Extracto
células de cáncer cervical presentan una mayor necesidad de ubiquitina que dependen de la degradación de la proteína asociada a una tasa de recambio metabólico elevado, y de las vías de señalización específicas, particularmente VPH degradación de las proteínas p53 y PDZ E6-dirigida. Los compuestos naturales con propiedades antioxidantes que incluyen flavonoides y triterpenoides son prometedores como agentes contra el cáncer al interferir con la degradación de la proteína ubiquitina-dependiente. Un creciente cuerpo de evidencia indica que su sistema carbonilo insaturado α-β es el factor determinante molecular para la inhibición de la degradación mediada por ubiquitina-proteína de aguas arriba de los sitios catalíticos del proteasoma 20S. En este documento se presenta la identificación y caracterización de una nueva clase de inhibidores químicos a base de chalconas, potentes y permeable a las células de la degradación de proteínas dependiente de ubiquitina y un RAMB1 compuesto de plomo. RAMB1 inhibe la degradación de proteínas dependiente de ubiquitina sin comprometer las actividades catalíticas del proteasoma 20S, un mecanismo distinto del de Bortezomib. El tratamiento de células de cáncer cervical con RAMB1 desencadena respuestas de proteínas no plegadas, incluyendo la formación y estabilización aggresome Hsp90, y aumenta los niveles de p53 constante estado. los resultados del tratamiento RAMB1 en la activación de las vías de degradación lisosomal dependiente como un mecanismo para compensar el aumento de los niveles de poli-ubiquitina enriquecida agregados tóxicos. Es importante destacar que, RAMB1 provoca sinérgicamente la muerte celular de células de cáncer cervical cuando se combina con el inhibidor de lisosoma cloroquina
Visto:. Anchoori RK, Khan SR, Sueblinvong T, Felthauser A, Iizuka Y, Gavioli R, et al. (2011) Destacando el sistema ubiquitina-proteasoma 20S sin células proteolítica La inhibición selectiva Muertes cáncer cervical. PLoS ONE 6 (8): e23888. doi: 10.1371 /journal.pone.0023888
Editor: Zhang Lin, de la Universidad de Pennsylvania School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de junio de 2011; Aceptado: July 29, 2011; Publicado: 31 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Anchoori et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud de ATIP y de las esporas en el cuello del útero CA098252 P50 cáncer de SRK, RKA y RBSR y HERA fundación (Salud, Empoderamiento, Investigación, y la conciencia) y el Departamento de Defensa Programa de Investigación del cáncer de Ovario (OCRP) OC093424 de MB. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
dependiente de ubiquitina degradación de la proteína a través del sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) es crucial para la regulación de muchos procesos celulares, incluyendo la progresión del ciclo celular, la diferenciación y la apoptosis tanto en las células normales y cancerosas [1]. La expresión aberrante de los componentes del sistema de UPS incluyendo ubiquitina ligasas, enzimas-de ubiquitinating y proteasomas se ha informado en varias configuraciones de cáncer, incluyendo el cáncer de cuello uterino [1], [2], [3], lo que sugiere que con el fin de mantener sus niveles más altos de las células cancerosas actividad metabólica dependen más de la función apropiada de la UPS en comparación con su contraparte normal [4], [5], [6], [7]. De este modo, las moléculas capaces de interferir con la degradación de proteínas dependiente de ubiquitina, incluyendo bortezomib, muestran actividad contra el cáncer [5]. Virus del Papiloma Humano (VPH) es la causa principal de cáncer cervical y responsable del 5% de todos los cánceres en todo el mundo [8]. Aunque las vacunas contra el VPH puede ser una medida preventiva eficaz contra el cáncer de cuello de útero, actualmente no existen tratamientos específicos para el virus de la misma, y la eficacia de la cirugía y la quimioterapia estándar /radioterapias está limitado para la enfermedad avanzada [9]. La expresión de dos oncogenes virales, E6 y E7, es necesaria para la inducción y mantenimiento del fenotipo transformado [10]. El E6 ejerce oncoproteína su actividad oncogénica mediante la unión al E3 ubiquitina ligasa E6-AP y redirige su actividad hacia p53 y otras proteínas supresoras de tumor para su rápida degradación mediada por ubiquitina proteasomal [11], [12], [13]. Esto reduce el nivel de este regulador del ciclo celular celular clave sin su mutación. Por lo tanto, la hipótesis de que la estabilización de p53 a través de la prevención de su degradación mediada por ubiquitina tendrá un potencial terapéutico para el cáncer de cuello de útero y posiblemente de otros cánceres de tipo salvaje de p53.
