Extracto
Introducción
Se describe un novedoso modelo 3D co-cultivo utilizando no pequeñas líneas celulares de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) en combinación con fibroblastos de pulmón. Este modelo permite la investigación de las interacciones tumor-estroma y aborda la importancia de tener una mayor in vivo como modelo de cultivo celular.
Métodos
Automatización compatible con múltiples pocillos se utilizaron placas de microtitulación que cuelgan de gota para la producción de mono- 3D y co-cultivos. En estos colgante deja caer la A549 dos líneas celulares de cáncer y Colo699 fueron cultivadas ya sea solo o co-cultivadas con fibroblastos de pulmón. La viabilidad de esferoides tumorales se confirmó después de cinco y diez días mediante el uso de anexina V /yoduro de propidio tinción para citometría de flujo. formación de fibroblastos esferoide del tumor se caracteriza por microscopio electrónico de barrido (SEM), semi-delgadas secciones, microscopio de fluorescencia y la inmunohistoquímica (IHC). Además de la histología convencional, la expresión de proteínas de E-cadherina, vimentina, Ki67, fibronectina, citoqueratina 7 y actina de músculo liso α-(α-SMA) fue investigado por IHC.
Resultados
Bajo la viabilidad se observó en los monocultivos A549 en comparación con los co-cultivos, mientras que los monocultivos Colo699 mostraron una mejor viabilidad en comparación con los co-cultivos. expresión de Ki67 varió significativamente entre mono y co-cultivos en ambas líneas celulares tumorales. Un aumento de la vimentina y disminución de la expresión de E-cadherina podría ser detectado durante el curso del cultivo que sugiere una transición a un fenotipo más mesenquimal. Por otra parte, la línea celular de fibroblastos mostró una expresión de α-SMA sólo en co-cultivo con la línea A549 de células cancerosas, lo que indica un cambio mesenquimales a mesenquimales a un fenotipo más miofibroblastos.
Conclusión
nos demuestran que nuestro método es una herramienta prometedora para la generación de esferoides tumor co-cultivos. Además, estos esferoides permitir la investigación de las interacciones tumor-estroma y un mejor reflejo de las condiciones in vivo de las células cancerosas en su microambiente. Nuestro método tiene potencial para contribuir al desarrollo de agentes anticancerígenos y apoyar la búsqueda de biomarcadores
Visto:. Un Amann, Zwierzina M, Gamerith G, H Bitsche, Huber JM, Vogel GF, et al. (2014) Desarrollo de un sistema de cultivo celular 3D innovador para el Estudio de Tumores - Stroma Interacciones de células no pequeñas células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (3): e92511. doi: 10.1371 /journal.pone.0092511
Editor: Donald Gullberg, Universidad de Bergen, Noruega
Recibido: 3 Junio, 2013; Aceptado: February 24, 2014; Publicado: 24 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Amann et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por medio de una beca de doctorado de la Sociedad austríaca de Hematología y Oncología (OeGHO) y más apoyo financiero de la Verein für Tumorfoschung. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. En cuanto a Insphero (J. Kelm) y el affilation al trabajo de los autores: Este autor contribuyó con su larga experiencia en el cultivo de células en 3D para este artículo. Por otra parte, los autores recibieron el apoyo de la empresa en forma de placas de cultivo celular 3D para sus experimentos. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
Debido a la creciente comprensión de los mecanismos relacionados con la génesis del cáncer, somos experimentando una transición de la enfermedad para apuntar terapia orientada. Como consecuencia, el futuro de la terapia dirigida molecular del cáncer se encuentra en la identificación de subgrupos de pacientes que se benefician de las terapias particulares que golpean estructuras específicas expresadas por la célula maligna. Un obstáculo importante para el desarrollo de estos regímenes terapéuticos individualizados, sin embargo, es la limitada disponibilidad de modelos predictivos in vitro. El reto fundamental es el desarrollo de modelos de cultivo celular que refleje mejor las condiciones in vivo y apoyando así la investigación de biomarcadores predictivos que tienen el potencial de aumentar el valor de medicamentos para el cáncer y la reducción de las tasas de tamaño, el costo y el fracaso de los ensayos clínicos.
cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) es una de las principales causas de muerte por cáncer en pacientes hombres y mujeres en todo el mundo.
