Extracto
Los ratones han sido empleados como modelos de cáncer durante más de un siglo, proporcionando avances significativos en nuestra comprensión de esta familia de enfermedades multifacético. En particular, los modelos de ratón de xenoinjertos de tumores ortotópico están surgiendo como la preferencia por la investigación sobre el cáncer debido a una mayor relevancia clínica sobre los modelos subcutáneos ratón. En el presente estudio, hemos desarrollado modelos de xenoinjertos de cáncer de páncreas ortotópico en ratones mediante un método mínimamente invasivo, el ultrasonido de inyección guiada (USGI) comparable a la inyección ortotópico (SOI) métodos quirúrgicos altamente invasivos. Este método optimizado impedido complicaciones de inyección tales como retroceso de las células a través del canal de inyección o la fuga de las células fuera del páncreas en la cavidad peritoneal. El crecimiento tumoral se controló in vivo y se cuantificó mediante semanal de imágenes por ultrasonido, los tumores también se detectaron mediante formación de imágenes in vivo de fluorescencia utilizando un tumor diana sonda molecular. Los volúmenes tumorales medios para los modelos USGI y SOI después de 2 semanas de crecimiento del tumor eran 205 mm
3 y 178 mm
3, respectivamente. Por USGI de líneas celulares de cáncer de páncreas humano, se establecieron xenoinjertos de cáncer de páncreas ortotópico humanos. Sobre la base de imágenes de ultrasonido, el xenoinjerto ortotópico de cáncer de páncreas humano tome tasa fue del 100% para las dos líneas celulares de cáncer de páncreas humanos utilizados, MiaPaCa-2 y Su86.86, con volúmenes tumorales medios de 28 mm
3y 30 mm
3 . Hemos demostrado que este método USGI es factible, reproducible, fácil, mínimamente invasivo y hemos mejorado en comparación con el método SOI altamente invasiva para el establecimiento de modelos de xenoinjertos de tumores pancreáticos ortotópico adecuado para imágenes moleculares
Visto:. Huynh AS, Abrahams DF , Torres MS, MK Baldwin, Gillies RJ, Morse DL (2011) Desarrollo de un modelo de xenoinjerto de cáncer pancreático humano ortotópico usando ultrasonido guiada por inyección de las células. PLoS ONE 6 (5): e20330. doi: 10.1371 /journal.pone.0020330
Editor: María G. Castro, Universidad de California, Los Ángeles, y el Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: March 11 , 2011; Aceptado: April 20, 2011; Publicado: 27 de mayo de 2011
Derechos de Autor © 2011 Huynh et al. . Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación: Conceder una ayuda : NIH /NCI-R01 CA123547 (http://www.nih.gov/, http://www.cancer.gov/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los ratones han sido empleados como modelos de cáncer durante más de un siglo, proporcionando avances significativos en nuestra comprensión de esta familia de enfermedades multifacético. Actualmente hay cuatro áreas principales de la investigación del cáncer que utilizan modelos de ratón: biología y fisiología básica, terapéutica experimental, la prevención, la genética y la susceptibilidad y riesgo. Estos modelos han demostrado ser útiles en la validación de la función de genes, la caracterización de nuevos genes de cáncer y biomarcadores tumorales, para el conocimiento de los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a la iniciación del tumor y de los procesos de múltiples etapas de la tumorigénesis, y proporcionar mejores modelos clínicos en los que poner a prueba novela terapéutico estrategias [1]. En particular, los modelos de xenoinjerto de tumor de ratón se utilizan comúnmente en estudios preclínicos. modelos de xenoinjerto de tumor humano se crean por la inyección de células tumorales humanas cultivadas a partir de cultivo en un ratón o por el trasplante de una masa de tumor humano en un ratón. El xenoinjerto puede ser fácilmente aceptado por los ratones inmunodeprimidos tales como ratones desnudos atímicos inmunodeficientes o severamente comprometida (SCID) [2]. Hay varias ventajas clave de la utilización de xenoinjertos de tumores humanos: que cuentan con la complejidad de las alteraciones genéticas y epigenéticas que existen en la población tumoral humano; se puede utilizar para ayudar en el desarrollo de enfoques terapéuticos individualizados moleculares; y puede ser implantado de forma ortotópica para reproducir el entorno de órgano en el que el tumor crece, de modo que el efecto del tumor en su microambiente puede ser modulada [3].
