Extracto
El éxito clínico de la inmunoterapia adoptiva del cáncer se basa en la selección de antígenos diana que son altamente expresado en las células tumorales, pero ausente en tejidos normales esenciales. Un grupo de genes que codifican los antígenos de cáncer /testículo o de la línea germinal del cáncer se han propuesto como objetivos ideales para la inmunoterapia debido a su alta expresión en múltiples tipos de cáncer y su expresión restringida en tejidos normales inmunoprivilegiado. En el presente trabajo se reporta el aislamiento y caracterización de receptores de células T humanas (TCR) con especificidad para el sarcoma sinovial X punto de interrupción 2 (SSX2), un antígeno de cáncer /testículo expresado en el melanoma, el cáncer de próstata, linfoma, mieloma múltiple y el cáncer de páncreas, entre otros tumores. Se aislaron siete HLA-A2 restringido receptores de células T de clones de células T naturales derivados de los ganglios linfáticos infiltrados de tumor de dos pacientes con melanoma SSX2 seropositivos, y se seleccionaron cuatro TCR para la clonación en los vectores retrovirales. linfocitos de sangre periférica (PBL) transducidas con tres de los cuatro SSX2 TCR mostraron SSX2
reactividad específica 41-49 péptido (KASEKIFYV), el reconocimiento de células tumorales y tetrámero de unión. Uno de éstos, TCR-5, mostraron unión en las células tanto CD4 y CD8 tetrámero y se seleccionó para estudios adicionales. Se observó liberación de interferón-γ, la lisis celular y la proliferación de linfocitos específicos de antígeno y HLA-A * 0201-restringido después del cultivo de TCR diseñado PBL humana con líneas de células tumorales pertinentes. Se encontró optimización de codones para aumentar TCR-5 de expresión en las células T transducidas, y esta construcción se ha seleccionado para el desarrollo de las células productoras de vectores virales de grado clínico. El patrón específico de tumores de expresión de SSX2, junto con la actividad potente y selectivo de TCR-5, hace que este TCR un candidato atractivo para la terapia génica potencial TCR para el tratamiento de múltiples histologías de cáncer
Visto:. Abate-Daga D, Speiser DE, Chinnasamy N, Zheng Z, Xu H, Feldman SA, et al. (2014) Desarrollo de un receptor de células T Referencia a una HLA-A * 0201 Restringido epítopo del antígeno del cáncer de testículo-SSX2 para la inmunoterapia adoptiva del cáncer. PLoS ONE 9 (3): e93321. doi: 10.1371 /journal.pone.0093321
Editor: Nupur Gangopadhyay, Universidad de Pittsburgh, Estados Unidos de América
Recibido: 13 de diciembre de 2013; Aceptado: March 4, 2014; Publicado: 28 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto fue apoyado en parte por una contribución de la Fundación de la Familia Milstein y por el Programa de Investigación Intramural del Centro para la Investigación del cáncer, Instituto Nacional del cáncer, Bethesda MD. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los recientes avances en el campo de la inmunología tumoral, la genómica del cáncer y las tecnologías de transferencia génica han permitido el desarrollo de terapias basadas en la transferencia adoptiva de células T reactivas a tumores autólogos para el tratamiento de tumores malignos humanos [1], [2 ]. células T tumorales reactiva puede ser natural, como en el caso de los linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) purificadas a partir de lesiones resecados y estimulado
ex vivo
, o generada a partir de sangre periférica mediante la introducción de genes que codifican para los receptores inmunes [3 ].
Mientras que la tasa alta (50-70%) de las respuestas clínicas objetivas obtenidos por tratamiento TIL en los pacientes con melanoma en estadio avanzado estableció una prueba sólida de concepto para el tratamiento de cánceres humanos con las células T [4 ], [5], su aplicación generalizada está limitado por la dificultad en el cultivo y la expansión de estas células T a los números clínicamente relevantes para cada paciente. Como un enfoque alternativo, la especificidad de antígeno de las células T de sangre periférica fácilmente disponibles se puede redirigir a los antígenos expresados en células tumorales mediante modificación genética. La transferencia adoptiva de células T autólogas ingeniería genética para expresar los receptores de células T (TCR) o receptores inmunes quiméricos derivados de anticuerpos puede resultar en una respuesta inmune celular potente frente a tejidos que expresan los antígenos diana, incluso a niveles bajos [3], [6] - [ ,,,0],8]. Por tanto, es decisivo para seleccionar cuidadosamente los antígenos que se expresan en las células tumorales pero ausente en tejidos normales esenciales, a fin de evitar indeseados efectos tóxicos en-blanco /off-tumor.