Sólo el 15% -20% de ellos son diagnosticados en una etapa temprana [1] . El pronóstico sigue siendo pobre con una tasa de supervivencia a 5 años que van desde aproximadamente el 60% para la etapa I a menos del 5% de los tumores en estadio IV [2].
Los pacientes diagnosticados con enfermedad localmente avanzada requieren tratamiento multimodal para alcanzar a largo -term remisión o incluso curar mientras que los pacientes con enfermedad metastásica reciben quimioterapia basada en platino, ya sea solo o en combinación con inhibidores de EGFR o alc [3] - [5].
Muchos otros agentes moleculares dirigidas han sido probados en clínica ensayos, pero no lograron mostrar un beneficio para los pacientes con respecto a la supervivencia libre de progresión y la supervivencia global [6]. Varios de estos ensayos encaminados para definir biomarcadores de manera prospectiva o retrospectiva, pero sólo un número muy limitado se han identificado [7], [8].
ensayos basados en células hasta el momento para explorar la biología celular y la eficacia de los medicamentos dirigida a las células que crecen en las superficies de plástico de dos dimensiones o en suspensión de células individuales [4]. La biología de las células, sin embargo, ser profundamente influenciado por su micro-entorno requiere ensayos basados en células que reflejan los efectos de factores tales como la matriz extracelular (ECM), contactos célula-célula, las interacciones célula-matriz, la polaridad celular y los perfiles de oxígeno [ ,,,0],5] - [8].
convencional dos sistemas bidimensionales (2D) de cultivo de células cultivadas en superficies plásticas artificiales tienen importantes limitaciones. Por ejemplo, se requieren altas concentraciones no fisiológicas de suero de ternera fetal (FCS) y realimentación por el cambio de medio cada 2-3 días. En contraste con esto, las técnicas de 3D evitar superficies de plástico permitiendo que las células para formar su ECM y requieren redujeron significativamente las concentraciones de FCS. No sólo la morfología celular, sino también la sensibilidad a fármacos de las células cancerosas en los sistemas 2D es diferente en comparación con los cultivos de células en 3D [9], [15]. Las células cultivadas en las superficies de plástico por lo general presentan una mayor sensibilidad a los fármacos citotóxicos, mientras que los compuestos de orientación celular - adhesiones celulares, la maduración celular, epitelio-mesenquimal transición (EMT) y características stemness a menudo muestran una disminución de la eficacia en cultivo de células 3D. Por lo tanto los modelos de cultivo celular 3D reflejan en el crecimiento tumoral in vivo de manera más fiable y puede proporcionar una mejor leer las salidas para el análisis de drogas [9], [15], [10].
La mayoría de los sistemas 3D utilizar agregados de esferoides de células y sistemas de cultivo andamio . Estos sistemas soportan el crecimiento de células en 3D por homólogos producidos artificialmente extracelulares (por ejemplo, colágeno, matrigel, andamios) que facilitan la adhesión celular y agregación. Otros sistemas 3D utilizan tecnologías de superposición de líquidos, meshwork fibras hechas de polímeros biocompatibles, perlas sólidas o porosas o matrices extracelulares y sus sustitutos y requieren la adición de suplementos producidos artificialmente para lograr 3D cultivos de células en crecimiento [16] - [19].
La técnica de gota colgante es un método de cultivo celular bien establecido para formar microtejidos esféricas a partir de líneas de células primarias inmortalizadas y [20] - [22]. En contraste con la mayoría de las tecnologías de superposición de líquidos, el método de la gota colgante permite el control preciso de la composición de células inicial en cada microtejidos [23], [24]. Para generar multi-célula microtejidos tipo de co-cultivo ni suplementos adicionales ni andamios artificiales que imitan los componentes de la matriz extracelular (por ejemplo, colágeno matrigel) son obligatorios.
Sobre la base de una automatización y rendimiento de alta tecnología compatible colgando gota que estableció un organotípicos modelos de co-cultivo componen de dos líneas diferentes de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) de células en combinación con fibroblastos de pulmón. Este método permite no sólo la investigación de interacciones tumor-estroma y representa un vivo en más como modelo de cultivo celular en 3D para estudiar las interacciones de drogas tumorales pero también se puede implementar en futuras campañas de descubrimiento de fármacos.