Los dos tipos principales de los modelos de xenoinjerto de ratón humanos utilizados para la investigación del cáncer, y heterotópico ortotópico se definen por la ubicación del xenoinjerto implantado. Para los modelos subcutáneos heterotópico, el xenoinjerto se implanta entre la dermis y músculo subyacente y por lo general se encuentra en el flanco, en la espalda o la almohadilla plantar del ratón. Durante más de 30 años, el modelo de xenoinjerto subcutáneo ha sido el modelo de ratón preclínico más ampliamente utilizado para la investigación del cáncer, ya que es rápido, barato, fácilmente reproducible, y ha sido considerado suficientemente preclínico para probar fármacos contra el cáncer. El modelo subcutáneo también tiene las ventajas de proporcionar una confirmación visual de que los ratones utilizados en un experimento tienen tumores antes de la terapia; y proporcionar un medio para evaluar la respuesta del tumor o el crecimiento en el tiempo, en comparación con los modelos intracavitarios donde la supervivencia animal es la única medida de la respuesta de [4]. Sin embargo, las principales desventajas en el uso preclínico de modelos de xenoinjertos subcutáneos se han hecho evidentes. Se ha observado consistentemente que los regímenes de medicamentos que son curativa en modelos de xenoinjerto subcutáneo de ratón a menudo no tienen un efecto significativo en la enfermedad humana. La principal causa de este fallo puede ser debido a la observación de que el microambiente subcutánea no es relevante a la del sitio de órgano de enfermedad primaria o metastásico. Además, los modelos de tumores subcutáneos rara vez forman metástasis. Estas observaciones sugieren que los modelos tumorales heterotópico que no representan sitios apropiados para los tumores humanos no son predictivos cuando se utiliza para probar las respuestas a fármacos contra el cáncer [5].
Para hacer frente a las deficiencias de los modelos subcutáneos, xenoinjertos de tumores ortotópico cada vez más se están explorando para una mayor relevancia clínica. En este modelo, el xenoinjerto de tumor o bien se implanta o se inyecta en el órgano equivalente de la cual se originó el cáncer, o cuando las metástasis se encuentran en pacientes. Ventajas de los modelos ortotópico incluyen el uso del sitio relevante para las interacciones tumor-huésped, la aparición de metástasis relevantes de la enfermedad, la posibilidad de estudiar la dependencia de sitio específico de la terapia, órgano de expresión específica de genes y que los escenarios clínicos se puede replicar, por ejemplo, la extirpación quirúrgica del tumor primario, o terapia adyuvante de metástasis oculta [5]. Las principales desventajas son que la generación de xenoinjerto de tumor ortotópico es una labor intensiva, técnicamente difícil, costoso, que requiere más tiempo de curación y el tiempo de recuperación y que el volumen de monitorización de tumores requiere métodos de formación de imágenes relativamente más bajo rendimiento en comparación con el uso de pinzas de [5]. No obstante, los modelos de tumor ortotópico están surgiendo como la preferencia por la investigación del cáncer debido a la mayor relevancia clínica.
Hay una gran necesidad de desarrollar modelos mejorados para la investigación preclínica de cáncer de páncreas. Se estima que 43.140 personas (21.370 hombres y 21,770 mujeres) serán diagnosticados con cáncer de páncreas en 2010, y que 36.800 hombres y mujeres morirán de esta enfermedad [6]. El pronóstico es malo, con menos de 5% de supervivencia a cinco años después del diagnóstico, y la remisión completa es rara. No hay métodos eficaces de detección precoz han sido desarrolladas y el progreso en el desarrollo del tratamiento y la terapia está estancada. La gemcitabina ha sido la quimioterapia estándar durante más de una década. Sin embargo, el beneficio del tratamiento con gemcitabina como agente único en el cáncer de páncreas avanzado y metastásico es pequeño [7]. El uso de modelos de xenoinjertos ortotópico para la investigación preclínica cáncer de páncreas puede mejorar el desarrollo de terapias y modalidades de diagnóstico por imagen contra esta enfermedad.
