Extracto
Hemos utilizado los perfiles de expresión de proteínas para desarrollar una regla de clasificación para la detección y evaluación del pronóstico de cáncer de vejiga en muestras de orina espontánea. Utilizando el Ciphergen PBS II ProteinChip lector, se analizaron los perfiles de proteínas de 18 pares de muestras de tumor de vejiga y el tejido urotelio adyacente, un conjunto de entrenamiento de 85 muestras de orina espontánea (32 controles y 53 cáncer de vejiga), y un conjunto de pruebas ciego de 68 muestras de orina espontánea (33 controles y 35 de cáncer de vejiga). Mediante pruebas t, se identificaron 473 picos que muestran expresión diferencial significativa a través de las diferentes categorías de tumor de vejiga y emparejado muestras adyacentes urotelial en comparación con el urotelio normal. A continuación, las intensidades de los picos 473 se examinaron en un conjunto de entrenamiento de las muestras de orina espontánea. Con este enfoque, hemos identificado 41 picos de proteínas que se expresan diferencialmente en ambos conjuntos de muestras. El patrón de expresión de los 41 picos de proteína se utilizó para clasificar las muestras de orina espontánea como malignos o benignos. Este enfoque proporcionó una sensibilidad y especificidad del 59% y 90%, respectivamente, en el conjunto de entrenamiento y 80% y 100%, respectivamente, en el conjunto de pruebas. La regla de clasificación proteómico realiza con una precisión similar en bajos y la vejiga de alto grado carcinomas. Además, se utilizó la agrupación jerárquica con los 473 picos de proteína en 65 muestras de orina evacuada benignos, 88 muestras de pacientes con cáncer de vejiga clínicamente evidente, y 127 muestras de pacientes con un historial de cáncer de vejiga de clasificar las muestras en Cluster A o B. los tumores en la Categoría B se caracterizan por un comportamiento clínico agresivo con la supervivencia libre de metástasis y específica de la enfermedad significativamente más corto
Visto:. Majewski T, Spiess PE, Bondaruk J, Negro P, C Clarke, Benedict W, et Alabama. (2012) Detección de Cáncer de Vejiga El uso de perfiles proteómicos de los sedimentos de orina. PLoS ONE 7 (8): e42452. doi: 10.1371 /journal.pone.0042452
Editor: William CS. Cho, Hospital Queen Elizabeth, Hong Kong
Recibido: April 9, 2012; Aceptado: July 6, 2012; Publicado: 3 Agosto 2012
Copyright: © Majewski et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud subvenciones R01 CA 151489 (BC) y GU SPORE subvención CA91846 P50 (Proyecto 1, BC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. CC fue originalmente un empleado de Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, California, en el momento del estudio inicial relacionado con este proyecto. Actualmente, se está trabajando en la Oficina del Vicepresidente de Investigación traslacional en la Universidad de Texas M D Anderson Cancer Center. Su afiliación con Ciphergen no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
actuales conceptos patogénicos comunes postulado de que las neoplasias de la vejiga surgen en su epitelial forro (urotelio) a través de dos vías diferentes, pero algo superpuestos: el papilar y vías no papilares. [1] Aproximadamente el 80% de los tumores que surgen en la vejiga son lesiones papilares exofíticos que se originan en los cambios hiperplásicos uroteliales. Por lo general se repiten, pero por lo general no invaden la pared de la vejiga o metástasis. El restante 20% de los tumores de vejiga son carcinomas papilares agresivos, con una propensión a la invasión y metástasis. los cánceres de vejiga invasivo ocurren típicamente en pacientes sin antecedentes de tumores papilares y se originan a partir de
In situ lesiones preneoplásicas
que van desde la displasia leve a moderada (neoplasia intraurotelial de bajo grado, LGIN) a la displasia grave y carcinoma de
In situ gratis (neoplasia intraurotelial de alto grado, HGIN). [2] La mayoría de los carcinomas de alto grado de la vejiga no papilares agresivos presentes en una etapa avanzada y requieren quimioterapia y /o la cistectomía radical para mejorar la supervivencia.
Para los estudios de biomarcadores, carcinoma de vejiga es un modelo de enfermedad ideales , debido a que su desarrollo y progresión se pueden monitorizar mediante técnicas no invasivas o mínimamente invasivas. [3] La mucosa de la vejiga puede ser examinado y las biopsias se puede obtener a través de un procedimiento endoscópico. Además, la morfología de las células uroteliales exfoliadas y sus componentes, así como productos secretados que pueden ser observados en la orina sin ningún riesgo para el paciente.