esfuerzos actuales en la identificación de los antígenos diana óptimas para inmunoterapia adoptiva se centran principalmente en los neoantígenos generados por mutaciones somáticas presentes en los tumores, pero ausente en los tejidos normales [9], [10], en antígenos expresados en tejidos normales prescindibles, y en un grupo de genes que codifican para el cáncer de testículo ( CT) antígenos. Estas últimas se definen por su patrón de expresión que, en los adultos, generalmente se limita a no MHC que expresan las células germinales del testículo, que por lo tanto no presentan antígenos a las células T, y células tumorales de origen diverso [11] - [13 ]. La transferencia adoptiva de linfocitos de sangre periférica autólogas que expresan un TCR específico para un antígeno de cáncer de testículo, NY-ESO-1, mediada regresiones tumorales objetivas en pacientes con melanoma avanzado y con sarcoma de células sinoviales, sin NY-ESO-1 toxicidad relacionada [14 ].
con el fin de ampliar el repertorio de antígenos que pueden ser objetivo de este enfoque, por lo tanto, ampliar el número de pacientes y tipos de tumores que se pueden tratar, hemos desarrollado un vector que expresa TCR-dirigidas a un miembro de la El sarcoma sinovial familia X punto de interrupción, SSX2. Los genes sinovial sarcoma X punto de interrupción (SSX) están situados en el cromosoma X y codifican una familia de diez proteínas nucleares altamente homólogas, SSX1-10. SSX2 se identificó originalmente como parte de una translocación genómico presente en el sarcoma sinovial [15], [16] y más tarde resultó ser idéntica a HOM-MEL-40, una proteína inmunogénica sabe que inducen respuestas de anticuerpos espontáneos en el 10% de los pacientes con melanoma [17].
Hemos generado vectores retrovirales que codifican la alfa y beta-TCR cadenas dirigidas a la HLA-A * 0201-epítopo restringido SSX2
41-49, aislado de pacientes con melanoma anteriormente descritos se presentan activa inmunológico respuestas a SSX2 [18]. Además, demostró que las células T modificadas con estos vectores reconocen líneas celulares derivadas de múltiples histologías de cáncer. Optimización de la expresión y la actividad de TCR mediante la modificación de su secuencia de nucleótidos nos permitió identificar el diseño óptimo para la expresión eficaz y reactividad específica de antígeno potente contra SSX2. La producción de una línea celular productora retroviral vector de grado clínico se siguió profundizando para su futura aplicación en ensayos clínicos de inmunoterapia adoptiva.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y los PBL humanos
HLA-a * 0201 + /SSX2 + línea celular de melanoma 624, y no HLA-a * 0201 líneas celulares 888 y 938 se establecieron a partir de tumores de melanoma metastásico resecado quirúrgicamente y se mantuvo a la Unidad de Cirugía, Instituto Nacional del cáncer, de los Institutos nacionales de Salud ( Bethesda, MD). El HLA-A * 0201 + /+ SSX2 línea celular de glioma U251 se obtuvo de la División de Tratamiento y Diagnóstico del Cáncer Repositorio tumor, Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud (Frederick, MD). líneas de melanoma SKmel23 y SKmel37, y línea celular de cáncer de mama MCF7 se adquirieron de ATCC (Manassas, VA). Cos7-A * 0201 y * 0201 células 293-A fueron diseñados retrovirus para expresar HLA-A * 0201, como se describe anteriormente [19], [20]. Cos7-A * 0201-SSX2 y células * 0201-SSX2 293-A se transdujeron con un vector retroviral que expresa el ADNc de SSX2. T2 es una función TAP línea de células que carecen de linfoblastoide, cuyas proteínas HLA de clase I pueden ser fácilmente cargados con péptidos exógenos. PG13 clones de embalaje se generaron utilizando el mono gibón línea celular de empaquetamiento del virus de leucemia PG13 (ATCC CRL-10686), y la línea celular de empaquetamiento ecotrópico humana, Phoenix ECO (amablemente proporcionado por el Dr. Hans-Peter Kiem, Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson, Seattle , WA). Todas las células se cultivaron en medio D10 que consiste en alta glucosa (4,5 g /L), medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS, Hyclone, Logan, UT) y 6 glutamina mM (concentración final; Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células se mantuvieron a 37 ° C y 5% de CO
2.