Los compuestos naturales de los flavonoides y triterpenos familias incluyendo la curcumina, celastrol, polifenoles de té verde y chalconas se han mostrado prometedoras como agentes antineoplásicos en una variedad de entornos de cáncer incluyendo cervical [14], colon [15], [16], del esófago [17], de páncreas [18] y de próstata [19], [ ,,,0],20], [21] el cáncer, relacionado con propiedades pro-apoptóticas como se asocia con la inhibición proteasomal. Recientemente hemos demostrado que las chalcona-derivados que contienen sustituciones de aminoácidos individuales en su estructura actúan como inhibidores del proteasoma y que la naturaleza de la porción aminoacídica determina su selectividad hacia las diferentes actividades catalíticas del proteasoma 20S [14]. Sin embargo, otros hallazgos sugieren que las moléculas de chalcona pueden contener dentro de su sistema carbonilo insaturado α- el determinante molecular para la inhibición de la ubiquitina mediada por la degradación de proteínas aguas arriba de la proteasoma 20S [22], [23], [24], [25].
Se presenta por primera vez que una serie de chalcona-derivados que carecen de componentes aminoacídicos, aquí denominado RAMBs, son el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) -stressors través de la inhibición de la degradación mediada por ubiquitina-proteína de aguas arriba del 20S proteasomal actividades catalíticas . Específicamente, nuestros compuestos RAMBs son capaces de la destrucción selectiva de células de cáncer cervical a través de acumulación de la proteína poli-ubiquitinated seguido por la activación de las respuestas de la proteína desplegada incluyendo la formación y la estabilización aggresome Hsp90. Además, esta acumulación de proteínas poli-ubiquitinated se acompaña de una activación de compensación de la degradación de proteínas lisosoma-dependiente, la estabilización de p53, la desestabilización de la ciclina D1 y la aparición de apoptosis. Nuestros hallazgos sugieren que el tratamiento RAMB compuesto, posiblemente en combinación con el inhibidor de cloroquina lisosoma, tiene potencial como nueva vía para el tratamiento de cáncer de cuello uterino.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
líneas celulares de cáncer de cuello del útero HeLa, SiHa, CaSki y ME180, se obtuvieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron en DMEM suplementado con suero bovino fetal 10%, penicilina 100 UI /ml, y 100 mg /ml de estreptomicina a 5% de CO
2. Los queratinocitos se obtuvieron de Invitrogen (Carlsbad, CA) y se cultivaron en definida de queratinocitos-SFM.
viabilidad de las células de ensayo
La viabilidad celular se determinó por 2,3-bis [2-metoxi-4- nitro- 5-sulfofenilo] 2H-tetrazolio-5-carboxanilida sal interna (XTT) de ensayo (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). Las células sembradas a una concentración de 1.000 por pocillo en 100 l de medio en placa de 96 pocillos se trataron con derivados basados en chalcona en concentraciones especificadas. Después de los períodos indicados, las células fueron incubadas de acuerdo con el protocolo del fabricante con la mezcla de marcaje XTT durante 4 horas. tinte de formazán se cuantificó usando un lector de placas espectrofotométrico para medir la absorbancia a 450 nm (lector de ELISA 190; Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
La determinación de células apoptóticas por citometría de flujo
La inducción de apoptosis se determinó por Anexina-V de tinción /7-AAD. Anexina-V de tinción /7-AAD se hizo usando Anexina V-PE Kit Apoptosis Detección I (BD Pharmingen, San Diego, CA) según el protocolo del fabricante. Brevemente, 1 × 10
5 células se resuspendieron en tampón de unión, a 5 l de anexina V-PE y 5 l de 7-AAD fueron luego añadido a las células que se incubaron a continuación a temperatura ambiente durante 15 minutos, y se analizaron por citometría de flujo en un Becton Dickinson FACSCalibur. El análisis de datos se realizó con el programa informático CellQuest (Becton Dickinson Immunocytometry System, Mountain View, CA).