Materiales y Métodos
cultivo de células
el CPNM líneas celulares A549 y Colo699 (DSMZ, ACC107, ACC196) y la línea celular de fibroblastos de pulmón SV-80 (CLS, 300345) se utilizaron para nuestros experimentos. Para el cultivo 2D, las líneas celulares se cultivaron como monocapa en DMEM bajo de glucosa (PAA, Pasching, Austria) suplementado con 10% FCS (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania, Lot 010M3396) y 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina solución, 2 mM L-glutamina (PAA). Las células fueron cultivadas a 37 ° C en un humidificado 5% de CO
2-atmósfera que contiene.
cultivo celular 3D
Para la producción de 3D mono y co-cultivos GravityPLUS ™ microtejidos se utilizó el sistema de cultivo (InSphero AG, Zürich, Suiza). La placa consiste en un marco con 8 × 12 insertos así y un canal periférico lleno de 2-3 ml de agua estéril para proporcionar una barrera de humedad que reduce la evaporación del medio de las gotas. Este marco se coloca en una parte inferior de la bandeja que se llena con 5 ml 0,2 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) (PAA) con 0,1% Triton X-100 (Sigma), de nuevo para reducir la evaporación de las gotitas. El pozo se divide en tres elementos, (i) el de entrada en la que se colocan directamente las puntas de pipeta en la superficie del pozo, (ii) el compartimiento de cultivo y (iii) un microcanal conecta la entrada y el compartimento de la cultura. Cada pozo es cargado por resorte para compensar cualquier ligera variación en alturas de punta de la cabeza de pipeta de 96 pocillos.
Después de las células habían crecido subconfluently en placas de cultivo celular (Falcon) que fueron sembradas en las gotas para los colgantes. Luego, las células se lavaron una vez con PBS y se digirieron con 1 × Accutase (PAA) durante diez minutos a 37 ° C. A continuación, la digestión se detuvo y las células se lavaron una vez con 20 ml de medio de cultivo celular. A continuación, se contaron y se sembraron en 40 gotas l en diversos recuentos de células (células Monocultivos: SV-80 y A549: 2500 células /l 40; Colo699: 1250 células /l; 40 co-cultivos: el carcinoma de células de fibroblastos relación: 1:02 /40 l). intercambio de medio se realizó cada cuatro días y se cosecharon los esferoides después de cinco y diez días por la carga de 100 l de PBS (PAA) en los Microcapilares para ahuyentar a los esferoides. Las gotas que caen contienen los esferoides se recogieron con una placa de 96 pocillos de fondo en U (Falcon) que se coloca debajo de la placa microcapilar.
tinción CFSE de los fibroblastos.
Para el marcaje fluorescente de los fibroblastos el Kit de la proliferación de células CellTrace ™ CFSE (Molecular Probes, Invitrogen) se utilizó. Los fibroblastos se disolvieron y se ajustaron a 1 × 106 en 1 ml de /0,1% de albúmina de suero bovino PBS se añadió (BSA) .CFSE solución para lograr una concentración de trabajo final de 10 mM. Las células se incubaron entonces durante 10 minutos a 37 ° C. Después, la tinción se interrumpió con cinco volúmenes de hielo medio de cultivo celular frío y se incubó durante 5 minutos en hielo. Luego, las células se lavaron tres veces con medio de cultivo celular. Los fibroblastos marcados fueron sembradas ahora como co-cultivos con células de carcinoma como se describe en la sección de cultivo de células en 3D.
citometría de flujo
Ocho microtejidos, cosechados en placas de 96 pocillos se transfirieron a 5 ml tubos FACS (Falcon) y se lavó una vez con 2 ml de PBS. Después, microtejidos se solubilizaron en suspensión de células individuales mediante la adición de 300 l Accumax (Miltenyi Biotech) por microtejidos incubarlos durante 20 minutos a 37 ° C. Después de diez minutos microtejidos se mezclaron y con pipeta hacia arriba y abajo para obtener una solución homogen. Este procedimiento se repitió después de 20 minutos de incubación. Ahora, la digestión se detuvo con 2 ml de medio de cultivo celular completo, a continuación, las células se centrifugaron a 300 g durante diez minutos y se lavaron dos veces con 0,5% de BSA /PBS. Después, las células se tiñeron con yoduro de propidio 4 l de solución (PI) tinción y 4 l de anexina V APC. La tinción se realizó en 100 Anexina l tampón de unión tomada del kit de detección de apoptosis anexina V I (Becton Dickinson) durante 15 minutos. Por último, se analizaron las células en un BD FACS Calibur inmediatamente. Cada medición de datos se compone de ocho microtejidos agrupados, siguiendo todo el proceso de forma independiente en tres ocasiones.