linfocitos de sangre periférica utilizados en este estudio se obtuvieron de los pacientes con melanoma tratados en la Unidad de Cirugía, Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud, en protocolos NCI-Junta de Revisión Institucional aprobado. Los pacientes dieron su consentimiento por escrito para la obtención de tejidos y uso de éstos para fines de investigación, tal como se detalla en el protocolo 03-C-0277. Los linfocitos humanos se mantuvieron en medio AIM-V (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 5% de suero humano AB (Valle Biomedical, Winchester, VA), 50 U /ml de penicilina, 50 mg /ml de estreptomicina (Invitrogen), y 300 IU /ml de IL-2 y se mantuvo a 37 ° C con 5% de CO2. clones de células T específicas SSX2 estaban recién generados a partir de células de los ganglios linfáticos infiltrados derivados de tumores de pacientes T Lau Lau 567 y 672, de manera similar a lo descrito previamente [18].
Los péptidos sintéticos
El SSX2
41-49 péptido (KASEKIFYV) correspondiente a los aminoácidos 41-49 de SSX2 y péptidos homólogos derivados de SSX1 (KYSEKISYV), SSX3 (KVSEKIVYV), SSX4 (KSSEKIVYV), SSX5 (KASEKIIYV), SSX6 (KFSEKISCV), SSX7 (KSLEKISYV), SSX8 (KYSEKISYV), SSX9 (KSSEKIIYV), SSX10 (KASEKILYV), IGSF22 (KESAKIFYD), ARHGAP1 (KFGQKIFYV), GPR82 (SCYEKIFYG), PHF8 (LKGEKIFYL), LIPM (TGQEKIYYV), SYT14 (IVGEKIFYL), TCOF1 (KASEKILQV), RBL2 (SPREKIFYY) y FRAS1 (SPREKIYYV) fueron sintetizados por GenScript (Piscataway, NJ). Los péptidos se disolvieron en DMSO y se diluyeron en medio RPMI 1640 para la carga de células T2. La afinidad de unión a HLA-A2 * 0201 fue predicho para cada péptido utilizando NetMHC-3,0 [21]. Identificación de péptidos homólogos a SSX2
41 a 49 con un potencial de reactividad cruzada se realizó mediante la búsqueda BLAST (algoritmo BLASTP).
Construcción de vectores retrovirales para la expresión de SSX2-específico HLA-A * 0201 restringidas-TCR
vectores retrovirales basados en MSGV1
se construyeron mediante PCR de solapamiento con el alfa- y beta-cadenas de TCR dispuestos en el orden siguiente: cadena alfa del TCR, enlazador peptídico furina-SGSGP2A, TCR beta-cadena , como se describe anteriormente [22]. Los insertos de TCR clonados fueron verificados por un perfil de la enzima de restricción y secuenciación de ADN directa. El ADNc que codifica para la versión de codón optimizado del TCR-SSX2 específico y un TCR codones optimizados con las regiones constantes murinas fueron sintetizados por GenScript. La versión híbrida humana-ratón de TCR-5 fue diseñado como se describe anteriormente [23].
T transducción de células
sobrenadantes retrovirales se generaron mediante la transfección de cada plásmido pMSGV1-SSX2-TCR junto con una vector de codificación RD 114 sobre en células 293-GP usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) en medio Opti-MEM (Invitrogen) [22]. sobrenadantes virales se cargan en recubierto de RetroNectin (Takara Bio, Japón) placas de seis pocillos tratadas con cultivo de tejido no. PBLs se estimularon con OKT3 (50 ng /ml) y rhIL-2 (300 UI /ml) 48 h antes de la transducción, y la transducción se llevó a cabo como se describe anteriormente [24].
tinción de tetrámeros
HLA-a * 0201-restricted SSX2
41-49 (KASEKIFYV) fueron producidos por los Institutos nacionales de Salud de tetrámeros Core Facility de la Universidad de Emory (Atlanta, GA) con ficoeritrina (PE) como el fluorocromo. Para la evaluación de la eficacia de transducción TCR en subconjuntos de células T, las células T transducidas se tiñeron con un marcado con FITC anti-CD8 humana (BD Pharmingen, San Jose, CA) y marcado con PE con HLA-A * 0201 tetrámeros. Las células fueron analizadas utilizando un citómetro de flujo FACScan con el software CellQuest (BD Biosciences) o software FlowJo (Árbol Star, Ashland, Oregón).