Los anticuerpos y Western blot
proteína celular total (10-20 g) de cada muestra fue separada por SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF y se sometieron a análisis de transferencia Western. Los anticuerpos para el análisis de Western Blot se obtuvieron de las siguientes fuentes comerciales: anti-ubiquitina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), clon anti-p53 DO-1 (Calbiochem, Gibbstown, NJ) anti-PARP (BD Pharmingen, San Diego , California), anti-GAPDH (Sigma, St. Louis, MO), peroxidasa ligada anti-ratón inmunoglobulina G (Amersham, Piscataway, NJ) y se utilizan a la concentración recomendada por el fabricante. Anti-ubiquitina y anticuerpos anti-vimentina para el análisis de inmunofluorescencia se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Rojo Texas marcado con anticuerpo de cabra anti-ratón de Inmunoglobulina G y caballo marcado con fluoresceína anti-inmunoglobulina de conejo G se obtuvieron de Molecular Probes (Carlsbad, CA), y Vector Laboratories (Burlingame, CA), respectivamente, y se utiliza a la concentración recomendada por el fabricante.
la morfología celular y los análisis de inmunofluorescencia
Un microscopio invertido Nikon Eclipse TE 2000E se utilizó para la formación de imágenes de la morfología celular con contraste de fase y de inmunofluorescencia. Para el análisis de la ubiquitina y vimentina localización subcelular, se hicieron crecer cultivos de células HeLa como se describe en Lab-Tek II cubreobjetos cámaras (Nalge Nunc International, Rochester, NY). En los tiempos indicados, las células se fijaron y se permeabilizaron con metanol y se incubaron con los anticuerpos primarios indicados. anticuerpos secundarios fluorescentes se utilizan para visualizar la localización de proteínas y el ADN nuclear se visualizó por 4,6-diamino-2-fenilindol tinción (DAPI). muestras montadas se observaron bajo un microscopio invertido Nikon Eclipse TE 2000E y las imágenes capturadas con punto 3.5.8 software de adquisición (instrumentos de diagnóstico, Sterling Heights, MI).
Medición de la actividad en Proteasomal 20S purificada proteasomas
Las células (5 × 10
8) se lavaron en PBS frío y se resuspendieron en tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), mM MgCl 5
2, 1 mM DTT (Sigma), ATP 2 mM y sacarosa 250 mM. Se añadieron perlas de vidrio equivalente al volumen de la suspensión celular, y la mezcla se agitó en vórtice durante 1 min a 4 ° C. Granos y los restos celulares se eliminaron por 5 min de centrifugación a 1000 g, seguido por 20 min de centrifugación a 10.000
g
[27]. Lisados fueron aprobados por ultracentrifugación durante 1 hora a 100.000
g
, y los sobrenadantes fueron ultracentrifuged más de 5 horas a 100.000
g
. pastillas que contienen proteasoma se resuspendieron en 0,5 ml de tampón de homogeneización [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), KCl 100 mM, 15% de glicerol]. La concentración de proteína se determinó utilizando el protocolo BCA (Pierce, Rockford, IL). sustratos fluorogénicos Suc-LLVY-AMC, Boc-LRR-AMC y Ac-YVAD-AMC se utilizaron para medir las actividades de quimotrípticos como, tríptico-como-como caspasas y, respectivamente. proteasomas semipurificadas (10 l), previamente tratadas o no con inhibidores de 30 min a 37 ° C, se ensayaron a 37 ° C durante 45 min utilizando los diferentes sustratos peptídicos en un tampón que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl
2 y DTT 1 mM (volumen final de 100 l). La reacción se inactivó con 1 ml 1% de SDS y la fluorescencia determinada por fluorímetro (Perkin-Elmer, Beaconsfield, UK) con excitación a 380 nm y emisión a 440 nm [18]. Los datos se expresan como el porcentaje de inhibición en relación con los preparativos de proteasomal no tratados.