tecnologías proteómicas que implican la espectrometría de masas acoplada con Sistemas ProteinChip se ha demostrado para facilitar la elaboración de perfiles de proteínas de muestras biológicas. [4] - [6] Los primeros resultados documentan la identificación de suero y proteína en la orina huellas dactilares para el diagnóstico de varios tipos de cáncer [7] - [9] han sido seguidos por los informes aumentando las preocupaciones acerca de problemas con el diseño del estudio, la reproducibilidad, la calibración y los procedimientos analíticos [10] - [13]
El perfil proteómico de desarrollo del cáncer de vejiga de
In situ
neoplasia se desarrolló en una colección de espectros proteómico de muestras pareadas de carcinoma urotelial (CU) y la adyacente. urotelio en comparación con el urotelio normal. Usando este enfoque, se identificaron 473 picos de proteínas expresadas en urotelio normal. Lo mismo 473 fueron identificados posteriormente en el entrenamiento conjunto de muestras de orina espontánea de sujetos control y pacientes con CU. Los picos de las proteínas identificadas por primera vez como anormalmente expresado en muestras de tejido (filtrado paso 1) y luego en el entrenamiento conjunto de muestras de orina espontánea (filtrado paso 2) se utilizaron para diseñar una regla de clasificación. El desempeño de la regla de clasificación se evaluó por primera vez en el conjunto de entrenamiento y luego en un conjunto de pruebas ciegas. Por último, un análisis de agrupamiento se realizó utilizando 473 picos de proteínas sobre todo el control y las muestras de CU para identificar la firma proteómico de cáncer de vejiga agresivo.
Este informe describe una estrategia para perfiles de proteínas mediante desorción por láser de superficie mayor y la ionización de tiempo de vuelo (SELDI-TOF) espectrometría de masas para formular una regla de clasificación para la detección de cáncer de vejiga en muestras de orina espontánea y clasificar clínicamente clases distintas de la enfermedad.
(a) perfil proteómico digitalizadas de la vejiga el desarrollo del cáncer de
In situ
neoplasia. Los niveles de expresión de picos de proteínas se analizaron en muestras pareadas de urotelio adyacente (UA) y la UC en comparación con el urotelio normal (NU). Cada columna representa muestras de UC o la UA y cada fila corresponde a un digitalizadas picos de proteína dispuestas según
M /Z
proporciones. Las relaciones de individuo
M /Z
pico en relación con NU se muestran como una escala de color de saturación por debajo del diagrama. Las muestras correspondientes a la UA y UC se agrupan según sus subconjuntos patogénicos en representación de bajo grado (Grado 1-2) papilar superficial de la Universidad de California (LGPUC) y alto grado (grado 3) UC invasiva (HGNPUC). El diagrama de barras de la derecha muestra los picos individuales de proteínas con alto (roja) e inferior (azul) los niveles de expresión en comparación con NU. Columna 1: comparación entre NU y la UA LGPUC, 2: comparación entre NU y LGPUC, 3: comparación entre NU y la UA HGNPUC, 4: comparación entre NU y HGNPUC. (B) el perfil proteómico de muestras de orina evacuada de sujetos control (control normales, Carolina del Norte) y los pacientes con CU en dicotomía en LGPUC y HGNPUC categorías. El diagrama de barras de la derecha muestra los picos individuales de proteínas con alto (roja) e inferior (azul) los niveles de expresión en comparación con NU. Columna 1: comparación entre Carolina del Norte y LGPUC; Columna 2: comparación entre Carolina del Norte y HGNPUC. (C) Número de picos de proteínas con alto (marrón) e inferior (púrpura) los niveles de expresión en comparación con NU identificado en muestras de tejidos emparejados de la UA y en las muestras de orina espontánea de los pacientes con CU respecto al CN. (D) La proporción de proteínas picos con el patrón de expresión similar y diferente.
Métodos
tumorales y muestras de orina
Todos los tejidos humanos se recogieron wpith consentimiento informado por escrito bajo los protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional MD Anderson y las muestras se analizaron de forma anónima. Se analizaron los perfiles de expresión de proteínas de 18 pares de muestras de tumor de vejiga y el tejido urotelio adyacente, 88 ANULADO muestras de orina de pacientes con cáncer de vejiga clínicamente evidente, y 127 ANULADO muestras de orina de pacientes con antecedentes de cáncer de vejiga (HiUC) y ningún cistoscopia o evidencia patológica (biopsia negativa de la vejiga y /o citología orina espontánea) de cáncer de vejiga en el momento de la recolección de orina. Para las muestras pareadas de urotelio adyacente y el tejido de tumor de vejiga, se obtuvieron los perfiles de proteínas de línea de base a partir de suspensiones de células uroteliales de 13 uréteres sin evidencia de neoplasia uroteliales retiradas durante la nefrectomía para el carcinoma de células renales. Para las muestras de orina, se obtuvieron los perfiles de proteínas de línea de base de 65 individuos sanos. Los perfiles se analizaron inicialmente en muestras pareadas de urotelio adyacente y el tejido del tumor de vejiga. Ellos fueron comparados con los perfiles identificados en las primeras 85 muestras de orina (32 controles y 53 cáncer de vejiga) se hace referencia como el conjunto de entrenamiento. Posteriormente, las proteínas que fueron significativamente arriba o hacia abajo reguladas en ambos conjuntos se utilizaron en un algoritmo de diagnóstico por primera vez en el conjunto de entrenamiento (n = 85) de las muestras de orina y luego en un conjunto de pruebas ciego (n = 68; 33 controles y 35 cáncer de vejiga). Por último, los perfiles proteómicos de todas las muestras (65 controles normales, 88 cánceres de vejiga, y 127 HiUCs) se analizaron mediante la agrupación sin supervisión.
