-integrina β1, que se sabe que inhibe la migración celular, un paso clave para la invasión de las células cancerosas. Una inhibición dependiente de la dosis de la invasión de células MDA-MB-231 tras el tratamiento con el anticuerpo anti-integrina β1 se cuantificó fácilmente (Figura 2C). En conjunto, estos datos demuestran la capacidad de la novela ensayo de invasión en 3-D de manera fácil, efectiva y cuantitativamente evaluar el fenotipo invasivo de varias células cancerosas, así como los efectos de las drogas en la invasividad.
La estandarización de los países desarrollados la invasión de ensayo
Como se ha demostrado, los obstáculos más comunes en el desarrollo de pantallas HT 3-D son la estandarización y la lectura automatizada. Aunque nuestro ensayo es simple y rápido, la homogeneidad del tamaño y la colocación del hemisferio de células de colágeno crean un obstáculo para estos criterios. Con el fin de estandarizar y permitir la automatización, una placa de 96 pocillos equipado con un pozo de 2 mm de diámetro (4,18 mm
3) en el centro de cada pocillo fue diseñado (Figura 3A). El hoyo es de un tamaño uniforme y ubicación dentro de cada pocillo, permitiendo la estandarización del ensayo de invasión de 3-D y lectura automatizada controlada por los elementos de NIS (Nikon) de imágenes de software junto con una platina motorizada.
A) Diagrama esquemático (panel superior) de la invasión de ensayo 3-D con la placa de repujado: (a) la mezcla de células de colágeno está salpicado en los 2 mm en pozos de diámetro en el centro de cada pocillo de la placa de 96 pocillos labrado, la creación de esferas que ocupan un volumen de 4,18 mm
3; (B) que sobresale hemisferios de células de colágeno están cubiertos de colágeno; se añade (c) medio que contiene compuestos y se incuba la placa durante 18 horas; y (d) se contaron las células invadidas más allá de límites fosa. Los puntos negros representan células. Diagrama no a escala. Una imagen de una sección de una placa de labrado con un pozo en el centro de cada pocillo se muestra (panel inferior). B) La inhibición de la contracción del colágeno a través de dextrano dialdehído: células HT1080 se mezclaron con colágeno con o sin la adición de dextrano dialdehído antes de la superposición con el colágeno. imágenes de contraste de fago se tomaron a tiempo 0 y 18 horas (panel de la izquierda, la barra de escala = 250 m) y 18 horas en la placa de labrado (panel derecho, barra de escala = 100 m). Las flechas rojas indican el borde de los pozos. puntas de flecha rojas indican el borde de las esferas de células de colágeno. C) El contraste de fases y las imágenes fluorescentes de las células HT1080 invadidos en la placa de repujado impregnada con un tinte Hoechst. Barra de escala = 100 micras. D) la cuantificación automatizada: Tanto contraste de fases y las imágenes fluorescentes (A & amp; b) de las células HT1080 invasión siguientes fueron adquiridos usando una Nikon TE-2000 controlados por el software de imágenes NIS Elementos. Un umbral de la imagen de contraste de fase del primer pozo se ajustó en base al contraste para crear dos capas binarias, una dentro de la fosa (resaltado en negro) y uno fuera del hoyo (resaltado en color rosa) (c). La capa binario fuera de la fosa (área de color rosa) fue copiado para formar una región de interés (ROI), que después se aplica a la imagen Hoechst (d). Las células invadidas dentro de la ROI se contaron automáticamente con los células contadas que aparece de color púrpura (e).
Una limitación común de la utilización de un gel a base de colágeno para el cultivo celular 3-D es la contracción debido a la remodelación de las fibrillas de colágeno por diversos tipos de células [27,28] que cambia el tamaño global de el gel por células de colágeno. Para demostrar esto, hemisferios de células de colágeno de fibrosarcoma humano HT1080 fueron imágenes en el tiempo 0 y 18 horas. Los hemisferios de células en colágeno contraen, disminuyendo significativamente el diámetro de 0 a 18 horas y por lo tanto la prevención de una cuantificación exacta de la invasión de células más allá de los parámetros del pozo (Figura 3B, panel superior). Para superar esto, la adición de dextrano dialdehído, que tiene la capacidad para reticular colágeno [29], se evaluó. dextrano dialdehído se mezcló con la mezcla de células de colágeno HT1080 antes de que salpican en cada pocillo. Como se muestra en la Figura 3B (panel inferior), la adición de dextrano dialdehído inhibió significativamente la contracción del colágeno y se mantiene el tamaño original y el límite de los hemisferios de células de colágeno. No se observó efecto inhibidor sobre la invasión de células de cáncer.