Medición de la actividad en Proteasomal 26S proteasomas en células vivas
células en crecimiento exponencial (1 × 10
6) se sembraron en placas de 60 mm y, o bien simulada tratados o tratados con diferente RAMB1 concentración durante un período de 4 horas. actividad proteasomal en lisados celulares (NP-40 tampón de lisis: 0,1% NP-40, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM, glicerol al 5% y DTT 1 mM) se determinó midiendo la actividad de luminiscencia residual después de la adición de la Suc sustrato ™ -LLVY-Glo (Promega, Madison, WI) específico para la actividad similar a quimotripsina del proteasoma de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Ensayo de luciferasa-4XUbiquitin degron
el 4Xubiquitin- construcción de fusión luciferasa designado Ub-FL y el plásmido de control diseñado por CMV-FL fueron amablemente proporcionados por el Dr. David Piwnica-Worms (Universidad de Washington, St. Louis, MO) [26]. culturas Sub-confluentes de células HeLa fueron transfectadas con ADN de plásmidos utilizando Lipofectamine 2000 reactivo (Life Technologies, Carlsbad, CA). FL y Ub-FL transfectaron células HeLa se sembraron a 50.000 células /pocillo en placas de 24 pocillos o 200.000 células /pocillo en 6 pozos de placa de 24 horas después de la transfección y se incubaron con compuestos o vehículo (DMSO) a las dosis y tiempos indicados. La actividad de luciferasa en el lisado celular se determinó con un kit de ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. Las imágenes fueron adquiridas durante 1 minuto con un Xenogen IVIS 200 (Calibre, Hopkinton, MA). Igualmente áreas de tamaño se analizaron usando software de estar Image 2.20.
ensayo clonogénico
crecimiento exponencial SiHa, células de cáncer cervical CaSki y HeLa se sembraron en cada 1.000 o 100 células /pocillo en placas de 6 pocillos. Un puesto de siembra días, las células se trataron con vehículo solo (mock) o RAMB1 a las dosis indicadas, y se incubó a 37 C en 5% de CO
2 durante 10 días. Al final del tratamiento se retiró el medio y las células se lavaron con PBS fijación y la tinción de las colonias utilizando una mezcla de 6,0% de glutaraldehído y 0,5% de cristal violeta como se describe anteriormente [27] anterior. Las colonias se obtuvieron imágenes y se contaron usando un microscopio invertido Nikon Eclipse TE 2000E y las imágenes capturadas con punto 3.5.8 software de adquisición (instrumentos de diagnóstico, Sterling Heights, MI). Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
El análisis estadístico
Los resultados se presentan como media ± desviación estándar (SD). La significación estadística de las diferencias fue evaluada por dos colas de Student
t
usando Prism (GraphPad V.5, San Diego, CA) y Excel. El nivel de significación se fijó en p = 0.05. El índice de combinación (IC) de RAMB1 y cloroquina se calculó por el análisis del efecto mediana de acuerdo con el método de Chou y Talaly [28]. CI & lt; 1 indica sinergia, IC = 1 indica aditividad, y CI & gt; 1 indica antagonismo. además se realizaron análisis de regresión para estabilizar las estimaciones.
Resultados
ramb compuestos reducen selectivamente la viabilidad de las células de cáncer de cuello uterino, independientemente del genotipo del VPH
a través de
bloqueo de la degradación proteasomal
Los miembros de la familia flavonoides y triterpenoides, incluyendo celastrol [19], el resveratrol [29], [30], la curcumina [17], epigalocatequina-3-galato [20], [31], [32], [33], [ ,,,0],34] y chalconas [35], [36] presentan propiedades anti-cáncer asociados a su actividad como inhibidores del proteasoma [14], [15], [16], [21]. Recientemente hemos informado de que en los inhibidores del proteasoma a base de chalcona la naturaleza de la porción de aminoácido de la molécula confiere especificidad hacia las actividades catalíticas de proteasoma 20S [14]. Sobre la base de varios estudios anteriores [22], [23], [37], la hipótesis de que el sistema de cetona α-β de chalconas puede representar el determinante molecular mínimo para la inhibición de la degradación de proteínas mediada por ubiquitina aguas arriba de proteasomas.