La liberación de citoquinas ensayo
linfocitos transducidos-TCR se probaron para el antígeno reactividad en los ensayos específicos de la liberación de citoquinas utilizando células T2 cargadas con péptido o células tumorales. A tal fin, las células efectoras y células diana se cocultivaron a una relación de 1:01 (1 × 10
5 de cada uno) en 200 uL de medio AIM-V en pocillos duplicados de una microplaca de 96 pocillos. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron 18-24 h después del inicio del co-cultivo y se ensayaron para interferón-γ (IFN-gamma) por ELISA (Thermo Scientific).
[
51Cr] ensayo de liberación de
La capacidad de los PBL transducidas para la lisis de las células HLA-a * 0201 + SSX2 + tumorales se evaluó utilizando un estándar [
51Cr] ensayo de liberación como se describe anteriormente [25] PBL brevemente, ingeniería-TCR se cultivaron con la disminución de las relaciones de
Las células diana marcadas con 51Cr (relación E: T) en medio AIM-V en placas de 96 pocillos U a 37 ° C durante 4 h. La lisis se mide por la liberación [
51Cr] en el medio de acuerdo con la fórmula: porcentaje de lisis = (liberación de la muestra - la liberación mínimo) /(liberación máxima - liberación mínimo) x 100%. Resultados expresados como media de muestras duplicadas.
Generación de un clon de embalaje PG13 que codifica un TCR específico-SSX2
Un clon de células de empaquetamiento retroviral PG13 se generó como se ha descrito anteriormente con las siguientes modificaciones [24] . células Phoenix ECO se transfectaron con 9,5 g de ADN plásmido (pMSGV1-SSX2.567.5-co) usando el reactivo Lipofectamine 2000cd transfección (Life Technologies, Carlsbad, CA). Después de 48 h sobrenadante se recoge y se utiliza para transducir línea celular de empaquetamiento retroviral, mayores de 13 años. No tejido de cultivo tratado placas de 6 pocillos recubiertas con 20 mg /ml RetroNectin como se describe por el fabricante. Se añadió retroviral vector sobrenadante (4 ml) a cada pocillo seguido de centrifugación (2000 x g) a 32 ° C. Después de 2 h, el sobrenadante se retiró y 5 × 10
se añadieron 5 PG13 células al pocillo, se centrifugaron (1.000 xg) durante 10 min a 32 ° C. Dos rondas de transducción se llevaron a cabo y los clones entonces PG13 embalaje se generaron mediante la limitación de la clonación de dilución. Debido a la falta de un marcador de selección, los clones de alto título se identificaron por RNA de transferencia en punto, como se describe anteriormente [24], [26]. Retroviral vector de los 6 clones título más alto se genera como se describe. Brevemente, 175 cm
2 frascos de cultivo de tejidos (Nunc, Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) se sembraron a 4 × 10
4 células /cm
2, seguido de un intercambio de medio (30 ml) en el día 3. el sobrenadante se cosechó 24 h después, se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 ° C hasta su uso posterior. Se evaluó el sobrenadante de cada clon para la capacidad de transducir eficientemente PBL humano y provocar IFNg en un ensayo de liberación de citoquinas. Un clon de alta titulación será seleccionado para la producción de un banco de células madre y GMP posterior retrovirales sobrenadante de vector.
Generación de GMP de vectores retrovirales sobrenadante
Un total de 26 de 1,700 cm
2 expandieron botellas de rodillos de superficie fueron sembradas el día 0 a una densidad celular de 4 x 10
4 células /cm
2 en 200 ml de medio D10. En el día 3, el medio se cambió y se sustituyó por 120 ml de medio D10. Medio que contiene el vector retroviral se cosechó diariamente con botellas se volvieron a alimentar con 120 ml de medio. Los niveles de glucosa se controlaron diariamente utilizando el sistema Accu-check de Roche (Roche, Basal, Suiza). Si los niveles de glucosa disminuyeron por debajo de 2 g /L, el volumen de la bolsa de medio se doble a 240 ml /botella de rodillos para todas las cosechas posteriores. Todas las cosechas se dividen en partes alícuotas y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso posterior. Una alícuota de cada cosecha se ensayó para determinar la eficacia de transducción y la liberación de citoquinas como se describe anteriormente. Todos los productos clínicos fueron sometidos a un extenso programa de pruebas de seguridad de la biotecnología de conformidad con las directrices reguladoras actuales (Administración de Drogas y Alimentos de EE.UU., Centro para la Evaluación e Investigación Biológica; Puntos de referencia a tener en cuenta en la producción y ensayo de nuevos medicamentos y productos biológicos producidos por tecnología recombinante de ADN , 1985; Puntos a considerar en la caracterización de líneas celulares utilizadas para producir productos biológicos, 1993; Guía para la industria: Guía para la terapia celular somática humana y Terapia génica, 1998; Guía para la industria, IND - Enfoques de cumplir con CGMP durante la Fase I, 2006).