Para determinar si este nuevo diseño es capaz de lectura automatizada, se utilizó una combinación de la placa de repujado invasión, una etapa microscópica automatizado (Prior Scientific, Inc.), y software de imagen (Nikon, NIS-Elements) . Después de 18 horas de incubación, las células HT1080 fueron teñidas con la tinción con colorante Hoechst nuclear seguido de adquisición de imágenes. Se tomaron dos imágenes de contraste de fase y nucleares manchados de células HT1080 para cada pozo; una imagen representativa se muestra en la Figura 3C. Un umbral de la imagen de contraste de fase se ajustó en base a la diferencia de contraste entre el interior de la fosa y fuera del pozo (el área de invasión) para crear capas binarias. Después, la capa binaria definida fuera de la zona de boxes fue copiado para formar una región de interés (ROI), que después se aplica a la imagen Hoechst. El número de células dentro de la ROI, o zona de invasión, se contó entonces de forma automática (pasos que se indican en la Fig. 3DA-e). Uso de la Nikon 10x (0,25 NA) de lente de objetivo y una etapa motorizada instalado en un microscopio Nikon TE2000s invertida, la exploración de toda una placa de 96 pocillos con 4 imágenes por pocillo podría ser completado dentro de 6 minutos (datos no mostrados). La capacidad para adquirir y analizar los datos rápidamente permite la detección de muchos compuestos en un corto período de tiempo, que es necesaria para las proyecciones HT.
Para determinar la robustez, o factor Z [30], de nuestro ensayo de invasión de 3-D, los efectos de DMSO y el tratamiento con el anticuerpo anti-integrina β1 sobre la invasión de DU145 células o MT1-GFP que expresan las células LNCaP fueron probados. El factor Z fue descrito por Zhang como Z = factor de 1-3xSSD /R (SSD: Suma de desviaciones estándar; R: valor absoluto de la diferencia entre los controles positivos y negativos), con un valor de factor de Z entre 0,5 y 1,0 indica que el ensayo es fiable [30]. Los datos recogidos en 5 días diferentes se analizaron utilizando la ecuación de factor de Z (datos no mostrados). Un factor Z de 0.65 y 0.72 de DU145 células y las células que expresan LNCaP MT1-GFP, lo que indica, respectivamente, se calculó que nuestro ensayo de invasión en 3-D cumple los criterios de un excelente ensayo para el cribado de la HTA. En conjunto, estos datos demuestran la capacidad de nuestro ensayo de invasión 3-D para ser utilizado como una herramienta de cribado de fármacos anti-invasivo HT.
determinación simultánea de compuestos que inhiben la invasión de la célula del cáncer de los que son citotóxicos
la capacidad de segregar entre los compuestos que inhiben la invasión de células de cáncer y los que inducen la muerte celular con la pantalla inicial sería eludir la necesidad de una pantalla de citotoxicidad secundaria, reduciendo el coste general y el aumento de la eficiencia. Por co-tinción de los hemisferios de células de colágeno con Hoechst y yoduro de propidio (PI), el número total de células invadidas y el efecto citotóxico del fármaco se pueden determinar simultáneamente. Para evaluar este enfoque, las células HT1080 que expresan GFP cDNA fueron tratadas con DMSO, el anticuerpo anti-integrina β1, estaurosporina (STS), un inhibidor de quinasa conocido para inducir apoptosis [31,32], o paclitaxel (taxol), un fármaco quimioterapéutico que estabiliza microtúbulos e inhibe la división celular que conduce a la muerte celular [33,34]. Después de 18 horas, las células GFP HT1080 tratada DMSO mostraron invasión de la matriz de colágeno que rodea con tinción PI mínima, indicativa de baja citotoxicidad (Figura 4A). Por el contrario, las células tratadas con el anticuerpo anti-integrina β1 habían disminución de la capacidad invasiva pero un nivel similar de tinción PI (Figura 4B). El tratamiento con STS causó un aumento significativo en la muerte celular, como se evidencia por la intensa tinción PI, y las células muestran la invasión de células abrogada (Figura 4C). Taxol, un medicamento de acción más lenta, causó una reducción significativa en la invasión de células con un modesto incremento en la muerte celular (Figura 4D). Estos datos demuestran la capacidad de nuestro ensayo para segregar medicamentos que sólo inhiben la invasión de células de fármacos que bloquean la invasión de células de cáncer debido a un efecto citotóxico.