para probar esta hipótesis que inicialmente exhibió una biblioteca de derivados basados en chalcona que llevan diferentes sustituyentes en los anillos aromáticos adyacentes al sistema de cetona α-β y que carecen de porciones aminoacídicas, por su capacidad inhibidora del crecimiento de células en crecimiento exponencial cervical HeLa HPV18-positivas línea celular de cáncer en un rango de concentración de 100 a 0,01 M (no mostrado). Cuatro derivados de chalcona, RAMBs de aquí en adelante denominados, capaces de reducir la viabilidad de las células de crecimiento exponencial las células de cáncer cervical HeLa de una manera dependiente de la dosis con IC
50 valores & lt; 5 m, se eligieron para una evaluación adicional (Figura 1). Para determinar la factibilidad del uso de compuestos RAMBs para el tratamiento de cáncer de cuello uterino, hemos probado si el tratamiento RAMB1-4 puede constituir un obstáculo específicamente la viabilidad celular de las células de cáncer cervical más de queratinocitos normales y si la reducción de la viabilidad celular en células de cáncer cervical depende del VPH -genotipo. Como se muestra en la Figura 2, RAMB1 o RAMB4 tratamiento produjo una reducción dependiente de la dosis en la viabilidad de las células SiHa y Caski HPV16-positivas y las líneas celulares de cáncer cervical ME180 HPV-39-positivas, respectivamente, con efectos mínimos sobre la viabilidad de queratinocitos humanos primarios y con IC
50 similar a la obtenida con HeLa. Resultados similares con ligeramente superior IC
50 se obtuvieron utilizando RAMB2 y RAMB3 (no mostrado). Para probar si la reducción en la viabilidad celular observada en células de cáncer cervical después de la exposición a los compuestos RAMB1-4 era debido a su capacidad de interferir con la degradación de proteínas mediada por ubiquitina, monitorizamos los niveles de acumulación de proteínas poli-ubiquitinated después del tratamiento. Específicamente, las células HeLa se trataron con 5 mM de RAMB1, RAMB2, RAMB3, o RAMB4 o 10 nM de bortezomib, este último se utiliza como control positivo UPS-factor de estrés, durante un período de 6 horas. Como se muestra en la Figura 3 (
panel izquierdo
), análisis de inmunotransferencia de ubiquitinated los niveles de expresión de proteínas en células HeLa reveló un claro patrón de acumulación de proteínas poli-ubiquitinated en RAMBs tratados con cultivos de HeLa. Un análisis semi-cuantitativo de los niveles de proteína polyubiquitinated muestra que los niveles de GAPDH-normalizada de polyubiquitinated proteínas son consistentemente más altos (hasta 3 veces) en RAMB tratadas frente a las células tratados de forma simulada (Figura 3,
panel derecho
). Estos hallazgos sugieren que la disminución de la viabilidad celular observada en el panel de células de cáncer de cuello uterino, pero no en las células normales después del tratamiento RAMBs se asocia con la perturbación de la degradación de proteínas mediada por ubiquitina y se produce independientemente del tipo HPV oncogénico.
IC
50 valores se determinaron mediante ensayo XXT. El IC
50 valor se aportan corresponden a la media de tres determinaciones independientes.
Los cultivos de células transformadas por VPH cervical cáncer (SiHa, CaSki y ME180) o queratinocitos humanos primarios se trataron con las concentraciones indicadas de RAMB1 (
panel izquierdo
) o RAMB4 (
panel de la derecha
) durante un período de 48 horas. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo XTT y se representa como una fracción de los cultivos de control no tratados
panel de la izquierda:. el análisis de inmunoblot Red de ubiquitinated proteínas en células HeLa después de la exposición de 6 horas con o sin 10 mM RAMBs. Bortezomib se utilizó como control positivo. La igualdad de carga de proteína en cada carril se verificó mediante el uso de un anticuerpo contra GAPDH.
Panel derecho:.
La cuantificación de los coeficientes /GAPDH ubiquitina
tratamiento RAMB desencadena una proteasoma-ubiquitina-System (UPS)-estrés respuesta sin afectar 20S proteasoma actividades catalíticas
para probar si el rápido (seis horas o menos, datos no publicados) acumulación de proteínas poli-ubiquitinated después de la exposición RAMBs se produce de forma concomitante con la inhibición directa de las actividades catalíticas de los proteasomas, la prueba de la capacidad de RAMB1 y RAMB4 (que inducida por una mayor acumulación de proteína polyubiquitinated que los otros RAMBs, la Figura 3) para inhibir las subunidades catalíticas específicas dentro de la proteasoma 20S. Específicamente los RAMBs se ensayaron para determinar su capacidad para inhibir la quimotripsina (CT-like), similar a la tripsina (T-like) y el péptido peptidylglutamyl actividades (PGPH similar) hidrólisis similar en proteasoma 20S purificado previamente expuestos a dosis crecientes hasta 10 M de RAMBs por un período de 30 minutos después de la adición de sustratos fluorogénicos [38]. El inhibidor del proteasoma con licencia FDA Bortezomib se utilizó como control positivo. Como se muestra en la Figura 4 el perfil de la inhibición del proteasoma muestra que a diferencia de Bortezomib, RAMB1 y tratamiento RAMB4 fallaron en inhibir las funciones proteasomal cuando se ensaya a concentraciones de hasta 10 mM (se obtuvieron resultados similares con los otros compuestos de la serie, no se muestra).