resultados
clonación de los TCR SSX2 reactiva humanos
Las regiones codificantes del TCR alfa y beta cadenas fueron clonados a partir descrito anteriormente natural SSX2 reactiva las células T de dos pacientes con melanoma [18]. Estas células CD8 restringidas por HLA-A2 reconocen un epítopo que comprende los residuos 41 a 49. El ADNc se sintetizó por 5 'RACE utilizando cebadores específicos para la región constante de los genes de TCR y los productos fueron secuenciados, la identificación de siete pares diferentes de TRAV y genes TRBV ( tabla 1). Los casetes de expresión que contienen las cadenas alfa y beta de TCR separadas por el péptido 2A enlazador [27], [28] fueron generados por PCR de solapamiento y se clonaron en a pMSGV1 para la generación de vectores de expresión retrovirales para clones 5, 8, 9 y 11 ( la figura 1A).
la región codificante de cada cadena alfa de TCR fue amplificado por PCR usando los cebadores, flanqueada por un sitio de restricción NcoI en el extremo 5 'y una secuencia que contiene el elemento en voladizo en el extremo 3'. En paralelo, cada cadena beta de TCR se amplificó por PCR usando un cebador directo que contiene un saliente que se superpone con el 3 '5 voladizo presente en el cebador utilizado para la amplificación de la cadena alfa. El cebador inverso usado para la amplificación de la cadena beta contenía un codón de parada y un
Eco
sitio de restricción RI. En una segunda ronda de PCR, los productos de las amplificaciones alfa y beta de cadena se agruparon, y la ligación de los dos fragmentos de ADNc a través de los salientes de solapamiento se logró mediante PCR usando los cebadores externos. Los productos resultantes de la PCR se clonaron en el vector de pMSGV1 para la producción de retrovirus. LTR: repetición terminal larga, sd: donante de empalme, SA: aceptor de empalme, ψ:. Señal de encapsidación de retrovirus
La expresión de TCR en linfocitos humanos clonados
sobrenadantes de vectores retrovirales fueron generados por transfección transitoria de 293GP y se utiliza para la transducción de células T humanas estimuladas con OKT3. Expresión y el montaje correcto de los TCR se evaluó por citometría de flujo, utilizando la etiqueta fluorescente HLA-A2-SSX2
41-49 tetrámeros. TCR5 se expresó eficazmente tanto en las células CD8 y CD4, y TCR9 TCR11 se expresaron sólo en las células CD8, mientras que la expresión de TCR8 no fue detectada por esta técnica (figura 2 A).