El cálculo del volumen de microtejidos
Seis microtejidos de mono y co-cultivos fueron evaluados por una luz invertida microscopio (Motic AE31) desde el primer día hasta diez. Después de cinco, siete y diez días, se midieron dos diámetros (d) de cada microtejidos y el volumen se calculó mediante la fórmula V = 4/3 * Π * r
3, donde r = ½ * √ d1 * d2 [ ,,,0],25]. medición de volumen se repitió tres veces. A partir de entonces, la media y la desviación estándar se calcula y se probó la significación estadística con la prueba t de estudiante en Microsoft Excel.
análisis inmunohistoquímico
Preparación de la muestra.
microtejidos se aclararon en PBS y luego fija inmediatamente por inmersión en frío 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS, durante cuatro horas a temperatura ambiente. Microtejidos se aclararon en PBS de nuevo y embebidos en 2% de agarosa (Invitrogen). El exceso de agarosa se eliminó con un bisturí, y los bloques de agarosa que contienen los microtejidos se deshidrataron en alcoholes graduados y se incluyeron en parafina (Paraplast regular, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) Un microtomo Microm ERGO estrella giratoria (Microm, Walldorf, Alemania) se utilizó para tomar las secciones de serie de 4 micras de espesor. Se montaron a continuación una serie de tres a cuatro de las secciones parafinadas en un patrón serpenteante en SuperFrost Plus diapositivas (Menzel-Gläser, Braunschweig, Alemania) y se secó durante la noche, a continuación se coció a 60 ° C durante una hora para adherir las secciones firmemente a los portaobjetos. Para la orientación cito-arquitectura, cada décima tobogán fue hematoxilina /eosina (HE) utilizando un Shandon Varistain 24-4 Slide Stainer (Histocom Viena, Austria).
antisueros.
Hosts, diluciones , los tiempos de incubación y las fuentes de anticuerpos primarios, así como la recuperación de epítopo inducida por calor (HIER) se enumeran en la Tabla 1.
inmunocitoquímica
La inmunocitoquímica se llevó a cabo en 4 secciones de micras microtejidos parafina embebido en una Ventana Roche descubrimiento Immunostainer (Mannheim, Alemania) de acuerdo con la DAB-MAP procedimiento estándar de investigación de descubrimiento. Si es necesario, la recuperación de antígeno se inició por desenmascaramiento inducida por calor de los epítopos mientras que los portaobjetos se sumergieron en conformidad con las instrucciones del fabricante (cortos o estándar para diferentes tiempos de incubación) en tampón de EDTA (Cell acondicionado CC1 Solution, Ventana). Después de la incubación de las secciones con los anticuerpos primarios (enumerados en la Tabla 1.) a 37 ° C, un cóctel de inmunoglobulina biotinilada de cabra anti-IgG de ratón, de cabra anti-IgM de ratón, IgG de cabra anti-conejo y el bloque de proteína (Descubrimiento de anticuerpos universal , Ventana) se aplicó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La detección se logró utilizando el kit de detección DAB-MAP (Ventana) de acuerdo con el método de desarrollo de diaminobencidina (DAB). Las secciones fueron finalmente contraste con hematoxilina (Ventana) durante cuatro minutos. Posteriormente, las secciones se deshidrataron manualmente en la serie del alcohol rebajado, limpiaron en xileno y se deslizaron cubierta permanentemente con Entellan® (Merck, Darmstadt, Alemania).
Las imágenes digitales de HE- y immunostained diapositivas fueron adquiridas en el software AxioVision microscopio vinculado a una cámara de color AxioCam HRc y un axioplan 2 microscopio (Zeiss, Jena, Alemania).