purificadas proteasomas 20S se trataron durante 30 min con o sin compuestos RAMB o Bortezomib, aquí utilizado como control positivo, a las concentraciones indicadas y los sustratos fluorogénicos específicos para quimotripsina, tripsina y el péptido peptidylglutamyl hidrolizante-como posteriormente se añadieron las capacidades del proteasoma hidrolíticas. Se muestra un ejemplo representativo de dos experimentos independientes.
Con el fin de evaluar si el fracaso para inhibir la función proteasomal
in vitro
puede ser recapitulado en el proteasoma intacta que se encuentra en las células vivas, hemos utilizado dos enfoques diferentes. En primer lugar, hemos utilizado el reportero bioluminiscente 4XUb FL-ubiquitina-luciferasa, que se resiste a la escisión por hidrolasas ubiquitina [26], para transfectar células HeLa. Uso de Ub-FL y FL transfectadas células HeLa hemos monitorizados actividad de luciferasa tras la exposición a RAMBs durante un período de 6 horas. Como se muestra en la Figura 5
(izquierda)
diferencia de Bortezomib o nuestra recientemente identificado inhibidor del proteasoma RA1 [14], aquí utilizado como inhibidores del proteasoma controles positivos, RAMB1 o RAMB4 tratamiento indujo una estabilización más débil del reportero Ub-FL cuando probado en una concentración hasta 20 mM que los observados, ya sea para la AR-1 o bortezomib. La cuantificación de la relación /FL Ub-FL con fingida frente RAMBs se presentó la cultura expuesta en la Figura 5 (
medio de panel). A continuación, la falta de inhibición de la actividad proteasomal 20S en las células tratadas con RAMB se confirmó midiendo la actividad residual en fluorogénico proteasoma 20S purificado de células de cáncer cervical CaSki pre-expuestas a RAMB1 o RAMB4 durante 4 horas. Como se muestra en la Figura 5 (
panel derecho
), a diferencia de Bortezomib, el tratamiento RAMB1 no inhibir la actividad quimotríptica de proteasomas cuando se ensaya a concentraciones de hasta 20 mM. En conjunto, esto sugiere que la pérdida de la viabilidad celular en células de cáncer de cuello uterino después de la exposición RAMBs se produce de forma concomitante con la acumulación de proteínas polyubiquitated sin la inhibición directa de la actividad proteasomal 20S
Panel izquierdo:.
la actividad de luciferasa en lisados de Ub-FL o células FL-vector transfectadas ya sea con o sin tratamiento con compuestos RAMB o Bortezomib se cuantificaron en unidades relativas de luminiscencia (RLU) y se expresó como% de control. Las barras de error son la desviación estándar (SD) para tres experimentos independientes.
Panel central:
La cuantificación de la relación de Ub-FL /FL.