En este estudio, se determinó la viabilidad de desarrollar modelos de páncreas humano ortotópico xenoinjertos de cáncer utilizando guiada por ultrasonido inyección (USGI) de las células tumorales. Ortotópico modelos de ratones de xenoinjerto de tumor para el cáncer pancreático han sido bien establecido desde hace muchos años. Sin embargo, estos modelos requieren la implantación quirúrgica altamente invasiva ortotópico (SOI) de las células tumorales o trozos en el páncreas. Este procedimiento puede resultar en un trauma importante, lo que requiere tiempo de recuperación post-operatorio, y puede conducir a eventos adversos, tales como infección, sangrado, la adhesión tumor a otros órganos, y otros efectos del estrés quirúrgico, por ejemplo, la curación de heridas.
Los avances recientes han permitido el desarrollo de métodos de imagen guiada para inyección ortotópico de células o tejidos en los órganos internos, lo que podría eliminar la necesidad de procedimientos quirúrgicos altamente invasivos. En particular, en tiempo real de ultrasonido mínimamente invasiva inyección guiada (USGI) de las células tumorales se puede realizar para crear modelos de xenoinjerto ortotópico. USGI de células tumorales se ha convertido en un método aceptado para el desarrollo de modelos ortotópico de carcinoma hepatocelular. Por ejemplo, un modelo resistente a múltiples fármacos se estableció con éxito en ratones desnudos a través de la implantación de células de HCC ortotópico humanos resistentes a múltiples fármacos dirigida por ecografía [8]. Hemos desarrollado con éxito un nuevo modelo de xenoinjerto ortotópico de metástasis en los ganglios linfáticos, donde se inyectaron en los ganglios linfáticos axilares número exacto de células tumorales usando la imagen de orientación de ultrasonido [9].
Un modelo de páncreas murino ortotópico singénico de ratón de cáncer era desarrollado por la inyección de células de adenocarcinoma ductal pancreático murinos, Pan02, en o cerca del páncreas de ratones C57BL /6 utilizando SonoCT guía de ultrasonido [10]. El método de guiado de ultrasonido se concluyó que es favorable en comparación con el modelo subcutáneo para la investigación de la influencia de la inmunoterapia en el crecimiento del tumor [10]. Sin embargo, los tumores resultantes de este estudio parecen estar ampliamente diseminada por toda la cavidad abdominal y no aislada únicamente en el páncreas, y no estaba claro si esto fue el resultado de la metástasis, o posiblemente las células que se liberan en el área circundante durante el procedimiento.
Nuestro estudio es el primero en informar de la inyección ortotópico de cáncer de páncreas células humanas directamente en el páncreas de ratones inmunodeprimidos por la guía del ultrasonido-imagen. Hemos caracterizado completamente el tumor toma tasas relativas al modelo quirúrgico y han confirmado por histología de que los tumores se aislaron inicialmente en el páncreas, seguido de metástasis posterior en la cavidad peritoneal en semanas posteriores. Además, hemos demostrado que un agente de imagen molecular específica se puede entregar específicamente a través de la vasculatura de los tumores resultantes en el páncreas.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todo procedimientos fueron realizados de conformidad con la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de Recursos (1996), Consejo Superior de Investigaciones Científicas, y aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Universidad de Florida del Sur bajo el protocolo aprobado R3715. ratones inmunodeprimidos están alojados en una instalación limpia, con condiciones especiales que incluyen filtrado HEPA sistemas de jaulas ventiladas, ropa de cama en autoclave, autoclave vivienda, el agua tratada en autoclave, los alimentos irradiados y de la jaula especial procedimientos cambiantes. Los ratones se manejan en condiciones asépticas, como el uso de guantes, batas y cubiertas para zapatos.
Cell Cultura y
MiaPaca 2-células (ATCC CRL-1420), células SU86.86 (ATCC CRL- 1837), y las células HCT116 parentales (ATCC CCL-247) fueron adquiridos de ATCC (Manassas, VA). Las células /δOR + cáncer de colon HCT116 fueron diseñadas genéticamente de la línea celular HCT116 los padres a muy sobre-expresar la δ-receptor opiáceo [11]. Expresión de la δOR en la superficie de HCT116 y células HCT116 /δOR + se caracterizó antes de la inyección utilizando un
in vitro
fluorescencia de resolución ensayo de unión [12]. células HCT116 /δOR +, y MiaPaCa-2 se cultivaron en medio DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero bovino normal (Atlanta Biológicos, Lawrenceville, GA) y 1% de penicilina solución /estreptomicina (Sigma, St. Louis, MO). Las células SU86.86 se cultivaron en medio RPMI (Invitrogen) suplementado con 10% de FBS (Atlanta Biologicals). Todas las células fueron cultivadas a 37 ° C y 5% de CO2.