Ki67 positividad se determinó contando Ki67 núcleos de células positivas y negativas en tres diferentes esferoides de A540 y Colo699 en mono y co culturas de manera representativa. Después de esto, se calculó el porcentaje de núcleos de células positivas a número de células enteras. La media y la desviación estándar y la significación estadística se calculó como se ha descrito antes.
microscopio de fluorescencia
microtejidos en mono y co-cultivos se cosecharon como se describió anteriormente y se lavan una vez con PBS. Después, microtejidos tumorales se fijaron con PFA al 4% durante dos horas a 4 ° C y se lavaron tres veces con PBS. Ahora, se bloquearon mediante incubación con PBS que contenía BSA 2% (Sigma) /0,3% de Triton X-100 (Roche) durante una hora a temperatura ambiente. Microtejidos se incubaron a continuación 40 minutos con 50 g /ml faloidina Atto 633 (Sigma) a temperatura ambiente en la oscuridad. A partir de entonces, se lavaron de nuevo cinco veces con PBS y después se incubaron cinco minutos con 1,5 g /ml DAPI (Invitrogen) a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de lavar una vez con PBS microtejidos fueron llevados a un tobogán de objeto con medio de montaje fluorescente (Dako Glostrup, Dinamarca) y se analizaron en un LSM 510 Meta Microscopio Confocal (Zeiss).
Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)
microtejidos tumorales se fijaron con 2,5% de glutaraldehído (Fluka Biochemika) en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4). Después de un breve lavado en PBS, seguido de post-fijación durante una hora con tetróxido de osmio 1% acuosa (ReagentPlus; Sigma-Aldrich), las muestras fueron gradualmente deshidratados con etanol. Después de secar (CPD 030, Bal-Tec), microtejidos fueron montados en los trozos de aluminio con cinta adhesiva de doble cara, revestido por bombardeo iónico con 10 nm de oro /paladio (Au /Pd) (Bal-Tec) y se examinaron con un campo de emisión microscopio electrónico de barrido (Gemini 982; Zeiss, Göttingen, Alemania).
Semi-secciones delgadas
microtejidos tumorales fueron procesadas de acuerdo a la técnica estándar para microscopía electrónica de transmisión. Microtejidos se fijaron en fijador de Karnovsky (2,5% de glutaraldehído y 2% de paraformaldehído en tampón de cacodilato 0,1 M) durante la noche y después se lavaron tres veces (10 minutos cada uno) en tampón de cacodilato 0,1 M, seguido de fijación con 1% de tetróxido de osmio en tampón cacodilato 0,05 M a 4 ° C durante 1 hora. El exceso de tetraóxido de osmio se eliminó por enjuague los microtejidos tres veces (10 minutos cada uno) en tampón de cacodilato 0,1 M. Microtejidos fueron deshidratados con etanol (2 × 70% de etanol cada 30 minutos, 2 × 96% de etanol cada 30 minutos, 2 × 100% de etanol cada 30 minutos) y acetona (2 x cada 30 minutos) antes de la incubación en una dilución de resina epoxi líquida (Epon mezcla de medio: 20 ml empotrar-812, 16 ml DDSA, 8 ml NMA y 1,2 ml; BDMA Electron Microscopy Sciences, Munich, Alemania) y acetona en una proporción de 30% a 70% durante tres horas. Los microtejidos se infiltraron con una mezcla de Epon y acetona en partes iguales a 4 ° C durante la noche en viales cerrados. El día siguiente, el líquido fue sustituido por una mezcla de resina epoxi 70% y 30% de acetona durante tres horas. Posteriormente, microtejidos se incubaron dos veces en 100% Epon (3 horas y a 4 ° C durante la noche). Entonces, la resina de epoxi pura fue cambiada, y las microtejidos se infiltró con Epon en una cámara de vacío durante 2 horas. Microtejidos se transfirieron después a un molde de inclusión, etiquetados, y se colocan en una cámara de vacío durante 1 hora adicional. Microtejidos se transfirieron a una cámara de incubación a 60 ° C durante 48 horas para aumentar la polimerización de la resina epoxi. secciones de un micrómetro se cortaron con un microtomo Leica Ultracut, se tiñeron con azul de toluidina a 60 ° C, y luego se examinan con un microscopio óptico.