Panel derecho: actividad de luminiscencia
en lisados de células derivadas de células de cáncer cervical CaSki con o sin RAMB o tratamiento bortezomib cuantificados en unidades de luminiscencia relativas (RLUs). *, P & lt; 0,05, **, P & lt;. 0,02
RAMB1 tratamiento induce la formación aggresome y desencadena
mediada por ubiquitina respuestas de choque térmico
Nosotros y otros han demostrado que la inhibición de la la degradación de proteínas a través de la inhibición de proteasoma provoca choque térmico y las respuestas se desarrolló la proteína incluyendo la formación de estructuras citoprotectores llamados aggresomes como un mecanismo para compensar la inhibición de las funciones de proteasomal y el aumento de los niveles de estrés UPS dentro de las células del cáncer [4], [6], [39] . Para probar si la rápida acumulación de la proteína poli-ubiquitinated tras el tratamiento RAMB1 se produce de forma concomitante con las respuestas de proteínas de choque térmico (EPU) que supervisó los niveles de expresión de proteínas de Hsp90 en células de cáncer cervical HeLa expuestas a 10 mM RAMB1-3 durante 8 horas. Como se muestra en la Figura 6A (
panel izquierdo
) análisis de inmunotransferencia de la proteína Hsp90 niveles de expresión reveló que un fuerte patrón de acumulación de Hsp90 en RAMB1-tratados frente a los cultivos de células HeLa tratados de forma simulada (se obtuvieron resultados similares con la otra derivado de la serie, no se muestra). Un análisis cuantitativo de los semi niveles de proteína Hsp90 muestran que los niveles de GAPDH normalizado de polyubiquitinated proteínas son casi 2 veces más altos que en el tratado frente a células no tratadas se muestra en la Figura 6A (
panel de la derecha
).
A.
Panel izquierdo: análisis de inmunotransferencia Red de los niveles de expresión de Hsp90 en células de cáncer cervical HeLa después de la exposición de 8 horas con o sin 10 mM tratamiento RAMBs. Bortezomib se utilizó como control positivo. La igualdad de carga de proteína en cada carril se verificó mediante el uso de un anticuerpo contra GAPDH.
Panel derecho:
La cuantificación de la relación de Hsp90 /GAPDH. células B. HeLa se incubaron con o sin 5 RAMB1 mu M o 10 nM Bortezomib durante 18 horas antes de la fijación y tinción inmuno-fluorescencia de DNA (azul), la ubiquitina (verde) y vimentina (rojo) antes de formación de imágenes (60 ×).
a continuación, se planteó la hipótesis de que la acumulación de proteínas poli-ubiquitinated después de la exposición compuesto RAMB daría lugar a la activación de las vías de compensación alternativa a la degradación de proteínas mediada por ubiquitina, específicamente para activación de la vía lisosomal. Para probar esta hipótesis que supervisó la localización subcelular de la ubiquitina mediante análisis de microscopía de inmunofluorescencia en células de cáncer cervical HeLa expuestas a 10 mM de RAMB1. Como se muestra en el análisis de inmunofluorescencia Figura 6B de proteínas poli-ubiquitinated en las células HeLa tratadas con RAMB1 revela la presencia de vimentina-enjaulado,, estructura aggresomes ubiquitina-positiva consistente con que se ha descrito anteriormente en el tratamiento con Bortezomib [6]. Tomados en conjunto, estos resultados indican que en las células tratadas con RAMB1 la acumulación de los resultados de poli-ubiquitinated en las respuestas citoprotectores similares a los de la inhibición de proteasoma por el bortezomib actividades catalíticas, pero se produce a través de un mecanismo independiente de ella.
cables de tratamiento RAMB1 a la estabilización de p53, ciclina D1 y la desestabilización inicio de la apoptosis
La oncoproteína E6 del VPH ejerce su actividad oncogénica por la orientación p53 y otras proteínas supresoras de tumores para la rápida degradación proteasomal mediada por ubiquitina. Esto reduce el nivel de este regulador del ciclo celular celular clave sin la mutación de p53. Para probar si el deterioro de la ubiquitina mediada por la degradación de proteínas después del tratamiento RAMBs conduce a la estabilización de p53 como un mecanismo de inicio de la muerte celular podría contribuir, se examinaron los niveles de expresión de p53 siguientes 6 horas de exposición a los compuestos 10 mM de RAMBs. Como se muestra en la Figura 7A, 8 horas RAMB1 exposición está asociada con la acumulación dependiente de la dosis de p53 en células de cáncer cervical CaSki comparado con el control simulado. Es importante destacar que, estabilización de p53 causa supresión del promotor de la ciclina D1 que resulta en la represión activa de la ciclina D1 transcripción [40]. Para probar si esto resulta en la reducción de los niveles de expresión de ciclina D1, células de cáncer cervical CaSki fueron expuestos a dosis crecientes de RAMB1 durante un período de hasta 8 horas. Como se muestra en la Figura 7B
(panel izquierdo)
tratamiento RAMB1 hace dependiente del tiempo (
Top of) y dependiente de la dosis (
inferior) disminución de los niveles de ciclina D1 que sugiere el fracaso de cáncer cervical para entrar en la fase S del ciclo celular como una causa de la toxicidad celular [41]. Un análisis cuantitativo de semi niveles de ciclina D1 β-actina-normalizada se da en la figura 7B (
panel superior derecho e inferior
).