quirúrgico ortotópico de cáncer de páncreas xenoinjerto modelo de ratón
En comparación con la técnica USGI, 5 nu /nu hembras de 6-8 semanas de edad (Harlan Sprague Dawley Inc., Indianapolis, IN) se sometió a un método quirúrgico establecida para inyección ortotópico de células en el páncreas. Para este procedimiento, los ratones fueron anestesiados bajo gas isoflurano; la piel abdominal y el músculo se practicará una incisión justo al lado de la línea media y directamente por encima de los páncreas para permitir la visualización de los lóbulos del páncreas; el páncreas se retrae suavemente y se coloca para permitir la inyección directa de un bolo de 20 l de 1 × 10
6 HCT116 /δOR + células /PBS utilizando una jeringa de 1 cc con una aguja de calibre 30; entrega exitosa de células en el páncreas se observó con una lupa usando un microscopio de disección; el páncreas se colocó de nuevo dentro de la cavidad abdominal; y tanto las capas de músculo y la piel se cerró con pegamento quirúrgico. Después de la recuperación de la cirugía, los ratones fueron monitoreados y pesaron diariamente.
las imágenes por ultrasonido
El Sonics Vevo 2100 Estación de imagen visual se utiliza para todas las imágenes de ultrasonido. adquisiciones de imágenes se realizaron con el paquete de medición abdominal mejorada en el modo B y ajustes del modo 3-D. estado fisiológico (ECG, la respiración, la presión arterial y la temperatura del cuerpo) de los ratones era estrechamente monitorizados durante cada sesión de adquisición de imágenes. Los ratones fueron imágenes antes de xenoinjertos tumorales para establecer la línea de base y luego las imágenes incluidas en la imagen a la semana durante un máximo de 4 semanas usando ultrasonido para monitorear el desarrollo de los xenoinjertos ortotópico de cáncer de páncreas.
imagen de fluorescencia
ratones portadores de páncreas ortotópico xenoinjertos de las células HCT116 /δOR + se administraron 4,5 nmol /kg de peso corporal de Dmt-Tic-Cy5 mediante inyección en vena de cola. Dmt-Tic-Cy5 es una alta afinidad (3 nM Ki) sonda específica peptidomimedic conjugado con colorante fluorescente (Cy5) que se utilizó para determinar la ubicación de las células HCT116 /δOR + por
in vivo
y
ex vivo de imágenes de fluorescencia
[12]. Después de la inyección, los ratones se mantuvieron en una cámara oscura especial y protegidos de la exposición a la luz tanto como sea posible para evitar la foto de blanqueo del colorante. -Alfalfa libre de alimentos y ropa de cama especial jaula se utiliza para minimizar la autofluorescencia.
En vivo
y
ex vivo
fluorescencia imágenes fueron adquiridas mediante la serie de Caliper Life Sciences Xenogen IVIS 200 Imaging System. Se utilizaron la excitación 615-665 nm y 695-770 nm filtros de emisión. Tiempo de adquisición varió de 0 s a 10 s para mantener el recuento de intensidad dentro del rango de 15.000 a 60.000 para evitar la saturación. Antes del análisis de datos, se realizaron de instrumentos sustracciones de fondo. Imagen vida 3.2 del software se utiliza para dibujar regiones de interés (ROI) en los tumores para determinar la señal de fluorescencia media (unidades de eficiencia). unidades de eficiencia se calculan mediante la normalización de las imágenes de emisión de fluorescencia de las variaciones en la distribución de la luz de excitación incidente en el escenario. autofluorescencia de fondo fue restada mediante la determinación de la señal de fluorescencia medio del tumor antes de la inyección.
Histología del páncreas xenoinjertos
El páncreas de los ratones fueron cosechadas, inspección visual, se fijaron en tampón de formalina al 10%, procesa , incrustado, tri-seccionada, H & amp; e se tiñe y analizada por un patólogo para determinar la presencia de tumores
Estadísticas
los datos se representan como media ± dE. y se utilizó la prueba t de Student para determinar la significación.