Resultados
formación de tumor microtejidos
en un primer momento, se determinó la disposición de las células tumorales y fibroblastos en esferoides durante el período de cultivo. Para este propósito SEM imágenes (figura 1) de A549 y Colo699 mono y co-cultivos fueron tomadas después de diez días de cultivo. Además, A549 /Colo699 mono y co-cultivos se prepararon para la semi-delgadas secciones y se tiñeron con azul de toluidina (figura 2)
Se tomaron imágenes de SEM después de diez días:. Monocultivos de A549 y SV80 se sembraron en una proporción de 2500 células /40 l, mientras que los monocultivos Colo699 se cultivaron en forma de 1250 células /40 l. Todos los co-cultivos se sembraron en una célula de carcinoma: relación de fibroblastos de 01:02 /40 l (A549 co-cultivos: 2500 +5000 células de cáncer de fibroblastos /Colo699 co-cultivos: 1250 +2500 células de cáncer de fibroblastos). (A /B) monocultivos A549, (C /D) A549 co-cultivos; (E /F), los monocultivos Colo699 (G /H) Colo699 co-cultivos; (J /I) monocultivos SV80. Todos los co-cultivos muestran una superficie más homogénea y más redondo microtejidos en comparación con los monocultivos.
semi-delgadas secciones (1 m) de rebanadas A549 /Colo699 mono y co-cultivos después de diez días de cultivo se tiñeron con toluidina. Bar en todas las imágenes: 20 micras. células A549 forman esferoides resistentes se asemeja a un tejido más de varias capas y presentan una superficie áspera. monocultivos Colo699 revelan una estructura esferoidal con una superficie suelta. Cuando se añaden fibroblastos ambas líneas celulares construir un microtejidos más compacto con una superficie regular.
Como se muestra en las imágenes SEM y delgadas secciones, las células A549 forman esferoides escarpadas se asemeja a un tejido más multi-capas y muestran una superficie áspera. Después de cinco días no habían microtejidos completamente formado y consiguieron fácilmente perturbado durante el procedimiento de recolección. Por el contrario, cuando se utiliza en co-cultivo estas células forman esferoides apretados con superficies lisas. En las secciones semifinas fibroblastos pueden ser detectados como células que tienen una morfología plana dispuesta principalmente cerca de la superficie de las microtejidos.
Durante el curso de los monocultivos Colo699 de cultivo revelan una estructura esferoidal con una superficie suelta. Cuando se añaden fibroblastos estos esferoides construir un esferoide más compacto con una superficie regular. Como todas las células tenían la misma morfología, sin embargo, las células tumorales y fibroblastos podrían no ser discriminado en las secciones semifinas.
A diferencia de las líneas celulares de cáncer, los fibroblastos SV80 forman pequeños esferoides apretado que mira con una superficie lisa cuando se cultiva sola .
Como todos los co-cultivos mostraron una superficie más homogénea con una arquitectura cerrada, decidimos examinar si esto depende de la producción de ECM de las células. En la figura 3 se demuestra que las células SV80 están produciendo significativamente fibronectina cuando se cultiva por su cuenta, mientras que los dos monocultivos de células tumorales fueron completamente negativas para la fibronectina. En Colo699 co-cultivos de ECM se distribuye uniformemente a lo largo de toda la microtejidos. Sin embargo, en A549 co-cultivos fibronectina fue secretada principalmente por las células que construyen el anillo como la estructura alrededor del núcleo interno de la microtejidos.
fibronectina se muestra en microtejidos después de diez días. (Bar en monocultivos A549 /SV80: 50 m, bar en todas las otras microtejidos: 100 m); La secreción de fibronectina se pudo observar en microtejidos que contienen fibroblastos, mientras que en los monocultivos de células tumorales no se pudo detectar la secreción de fibronectina.