A. El análisis por inmunotransferencia del nivel de expresión de p53 en las células CaSki tratadas con la concentración indicada de RAMB1 durante un período de 8 horas. La igualdad de carga está cada carril se verificó mediante tinción con negro amido. B.
Panel superior izquierdo:
El análisis por inmunotransferencia del nivel de expresión de ciclina D1 en las células CaSki con o sin 10 RAMB1 M durante un período de hasta 8 horas. La carga de proteína se examinó utilizando un anticuerpo contra β-actina.
Panel superior derecho:
La cuantificación de la relación de ciclina D1 /β-actina.
Panel inferior izquierdo:
El análisis por inmunotransferencia del nivel de expresión de ciclina D1 en las células CaSki con o sin RAMB1, a la concentración indicada por un período de 8 horas. La igualdad de carga de proteína en cada carril se verificó mediante el uso de un anticuerpo contra β-actina.
panel de la derecha inferior:
La cuantificación de la relación de ciclina D1 /β-actina. C.
panel izquierdo
. células HeLa se trataron con 10 mM de RAMB1 durante 8 horas y se analizaron por citometría de flujo después de la tinción de anexina V vinculante y la incorporación 7-AAD.
Panel centro
: El análisis por inmunotransferencia de longitud completa y PARP escindida en las células HeLa tratadas 10 M de RAMBs durante un período de 8 horas. La carga de proteína se evaluó utilizando un anticuerpo contra β-actina.
Panel derecho
:. La cuantificación de la relación de PARP escindido /β-actina
Para probar si esto se traduce en la reducción de los niveles de expresión de ciclina D1, células de cáncer cervical CaSki fueron expuestos a dosis crecientes de RAMB1 durante un período de hasta 8 horas. Un análisis cuantitativo de semi niveles de ciclina D1-ß-actina normalizado se da en la figura 7B (
panel superior derecho e inferior
). Como se muestra en la Figura 7B
(panel izquierdo)
tratamiento RAMB1 hace muy rápida (
Top of) y dependiente de la dosis (
inferior) disminución de los niveles de ciclina D1 que sugieren fracaso de cáncer de cuello uterino para entrar en la fase S del ciclo celular puede contribuir a la pérdida de viabilidad celular [41].
estabilización de p53 niveles de estado estable y la desestabilización de los niveles de ciclina D1 sugieren que la reducción de la viabilidad celular observado en el panel de células de cáncer cervical después de la exposición RAMBs podría desencadenar el inicio de la apoptosis. Para probar esta hipótesis, las células de cáncer cervical HeLa se expusieron a 5 M de RAMB1 y se analizaron por citometría de flujo después de la tinción de anexina V vinculante y la incorporación 7-AAD. Anexina V y tinción con 7-AAD permite discriminar viables (anexina V
neg /7-AAD
neg), apoptóticos (anexina V
pos /7-AAD
neg) y muertos (anexina V
pos /7-AAD
) las células de punto de venta. Como se muestra en la Figura 7C (
panel izquierdo
), 24 h de exposición a RAMB1 causó un aumento tanto en la temprana (anexina V positivo de la población) y tardía (anexina V y 7-AAD población doble positivo) y la población apoptótica en los cultivos tratados frente a los controles. Para evaluar si esto es debido a la activación de caspasas, que mide los niveles de la escisión de PARP en las células cancerosas HeLa tras la exposición a RAMB1. Como se muestra en la Figura 7C (
panel central
), mayores niveles de PARP escindido son evidentes en tratados frente a los cultivos no tratados indica la activación de la caspasa-3. La cuantificación de la PARP /GAPDH escindido se proporciona en la figura 7C (
panel de la derecha
). Estos resultados apoyan la hipótesis de que el tratamiento RAMBs desencadena la apoptosis en células de cáncer de cuello uterino.
RAMB1 tratamiento previene la formación de tumores en colonia dependiente de anclaje de las células de cáncer de cuello uterino y de sinergia con el inhibidor de lisosoma cloroquina
Una característica distintiva