Resultados
Desarrollo de la ortotópico de cáncer de páncreas humano de xenoinjerto en ratones modelo usando USGI
El modelo de ratón ortotópico de cáncer pancreático humano era desarrollado utilizando 6-8 semanas de edad ratones desnudos atímicos hembra. Los ratones fueron anestesiados utilizando 3% de gas isoflurano a través de cámara de inducción y luego asegurados en decúbito dorsal en la plataforma de ultrasonido con un cono de la nariz para el mantenimiento de la anestesia en el 1,5 al 2%. La plataforma de ultrasonido que se encuentra a tener el lado páncreas del cuerpo hacia el soporte de aguja mecánico. Ultrasonido gel se aplicó al abdomen y el páncreas situados ajustando mecánicamente la posición del transductor de ultrasonidos, con el bazo como referencia. Una imagen pre-escaneada de la región abdominal del ratón se realizó utilizando la función de adquisición de imágenes modo 3D antes de xenoinjerto de establecer una línea de base para el análisis comparativo. A 0,5 ml de la jeringa con una aguja de 30 g fue colocado en el soporte de jeringa mecánica y alineado paralelo a la sonda y perpendicular al cuerpo. La aguja de la jeringa fue entonces correctamente alineada y se hace avanzar en el páncreas usando la función de superposición de guía de la aguja que permite la visualización de la alineación de la aguja y el objetivo de la inyección en el monitor de Estados Unidos. Un bolo 20 l de 1 × 10
6 células tumorales suspendidas en PBS se inyectó directamente en el páncreas con la función de micro-inyección de precisión guiada por imagen automatizado. Se utilizó una técnica de inyección optimizado, en el que el volumen de inyección se redujo desde un volumen inicial de 50 l a 20 l. En lugar de inmediatamente retirar la aguja, una segunda pausa 5 después de la inyección de células con una lenta withdrawl, deliberada de la aguja permitido para la entrega completa de las células en el páncreas. La técnica optimizada impedido complicaciones de inyección tales como retroceso de las células a través del canal de inyección o la fuga de las células fuera del páncreas en la cavidad peritoneal. Figura 1 muestra el ultrasonido en tiempo real las imágenes adquiridas de la USGI de 1 × 10
6 HCT116 /δOR + células en un bolo de 20 l en el páncreas de ratón. Una vez que se completó una inyección, la anestesia se suspendió y el ratón se devolvió a la cubierta original y observa hasta en condiciones de moverse con propósito. El estado fisiológico (frecuencia cardíaca, la temperatura corporal, el ECG y la frecuencia respiratoria) de los ratones fue rastreado durante todo el proceso utilizando Unidad de Monitoreo Avanzado fisiológica del Vevo. Tras USGI xenoinjerto, los ratones se monitorizaron y se pesaron todos los días para identificar cualquier señal de estrés o trauma debido al procedimiento y o carga tumoral, y no se observó pérdida de peso significativa u otro trauma.
A) se muestra el calibre 30 aguja en páncreas de ratón pre-inyección. B) Muestra la inyección de un bolo de 20 l de células tumorales en el páncreas de ratón.
Se eligió el /δOR + modelo HCT116 porque hemos desarrollado una sonda de imagen molecular altamente específica (DMT-Tic-Cy5 ) para la detección de células que expresan el receptor opioide δ-humana y han utilizado previamente esta sonda para el
in vivo
y
ex vivo
detección específica de HCT116 /δOR + células por imágenes de fluorescencia [12] . Aunque no ortotópico, el uso de esta línea también es relevante ya que el cáncer colorrectal se conoce la formación de metástasis en el páncreas [13].
Inicialmente, los ratones portadores de xenoinjertos ortotópico de HCT116 /δOR + a través de SOI y USGI fueron imágenes semanalmente por ultrasonido para hasta 4 semanas para controlar el crecimiento del tumor. Se utilizó la función de adquisición de imágenes en modo 3D, en el que un motor 3D traduce el transductor Microscan a través del abdomen para obtener múltiples cortes 2D que se ensamblan y dictado por el software Vevo en un conjunto de datos 3D de las estructuras anatómicas del páncreas y otra órganos abdominales. La Figura 2 muestra imágenes de ultrasonido de xenoinjertos de tumor de páncreas de ratón cojinete adquiridos en el tiempo 0 (antes de la inyección de las células), 1 semana y 2 semanas post USGI y SOI de las células. Después de 3 a 4 semanas, los ratones tuvieron extremadamente grandes tumores con abdómenes distendidos hinchados, y en estos puntos de tiempo posteriores, algunos animales tenían metástasis en diferentes regiones de la cavidad abdominal, por ejemplo, el tracto gastrointestinal, el hígado y los pulmones.