Curva de crecimiento y la estabilidad de microtejidos tumorales
Tres microtejidos de mono . - y co-cultivos fueron evaluados por microscopio de luz y después de cinco, siete y diez días microtejidos se calcularon los volúmenes (figura 4A)
R: microtejidos volúmenes se calcularon por la fórmula V = 4/3 * * Π r3, donde r = ½ * √ d1 * d2. volúmenes medios se muestran en μm3 con sus desviaciones estándar correspondientes. B: Media y desviación estándar de Ki67 positividad se calculó contando Ki67 núcleos de células positivas y negativas sobre rebanadas de tres esferoides diferentes de manera representativa. Después de esto, se calculó el porcentaje de núcleos de células positivas a cumber célula entera. Co-cultivo de las dos líneas celulares tumorales con una línea celular de fibroblastos dio lugar a una regulación positiva significativa (p & lt; 0,05). Ki67 de expresión en todos los microtejidos
No fue posible calcular los volúmenes de esferoides microtejidos A549 debido a que en los monocultivos de estas células no formaron redonda o elipsoidales esferoides forma. El mismo problema se desarrolló con los A549 co-cultivos que sólo empezaron a formar esferoides ronda medibles después de cinco días. Por lo tanto, la primera cálculo de volumen A549 co-cultivo se realiza en el día siete, donde un volumen de 63 m
3 se midió. Durante el curso de tres días el volumen de esta co-cultivo aumentó a 81 m
3.
monocultivos Colo699 muestran un aumento continuo en el volumen de 43 m
3 a 83 micras f
3. Por el contrario, Colo699 co-cultivos mostraron un volumen de 74 m
3 después de cinco días con una disminución en el volumen a 39 m
3
.
En los monocultivos SV80 un volumen constante de 33 m
3 después de cinco días a 27 m
3 pudieron observarse después de diez días.
por último, los volúmenes microtejidos se compararon entre sí con la prueba t de estudiante. Después de diez días un aumento significativo del volumen podría ser medida en A549 co-cultivos y monocultivos Colo699 en comparación con cualquiera de los monocultivos de SV80 o Colo699 co-cultivos. Por otra parte, después de cinco días, el volumen de Colo699 co-cultivos fueron significativamente mayores en comparación con los monocultivos y Colo699 SV80 (figura 4A).
Para investigar la viabilidad celular, un APC Anexina V y yoduro de propidio (PI se estableció) FACS ensayo. células SV80 fueron incubadas con CFSE antes de la siembra, por lo tanto la viabilidad de las células cancerosas y los fibroblastos se pudo medir de forma independiente por la discriminación en el análisis FACS. Se recogieron microtejidos, se digirió con Accumax y se incubaron con PI y Anexina V APC. Los análisis se realizaron en un sistema BD FACS Calibur. Cada barra representa la viabilidad celular media de 24 microtejidos diferentes medidas en tres carreras independientes. Para la evaluación estadística se utilizó la prueba t de Student (figura 5).
Los fibroblastos fueron incubadas con CFSE antes de sembrarlas inicialmente junto con las células tumorales en las gotas para los colgantes. La apoptosis se midió ya sea después de cinco o diez días. Cada barra representa la viabilidad celular media de 24 esferoides y su correspondiente desviación estándar que se mide en dos carreras diferentes (diferencias significativas están marcados con *, p & lt; 0,05). transferencias de puntos representan el análisis FACS de una carrera que contiene células A549 en cocultivo con fibroblastos SV80 después de diez días de cultivo. se muestran la viabilidad específico de células cancerosas en mono-y co-cultivos: A. B: la viabilidad de los fibroblastos en solitario mono-y co-cultivos se muestran. C: Se muestra la distribución entre los fibroblastos y las células tumorales después de cinco y diez días. D: Toda la viabilidad microtejidos se muestra después de cinco y diez días
monocultivos A549 muestra 77% de células viables después de cinco días, con un aumento mínimo de viabilidad después de diez días a 79%.. Los co-cultivos con fibroblastos mostraron un aumento significativo en la viabilidad de 60% después de cinco días a 79% después de diez días. células Colo699 muestran 93% de células viables después de cinco días sin disminución de la viabilidad a 92% después de diez días. En co-cultivos 82% de células viables persistió después de cinco días y 76% después de diez días. Cuando se analizó la viabilidad de las células SV80, se demostró un aumento menor del 65% después de cinco días a 67% después de diez días. Sin embargo, una disminución significativa en la viabilidad de los monocultivos Colo699 a Colo699 co-cultivos se pudo observar (figura 5D).