A) Análisis de la expresión en superficie de SSX2
TCR-41-49 específicas de CD8 y CD4 T poblaciones celulares por citometría de flujo. células mononucleares de sangre periférica humana fueron estimuladas con OKT3 y transducidas con los vectores de expresión retrovirales indicados. Una semana más tarde, las células fueron teñidas con CD3, anticuerpos anti-CD8 humanos y con un tetrámero marcado fluorescentemente que contiene el SSX2
41-49 péptido. Los resultados de un donante representativo de al menos cuatro experimentos independientes. Eventos cerrada en linfoide, individuales, viables, células CD3 +. B) - D) Concentración de IFNg en los sobrenadantes de las células T transducidas con TCR cultivadas durante la noche con los objetivos indicados (1 × 10
5 efectores vs 1 × 10
5 objetivos). Los resultados muestran como la media de los duplicados de dos donantes representativos de cada cuatro. UT:. Untranduced
La reactividad de PBL transducidas con anticuerpos anti-TCR SSX2 contra las células tumorales positivas SSX2
El correcto procesamiento y presentación de la SSX2
41-49 epítopo , y el reconocimiento por PBL ingeniería-TCR se probaron in vitro mediante el cultivo de la PBL con derivados de células Cos-7 y HEK293 que expresan HLA-a * 0201 con o sin expresión concomitante de la SSX2 antígeno (Cos-A2, Cos-A2 SSX2 , 293-A2 y 293-A2 SSX2, respectivamente). Como se muestra en la figura 2B, las células T transducidas con -11 altos niveles secretados de IFNg TCR-5, -9 y (en el orden de 1 × 10
4 pg /ml) cuando cocultivaron con SSX2-transfectantes. Las células T secretadas sólo los niveles de fondo de IFNg, en línea con la falta de unión tetrámero se muestra en la figura 2A TCR-8-transducidas. Con el fin de verificar el HLA-A * 0201 restricción de estos TCR, una SSX2-positivo HLA-A * línea 0201-negativo de células de melanoma (938) o su derivado ingeniería genética para expresar HLA-A * 0201 (938-A2) se utilizaron como dianas para experimentos de cocultivo. Como se muestra en la figura 2C, los linfocitos que expresan TCR-5, -9 y -11 IFNg secretada solamente cuando se cultivan en presencia de células 938-A2. Reconocimiento de SSX2 endógeno 938-A2 fue más fuerte en linfocitos transducidos-TCR-5, como se evidencia por un veces 2 mayor secreción de IFNg por dichas células en comparación con la de las células T transducidas con TCR-9 y -11 (Figura 2C).
para probar la capacidad de estos TCR para reconocer el SSX2 endógeno expresado por las células tumorales, cultivamos PBLs (transducidas con TCR-5, -8, -9, -11) con líneas celulares derivadas de melanoma (888, SKMEL-23, 624), glioma (U251), y cáncer de mama (MCF-7). Como se muestra en la figura 2D, TCR-5, -9 y -11 mediada liberación IFNg por los linfocitos transducidos cuando se cultivan en presencia de HLA-A células tumorales SSX2-positivo * 0201-positivos de glioma y melanoma. Es de destacar que TCR-5 mediado el reconocimiento del objetivo más fuerte entre las diferentes pruebas TCR. Basado en esto, y en su expresión eficaz tanto en las células CD8 y CD4 T, se seleccionaron TCR-5 para una caracterización adicional.
La reactividad cruzada con otros miembros de la familia SSX y SSX proteínas no
La familia SSX comprende 10 genes que codifican proteínas que son altamente homólogas entre sí. En particular, el epítopo de SSX2 blanco de TCR-5 está dentro de una de las regiones de homología entre miembros de la familia. Como se muestra en la figura 3A, la secuencia de aminoácidos de SSX5 y SSX10 difieren de SSX2
41 a 49 en sólo un residuo; SSX1, SSX3, SSX4, SSX8 y SSX9 difieren de SSX2
41-49 en dos aminoácidos; y SSX6 y SSX7 difieren de SSX2
41-49 en tres aminoácidos. Además de SSX2, SSX3 y SSX5 se prevé que unirse a moléculas HLA-A2 con alta afinidad. Los péptidos derivados de SSX4, SSX7, SSX9 y SSX10 se predijo que se unen a HLA-A2 con menor afinidad. Reactividad de TCR-5 contra cada uno de estos péptidos se probó en experimentos de cocultivo con linfocitos humanos que expresan TCR-5 como efectores y células T2 pulsadas con péptidos como dianas, y la secreción de IFNg se evaluó como un marcador de reconocimiento de antígeno. Mientras TCR-5-células que expresan secretada IFNg tras la exposición a SSX2
41-49 a baja concentración de péptido (& gt; 0,01 ng /ml), reaccionaron a SSX3-, SSX4-, SSX5-, SSX9- y SSX10- péptidos derivados solamente cuando se expone a altas concentraciones de péptido (más de 10 ng de péptido /ml, figura 3 a). Esta diferencia en la reactividad de tres a cuatro órdenes de magnitud indica que TCR-5 es relativamente específico para SSX2
41 a 49, y sugiere que el reconocimiento de las células que expresan péptidos homólogos derivados de otros genes SSX puede ser poco probable.