A) del páncreas de ratón normal, B) 1 semana después de la USGI, C) 2 semanas después de la USGI, D) 1 semana post-SOI, y E) 2 semanas post-SOI.
para demostrar la viabilidad de desarrollar un modelo ortotópico de páncreas por USGI que es comparable a los métodos de SOI, 5 ratones cada uno se sometió a USGI o SOI de 1 × 10
6 HCT116 /δOR + células en el páncreas. El crecimiento tumoral se controló y se cuantificó mediante semanal de imágenes por ultrasonido. Después de 2 semanas, se observaron grandes tumores de xenoinjertos pancreáticos en los 10 ratones por imágenes de ultrasonido (Figura 3). mediciones de volumen 3D se cuantificaron mediante el uso de la herramienta de volumen 3D-Mode, en el que los volúmenes son creados por dibujo contornos alrededor del tumor en cada 10 rebanadas de la serie de imágenes para crear un volumen del tumor 3D y la imagen. La Figura 3 muestra imágenes de ultrasonido 3D representativos de la USGI (3A) y modelos de xenoinjerto de ratón SOI (3D) 2 semanas después de la inyección de las células tumorales. La media de los volúmenes tumorales (n = 5) para los modelos USGI y SOI se graficaron con el tiempo en la Figura 4 y se registran en la Tabla 1. Los ratones, se administraron sonda /kg DMT-Tic-Cy5 4,5 nmol través de una inyección en la vena caudal.
In vivo
imágenes de fluorescencia fueron adquiridos 24 horas más tarde, que proporcionan el máximo contraste. La
in vivo
imágenes de fluorescencia de la Figura 3 muestran la captación de la sonda fluorescente en la zona del páncreas para ambos modelos de ratones, lo que indica la presencia de células HCT116 /δOR + tumorales. La señal
in vivo
de fluorescencia media (n = 5) fue 2 veces mayor para SOI comparación con el modelo USGI, p & lt; 0,002 (Figura 5). Sobre la base de
in vivo
ecografía y la fluorescencia de imágenes, la tasa de aceptación fue del 100% para ambos modelos durante el uso de células HCT116 /δOR + tumorales.
El azul área sombreada representa el tumor generada por la realización del tumor en 3D mediciones de volumen. A) Imagen de ultrasonido del modelo USGI, B)
in vivo
imagen de fluorescencia del modelo USGI, C)
ex vivo de fluorescencia
imagen del páncreas de ratón de la imagen de ultrasonido del modelo USGI, D) modelo de SOI, e)
in vivo
imagen de fluorescencia del modelo de SOI, y F)
ex vivo de fluorescencia
imagen del páncreas de ratón del modelo de SOI.
Para determinar si USGI se puede utilizar con líneas celulares de cáncer de páncreas humano, 5 ratones se sometieron a USGI de 2 × 10
6 MiaPaCa-2 células en un bolo de 20 l y otros 5 ratones fueron sometidos a USGI de 2 × 10
6 SU86.86 células. Después de 2 semanas, todos los ratones tenían xenoinjertos de tumores de páncreas ortotópico observadas por imágenes de ultrasonido y la inspección visual (Figura 6). La media de los volúmenes tumorales (n = 5) se representaron en el tiempo para los tumores pancreáticos humanos MiaPaCa-2 y Su86.86 (Figura 7) y grabado en la Tabla 1. Basado en
in vivo
de imágenes por ultrasonido, el xenoinjerto ortotópico tome tasa fue del 100%, mientras que el uso de las dos líneas celulares de cáncer de páncreas humano, MiaPaCa-2 y Su86.86.
la zona de sombra azul representa el tumor generada mediante la realización de mediciones del volumen tumoral en 3D.
Validación por ex vivo la imagen de fluorescencia e Histología
Inmediatamente después de
in vivo
de fluorescencia de imágenes, el HCT116 /δOR + tumoral xeongraft teniendo ratones fueron sacrificados humanitariamente, examinó visualmente para detectar la presencia de tumores en otras partes del cuerpo, y los órganos principales (corazón, pulmones, riñones, hígado, bazo, páncreas, tracto GI) que se retiró, y
ex vivo
imágenes de fluorescencia adquiridos 24 horas después de la administración de la sonda fluorescente específica. El
ex vivo
fluorescencia media (n = 5) adquirido de los páncreas de ambos modelos es relativamente el mismo (Figura 5). Según lo determinado por
ex vivo
de formación de imágenes, sonda de fluorescencia específica estaba presente en 100% de los páncreas de ratón (n = 5) para los dos modelos, y se observó un bajo nivel de fluorescencia en los riñones (Figura 8).