células
HT1080 que expresan GFP se ensamblaron en el ensayo de invasión 3-D en presencia de (A) DMSO, (B) del anticuerpo anti-integrina β1 (5 mg /ml), (C) estaurosporina (STS) (500 nM), o (D) paclitaxel (Taxol, 1 M) durante 18 horas. Las células se tiñeron con Hoechst y yoduro de propidio (PI) durante 30 minutos seguido de examen microscópico. La disminución de la invasión de células se observa tras el tratamiento con anticuerpo anti-β1 integrina, STS, y taxol. Sin embargo, STS y taxol muestran niveles más altos de la tinción PI, indicativo de un aumento de la muerte celular. Los números en las esquinas superiores derecha representan el número total de células invasoras (imágenes Hoechst) o células que murió después de invadir imágenes (PI) dentro del campo. Barra de escala = 100 micras.
Validación de la capacidad de la HT 3-D Invasión Ensayo
Como prueba de principio, la Biblioteca Compuesto Instituto Nacional del Cáncer Diversidad conjunto II, que contiene 1974 compuestos estructuralmente diversos, se proyectó mediante línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231. Los compuestos se añadieron a los pocillos a una concentración final de 10 mM. DMSO, que es el vehículo, y el anticuerpo anti-integrina β1 se utilizaron como los controles positivos y negativos, respectivamente. éxitos positivos se determinaron sobre la base de un umbral de & gt; 50% de inhibición de la invasión. Basado en esto, se encontraron 24 resultados positivos, 9 de los cuales se confirmaron para ser & lt; 25% citotóxica a través de un ensayo de MTT (Figura 5A y datos no mostrados). Uno de estos éxitos fue un compuesto anti-migratorias que se conoce, el análogo quinocarmycin DX-52-1 [35], proporcionando una prueba más de que nuestro ensayo puede identificar correctamente compuestos capaces de inhibir la invasión de células de cáncer (Figura 5B).
A) La Diversidad NCI conjunto II Compuesto banco se rastreó usando el ensayo de invasión de 3-D y células MDA-MB-231, lo que resulta en 24 éxitos positivos, de los cuales 9 eran inhibidoras, pero no citotóxicos. B) A quinocarmycin analógica, DX-52-1 fue identificado positivamente como un compuesto anti-invasivo. Imágenes representativas se muestran para el control de DMSO y DX-52-1 (10 mM) después de 18 horas de incubación. la invasión de células Abrogada y baja citotoxicidad se observó en las células tratadas con DX-52-1. Los números en las esquinas superiores derecha representan el número total de células invasoras en el campo. Barra de escala = 100 micras. migración cámara C) Transwell se realizó con células MDA-MB-231 tratadas con DMSO o DX-52-1 durante 18 horas. Imágenes representativas de membranas (8 micras de tamaño de poro) se muestran en el panel izquierdo. La cuantificación de la migración celular se muestra en el panel derecho. DX-52-1 células tratadas habían disminución de la capacidad migratoria. Las barras representan la media + SD. D) ensayo de detección de proteasa fluorescente (Sigma) realizó con lisados celulares de células MDA-MB-231 tratadas con DMSO o DX-52-1 durante 18 horas. No se observó ningún efecto sobre la actividad proteolítica por tratamiento con DX-52-1. Las barras representan la media + SD. ** Se refiere a
p Hotel & lt; 0,01.
Debido al hecho de que se dirigen a la identificación es útil para la predicción de los efectos secundarios y la optimización de candidatos de plomo, es importante tener ensayos de aguas abajo que pueden ayudar a aclarar el posible mecanismo (s) de la acción de los éxitos positivos . Desde la invasión requiere actividades tanto migratorias y proteolíticas, el siguiente paso es fundamental para distinguir entre estas dos propiedades celulares. Utilizando DX-52-1 como un ejemplo, se emplearon el ensayo de migración Transwell cámara convencional y un ensayo de proteasa no específica (Sigma). Como se muestra en la Figura 5C & amp; D, DX-52-1 abrogada significativamente la migración de células MDA-MB-231 pero no tuvo efecto significativo en las actividades de la proteasa. Estos datos indican que la inhibición del comportamiento invasivo de las células MDA-MB-231 por el DX-52-1 se debe a una reducción de la capacidad migratoria, que se apoya en los informes publicados previamente [35].