las células T de sangre periférica que expresan TCR-5 se cocultured durante la noche con células T2 pulsadas con anterioridad las diluciones seriadas de los péptidos indicados. Resultados de la concentración de IFNg en los sobrenadantes de cultivo se expresan como media de duplicados en un experimento representativo. alineamiento de secuencias de los péptidos ensayados se muestra en la leyenda de la figura para A) los genes de la familia SSX-B) y no los genes SSX con secuencias superpuestas. IGSF22: miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas 22, ARHGAP1: Rho GTPasa de la proteína activadora 1, GPR82: Probable G-receptor acoplado a proteína 82, PHF8: histonas lisina desmetilasa PHF8, LIPM: lipasa miembro de M, SYT14: sinaptotagmina-14, TCOF1: proteína de jarabe de melaza, RBL2: proteína retinoblastoma 2 similar, FRAS1: la matriz extracelular de proteínas FRAS1. Predicción de la afinidad de unión a HLA-A2 * 0201 se muestra para cada péptido, expresada como constante de disociación (K
D, nM).
Nueve genes adicionales que codifican proteínas se identificaron mediante la explosión de búsqueda parcialmente homóloga a la SSX2
41-49 epítopo: IGSF22, ARHGAP1, GPR82, PHF8, LIPM, SYT14, TCOF1, RBL2 y FRAS1. Los péptidos solapantes en dos de estas proteínas, y IGSF22 TCOF1, diferían en sólo dos residuos de la epítopo SSX2 objetivo. Además, los péptidos derivados de SYT14 y TCOF1 se prevé que ser aglutinantes HLA-A2 fuertes y débiles, respectivamente (Figura 3B). Se analizó el reconocimiento de estos péptidos nonamer por TCR-5 en experimentos de cocultivo con células T2 pulsadas con péptido. Como se representa en la figura 3B, la liberación de IFNg inducida por SSX2
41-49 péptido era de dos a cuatro órdenes de magnitud superiores a la inducida por los péptidos homólogos, lo que confirma la especificidad de TCR-5.
La optimización de codones y murinization de TCR-5
a continuación se evaluó si la optimización del uso de codones en la secuencia de codificación de TCR-5 y /o el uso de los TCR híbridos humano-ratón podría mejorar TCR-5 expresión y /o actividad biológica . ADNc que codifica para la misma secuencia de aminoácidos como TCR-5 pero con una secuencia de nucleótidos optimizada para el uso de codones en los seres humanos se sintetizó y se clonó en pMSGV1 para la generación de vectores retrovirales. Del mismo modo, una versión con codones optimizados de TCR-5 en el que las regiones constantes de TCR se sustituyeron con la región constante de un TCR de ratón [23] se sintetizó y se clonó en pMSGV1. Las tres versiones de TCR-5 (WT, de codones optimizados, y de codones optimizados + región constante de ratón, figura 4A) fueron los siguientes en comparación en su expresión y la capacidad de reconocer el antígeno y mediar la lisis celular.
A) Representación esquemática de los tres constructos generados para la expresión de TCR-5 y derivados. LTR: repetición terminal larga, sd: donante de empalme, SA: aceptor de empalme, ψ: señal de encapsidación de retrovirus, MC: región constante de ratón TCR, 2A: péptido enlazador. B) Análisis de la expresión de TCR-5 variantes por tinción de tetrámero. linfocitos estimulados con OKT3 se transdujeron dos veces con el correspondiente vector TCR que expresan y se tiñeron con anti-CD3, anti-CD8 y SSX2
41-49 tetrámeros una semana después de la transducción. Los resultados representativos de tres experimentos independientes. Los valores entre paréntesis representan la intensidad media de fluorescencia de la tinción de tetrámero dentro de la población de células T CD8. C)
ensayo de liberación de 51Cr para la evaluación de la citolisis específica de antígeno inducida por los linfocitos TCR-5-transducidas después de co-cultivo de cuatro horas con las células objetivo indicadas. Porcentaje de lisis se muestra para cada línea de células diana en diferentes efector: diana es el promedio de los duplicados en un experimento representativo de tres experimentos independientes. UT: las células T no transducidas utilizadas como control negativo de la lisis no específica, WT: De tipo salvaje TCR, Co Op: copon optimizado TCR, MCR:. Codones optimizados TCR con la región constante de ratón
Después retroviral transducción de linfocitos humanos estimulados con OKT3, se usó la tinción de tetrámero para evaluar la expresión de los tres constructos. Como se muestra en la figura 4 B, la optimización de codones se incrementó la densidad de expresión en la membrana de TCR en células T CD8 como se evidencia por un aumento de la intensidad de fluorescencia media (MFI) de SSX2