Por histología, se observaron tumores en el 100% de los páncreas que sufrió USGI o SOI utilizando células HCT116 /δOR +. No se observaron tumores en sólo 4 de los 5 (80%) de los páncreas inyectado con MiaPaCa-2 o SU86.86 células, a pesar de que la tasa de absorción fue 100% basado en la formación de imágenes de Estados Unidos. La histología del páncreas éstos solamente se preparó a partir de 3 secciones que eran 50 m de distancia, por lo tanto, es probable que los tumores se perdieron durante el corte. La figura 9 muestra representativa H & amp; E tinción de páncreas de ratón que contiene xenoinjertos de tumores de las tres líneas celulares. Para xenoinjertos /δOR + de células HCT116, el porcentaje medio (n = 5) de tejido maligno con respecto al tejido no afectado se encuentra en una sola sección del páncreas fue 76 ± 15% para el método de SOI y 62 ± 13% para USGI (Tabla 2) . Cada xenoinjerto fue clasificado histológicamente para el tipo de malignidad y la media de porcentaje obtuvo (n = 5) para SOI y USGI respectivamente: 84% ± 9 y 85% ± 9 celular, 12% ± 5 y 11% ± 6 del estroma, y 4% ± 4 y 4% ± 3 necrótico (Tabla 2)
.
La vista magnificación 20X muestra páncreas normal (indicado por flechas negras) adyacente a las células del tumor (indicado por flechas rojas).
Discusión
a lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer relato de los xenoinjertos ortotópico de células cancerosas pancreáticas humanas por USGI en el páncreas de ratón. En este estudio, hemos demostrado que este método USGI es factible, reproducible, fácil, mínimamente invasivo y hemos mejorado en comparación con el método SOI altamente invasiva para el establecimiento de modelos de páncreas ortotópico adecuados para aplicaciones de imágenes moleculares. USGI es una mejora sobre el método de SOI para formación de imágenes debido a que la porción invasiva del procedimiento tarda sólo 30 segundos frente a 5 minutos y con una recuperación más corto y el tiempo de curación. La herida quirúrgica todavía estaba presente en el momento de imágenes de fluorescencia después de 2 semanas con el método de SOI, mientras que el pinchazo de la aguja herida USGI ya no era visible después de 1 día. La presencia de la herida quirúrgica altera las propiedades de autofluorescencia de la piel y por lo tanto puede disminuir los estudios de imágenes de fluorescencia de calidad.
De imágenes
El ultrasonido se utiliza para realizar un seguimiento de la inyección de células tumorales
in vivo
. La visualización en tiempo real de las inyecciones de células permitido para la optimización del método de inyección. En los experimentos iniciales, se observó células se derraman fuera de la páncreas en la cavidad peritoneal cuando un bolo 50 l de células tumorales se inyectó directamente en el páncreas por tanto el método USGI y SOI. Este volumen fue elegido inicialmente porque era el volumen utilizado en el modelo de páncreas ortotópico singénico desarrollado por Schneider et al, en el que se observaron metástasis abdominales en la mayoría de los casos [10]. También se observó metástasis abdominales en ratones que recibieron un bolo de 50 l y sospechar que estas metástasis pueden ser debidos a los derrames de células. También se observó el retroceso de las células a través del canal de inyección cuando la aguja se eliminó de los páncreas demasiado rápido, lo que resultó en 3 ratones el desarrollo de un tumor pequeño subcutánea en el sitio de inyección. Por lo tanto, hemos optimizado el volumen de inyección de 20 l y el método de inyección para evitar derrames y el retroceso de las células del páncreas.