Como paso siguiente, la viabilidad de las dos fracciones diferentes, las células tumorales y los fibroblastos se analizaron por discriminar ellos por citometría de flujo. células de cáncer de A549 en los co-cultivos permanecieron viables a lo largo de la incubación con una viabilidad de 74% después de cinco días y 71% después de diez días. En Colo699 co-cultivos un aumento de la viabilidad se pudo observar a partir de 78% después de cinco a 89% después de diez días, que muestra una significativamente mejor viabilidad, en comparación con las células cancerosas A549 co-cultivadas después de diez días (Figura 5A).
Una observación similar se hizo con respecto a la viabilidad de los fibroblastos en las microtejidos. Cuando se co-cultivan junto con las células cancerosas A549, células SV80 mostraron una regulación al alza significativa en la viabilidad de 46% después de cinco días a 71% después de diez días. En los co-cultivos Colo699 la viabilidad también aumentó, pero no varía significativamente entre 70% después de cinco a 83% después de diez días. Al mismo tiempo, una mejor viabilidad significativa para los fibroblastos cuando se co-cultivan junto con células Colo699 después de cinco días se pudo mostrar en comparación con A540 co-cultivos (figura 5B).
Además, la relación entre los fibroblastos y las células tumorales en co-cultivos se analizó después de cinco y diez días. Cuando co-cultivos se hicieron crecer en la gota colgante, las células cancerosas y fibroblastos siempre se sembraron en una relación de 1:2 (2.500 células de cáncer /5000 fibroblastos). Después de cinco días en ambos co-cultivos se pudo observar una distribución casi uniforme entre los fibroblastos y las células cancerosas, que varía de 43% fibroblastos a las células tumorales 57% en el A549 co-cultivos y 49% a 51% en los co-cultivos Colo699. Sin embargo, se podrían mostrar después de diez días significativamente más células tumorales que los fibroblastos en ambos co-cultivos. En A549 co-cultivos, 19% y en co-cultivos Colo699 14% de todas las células fueron identificados como los fibroblastos (figura 5C).
organización celular y la proteína patrón de expresión
Después de incubar A549 y células Colo699 solos o en cocultivo con fibroblastos de cinco y diez días, los análisis inmunohistoquímicos se realizaron (figura 5-7 /tabla 2). La vimentina fue elegido como una proteína que indica un cambio a un fenotipo mesenquimal en las células epiteliales. α-SMA expresión indica un fenotipo mesenquimal aún más de los fibroblastos y refleja un mesenquimales a la transición mesenquimal. E-cadherina, una proteína de adhesión de células epiteliales se eligió como un marcador para las células adherentes y Ki67 como la proliferación celular y marcador de activación. Tres diferentes esferoides fueron analizados para cada tinción de proteínas y rodajas consecutivos de un esferoide se muestra de manera representativa aquí (figura 7-9)
(A) Colo699 monocultivos después de diez días.; (B) Colo699 co-cultivos después de diez días; DAPI (azul) se utilizó para la tinción de los núcleos celulares, faloidina Atto 633 (rojo) para la visualización de F-actina y CFSE (verde) como una mancha citoplasmática de fibroblastos (Bar en A /B: 50 micras). Los fibroblastos todavía podían ser detectados en microtejidos tras cinco días de co-cultivo con Colo699
IHC rebanadas de A549 en mono y co-cultivos después de cinco y diez días (Bar en la EA:. 100 micras, bar en Insertar: 25 micras); un aumento de la vimentina y una disminución simultánea en E-cadherina se muestra en co-cultivos. También se detectó una regulación al alza de la expresión de Ki67 en co-cultivos
rebanadas de IHC Colo699 en mono y co-cultivos después de cinco y diez días (Bar en A /C:. 50 micras, Bar en B /D: 100 m, en la barra de inserción: 25 micras); En comparación con los monocultivos Colo699 co-cultivos formaron esferoides mucho más pequeñas. Sin embargo, las reacciones de tinción positiva para E-cadherina y vimentina son comparables a los monocultivos en el plazo de diez días. después de diez días porque no se detectó ninguna diferencia en el patrón de tinción entre cinco y diez días. Microtejidos eran completamente positivas para vimentina y Ki67, mientras que no se observó la expresión de E-cadherina y α-SMA
IHC rebanadas de SV80 en monocultivos después de diez días (Bar en R: 100 micras).;