41-49 tinción tetrámero en las células transducidas con el codón optimizado TCR-5 (910 unidades de fluorescencia), en comparación con los transducidas con la versión de tipo salvaje (656 unidades de fluorescencia). Sin embargo, el uso de una región constante murina, además de la optimización de codones aumentó sólo mínimamente la unión por el TCR (949 unidades de fluorescencia) tetrámero. La actividad biológica de los TCR se ensayó en experimentos de cocultivo en donde los linfocitos transducidos-TCR fueron expuestos a células diana * 0201-positivos múltiples HLA-A que fueron positivos para SSX2 (Cos-A2-SSX2, 293-A2-SSX2, K562- A2, 624, 938-A2 y U251). La concentración de IFNg en los sobrenadantes se midió por ELISA después de un cocultivo durante la noche y los resultados se muestran en la Tabla 2. Los linfocitos transducidos con la versión de codón optimizado de TCR-5 secretada, en promedio, 30% más que los IFNg transducidas con el de tipo salvaje TCR. La presencia de una región constante de TCR de ratón también aumentó la secreción de IFNg en comparación con la de tipo salvaje TCR, pero esta modificación no aumentó la secreción de la variante de IFNg codones optimizados (tabla 2). Las tres construcciones muestran propiedades similares en cuanto a la inducción de la proliferación específica de antígeno de las células T en ensayos de captación de timidina (figura S1A), la activación de células T a partir del reconocimiento de antígenos (evidenciado por la regulación del marcador de activación de CD137, figura S1B) y la interleucina 2 (IL-2) (figura S1C).
La inducción de la lisis celular de las células tumorales que expresan SSX2
La capacidad de cada variante de TCR-5 para inducir antígeno lisis celular específica de dianas de tumor por linfocitos humanos se determinó utilizando un ensayo de liberación de cromo. Cromo (
51Cr) marcado con 938, 938-A2, Cos-A2, Cos-A2-SSX2, 624, 888 y SKmel37 células se cocultivaron con las células T de sangre periférica humanas transducidas la de tipo salvaje TCR-5 o su codón ratios objetivo: -optimized o variantes murinized, en diferentes efector codones optimizados. células T no transducidas se utilizaron como control negativo. Como se representa en la figura 4 C, linfocitos transducidos con cualquiera de los SSX2 TCR
41-49-específicos inducidos efecto citolítico potente sobre 938-A2 células, pero no en células 938, lo que indica que la lisis es HLA-A * 0201-restringido. Además, las células Cos-A2-SSX2 se lisaron por TCR-5-expresión de las células, pero no Cos-A2, que carecen de expresión de SSX2, lo que indica que este efecto es específico de antígeno. Del mismo modo, 624 y SKmel37 células, que son HLA-A * 0201 SSX2 positivo y naturalmente expresa, se lisaron por los linfocitos transducidos con cualquiera de TCR-5 variante, mientras que * 0201-negativas 888 células HLA-A no lo eran. En conjunto, estos resultados confirman que las construcciones derivadas de TCR-5 son biológicamente funcional en células T de sangre periférica humana, y que se pueden utilizar para reorientar su especificidad de antígeno SSX2 que, en un HLA-A * 0201-manera específica. Ni la optimización de codones o murinization de TCR tenían un efecto sobre la lisis mediada por el TCR-5.
Desarrollo y ensayo de los sobrenadantes de vectores retrovirales de grado clínico
Debido al patrón-tumoral selectiva de la expresión de SSX2 , y las propiedades de reconocimiento de antígeno potentes aún selectivos de TCR-5, decidimos producir y probar los vectores retrovirales de grado clínico adecuadas para la expresión de TCR-5 en células T de sangre periférica de pacientes con cáncer. líneas de envasado estables fueron establecidas por transducción de las células PG13 con un vector retroviral que codifica la versión con codones optimizados de TCR-5. Después de dos transducciones, las células PG13 se clonaron por dilución limitante y los clones se ensayaron para determinar la expresión del ARN viral usando punto de parcelas (no mostrados). Los seis clones que expresan los niveles más altos de RNA vector (A8, A10, C3, D8, F2 y H2) se amplificaron y los sobrenadantes se ensayaron para determinar su capacidad para inducir la expresión de TCR en PBL estimuladas con OKT3 de tres donantes diferentes. tinción de tetrámeros de las células T transducidas reveló que los sobrenadantes de los seis clones mediadas transducción eficaz de linfocitos (Figura 5 A).