Los experimentos iniciales determinaron que xenoinjertos de páncreas ortotópico de células HCT116 /δOR + exhiben diseminación peritoneal después de 3 a 4 semanas, lo que ha sido reportado por otros, así [14], [15], [16]. En este marco de tiempo, se observó metástasis en el peritoneo, hígado y pulmones. Metástasis no se detectaron a las 2 semanas. Otros han observado metástasis significativa al peritoneo, hígado, los pulmones y ganglios linfáticos después de la inyección ortotópica quirúrgica de las células tumorales en el páncreas [17]. Esto sugiere que los xenoinjertos de cáncer de páncreas usando células HCT116 /δOR + son similares a los xenoinjertos de células de cáncer de páncreas. Ya que estábamos investigando la viabilidad de USGI mediante la determinación de xenoinjerto de tumor tome tasa y no metástasis, que elegimos para llevar a cabo el resto del estudio utilizando ratones con un 2 semanas de edad xenoinjertos de cáncer de páncreas ortotópico
.
La ecografía y la fluorescencia de imágenes se utilizaron para identificar la localización de los tumores y para controlar el progreso del crecimiento del tumor
in vivo
. Aunque las células HCT116 /δOR + son las células de cáncer colorrectal humano, que son relevantes para los modelos de xenoinjerto de páncreas, ya que son conocidos para formar metástasis ocultas en el páncreas [13]. Además, podrían ser rastreados por una sonda de imagen molecular habíamos desarrollado anteriormente, el peptidomimético sonda fluorescente (Dmt-Tic-Cy5) que se dirige específicamente el receptor δ-opioide expresado en la superficie de esta línea de células tumorales con una afinidad sub nM [12 ].
El éxito en la generación de xenoinjertos de tumores pancreáticos ortotópico usando USGI era comparable a nuestros métodos SOI utilizando células HCT116 /δOR +. Sobre la base de imágenes de ultrasonido,
in vivo e imagen
ex vivo de fluorescencia, y el análisis histológico, el xenoinjerto toman tasa fue del 100% tanto para USGI y SOI utilizando células HCT116 /δOR +. Para ambos modelos, hay una fuerte correlación en la formación de tumores observada utilizando tanto el ultrasonido y la fluorescencia de imágenes. Snyder et al., Han informado también de que la fluorescencia y modalidades de imágenes de ultrasonido son enfoques complementarios para el seguimiento de la progresión tumoral y la respuesta al tratamiento en los estudios preclínicos utilizando modelos de ratón ortotópico de cáncer pancreático humano [18]. Los volúmenes de xenoinjertos de tumores de SOI y USGI fueron comparables en ambos 1 y 2 semanas después de la implantación. señal de fluorescencia media Sin embargo, el cuantificado (n = 5) adquirido de
in vivo
formación de imágenes del modelo SOI fue 2 veces mayor en la mejora en comparación con el modelo USGI mientras que no hubo diferencia significativa en la cuantificado
ex vivo
señales. La
in vivo
señal de fluorescencia generada a partir del aumento de modelos de SOI relación a
ex vivo
señal puede ser debido a las complicaciones quirúrgicas, tales como trauma del tejido en esta región causando la cicatrización de heridas. La herida en el sitio de inyección quirúrgico todavía estaba presente en el momento de formación de imágenes de fluorescencia, que puede haber aumentado propiedades fluorescentes en comparación con tejido no afectado. En cualquier caso,
in vivo
de fluorescencia de imágenes del modelo USGI fue superior a SOI, como el cuantificada
in vivo
señal era equivalente al
ex vivo
señal obtenida del páncreas . En el punto de tiempo después de la inyección 24 hr de sonda fluorescente específica, se observó un bajo nivel de fluorescencia en los riñones, bazo, corazón y pulmones. Sin embargo, el modelo de SOI tenía significativamente mayor de la señal, p & lt; 0,002, en estos tejidos en comparación con USGI. Esto es posiblemente debido a un aumento de la metástasis de xenoinjertos generados por SOI en relación con USGI al mismo tiempo después de la inyección de punto de las células (2 semanas). Sobre la base de la cantidad media de malignidad con respecto al tejido normal del páncreas como se determina por el patólogo (Tabla 1), los 2 métodos produjeron casi iguales tipos de malignidad; con un promedio de 85% celular, 11% del estroma y 4% de componentes necróticos. Por lo tanto, hemos demostrado que los xenoinjertos ortotópico tumor de páncreas en USGI es factible y comparable a los resultados obtenidos por SOI
.
Desde las fases iniciales del estudio utilizaron células de cáncer colorrectal, dos líneas de células pancreáticas humanas, MiaPaCa-2 y