(A) Hasta regulado (rojo) y hacia abajo reguladas (azul) picos de las proteínas identificadas en la UA y la Universidad de California (fila superior) y las muestras de orina evacuada (mediados fila) y los picos de proteína encontrado consistentemente en ambos conjuntos de muestras (fila inferior). (B) Mapa de calor durante 41 picos de las proteínas identificadas mediante el filtrado de paso 2. (Ver Figura 1) (C) Clasificación de las muestras individuales (panel izquierdo) y curva ROC (panel derecho) en el conjunto de entrenamiento. (D) La clasificación de las muestras individuales (panel izquierdo) y curva ROC (panel derecho) en el conjunto de pruebas.
Las condiciones precursoras intraurotelial fueron clasificados en las secciones paralelas de las áreas de la mucosa adyacente, como LGIN o HGIN . [2] La presencia de lo normal, displásicos o células malignas en los raspados del tejido adyacente urotelio fue confirmada mediante la evaluación microscópica de las preparaciones de Cytospin. Los tumores fueron clasificados de acuerdo al sistema de clasificación histológica de tres niveles Organización Mundial de la Salud y de sus patrones de crecimiento (frente papilares no papilar). [14] La profundidad de la invasión se registró según la TNM (tumor-nódulo-metástasis) sistema de estadificación. [15] Etapa T
1 (lámina propia invasión) se ha dividido en T
1A (no hay invasión muscular de la mucosa) y T
1b (muscular de la mucosa invasión), que tiene un riesgo significativamente mayor de progresión. [16] Los tumores se dicotomizaron en superficiales (T
a-T
1 bis) e invasivo grupos (mayores T
y 1b), como se ha descrito anteriormente. [17]
(A) Clasificación de las muestras individuales (panel izquierdo) y curva ROC (panel derecho) basado en 65 muestras de control benignas y 53 muestras de pacientes con LGPUC. (B) Classificatin de muestras individuales (panel izquierdo) y curva ROC (panel derecho) en base 65 muestras de control benignas 35 muestras de pacientes con HGNPUC. (C) Clasificación de las muestras individuales (panel izquierdo) y la curva ROC (panel derecho) basado en 65 muestras de control benignas y 88 muestras de pacientes con CU. (Formación combinada y las pruebas conjuntos) (D) Comparación de la precisión diagnóstica de la proteómica y la citología en 39 muestras de pacientes con UC. (E) Clasificación de las muestras individuales por la proteómica en base a la prueba y entrenamiento combinado establece, así como para LGPUC y HGNPUC separado.
Las suspensiones celulares de urotelio y tumor de vejiga tejido adyacente se prepararon como se ha descrito anteriormente. [16] En resumen, se utilizaron muestras de tumores de vejiga, cistectomía no tratados previamente, después de obtener el consentimiento informado de los pacientes. Cada muestra cistectomía se abrió longitudinalmente a lo largo de la pared anterior de la vejiga y inmovilizado a un bloque de parafina. se obtuvo una sección representativa de la zona central de tumor groseramente identificado para perfiles proteómicos. La presencia de tumor en el tejido se confirmó a través de análisis de las secciones congeladas. Para minimizar la contaminación con el tejido no tumoral, que diseccionado un área de tejido tumoral del bloque congelado. Preparamos las suspensiones de células uroteliales de tejido urotelio adyacente por raspado de la superficie de la mucosa. La pureza de las muestras se determinó mediante el examen citológico de las preparaciones de citospina. Sólo las muestras que produjeron más de 90% microscópicamente normal intacta, displásico o células uroteliales malignas se utilizaron para el análisis de proteínas. Para el procesamiento, las células se transfirieron a tubos cónicos que contienen solución salina tamponada con fosfato (PBS). El tejido tumoral congelado fue transferido a un tubo cónico similar que contiene PBS, que se agitó mecánicamente para liberar las células tumorales. Antes de preparar lisados celulares, que ya lavadas las suspensiones celulares a través de Ficoll Histopague-1077j (Sigma Diagnostics, Inc. de St. Louis, MO, USA) gradiente de centrifugación. Para el almacenamiento, los sedimentos celulares se resuspendieron en PBS que contiene 20% de sulfóxido de dimetilo y se congelaron en nitrógeno líquido. muestras de orina espontánea fueron tratados de la misma manera. [3] |
La cohorte incluyó 65 controles normales (CN), 88 pacientes con cáncer de vejiga clínicamente evidente (UC) y 127 pacientes con antecedentes de cáncer de vejiga (HiUC). La agrupación se realizó utilizando la distancia euclídea y la matriz de intensidades de expresión de 473 picos de proteínas. Cada columna representa una muestra de orina anulado y cada fila corresponde a los picos de proteínas digitalizadas dispuestas según
M /Z
proporciones.
Tratamiento de las muestras de orina se completó en 1-4 horas siguientes a la recepción. El volumen de orina varió de 10 a 50 ml. Las muestras de orina se centrifugaron a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sedimento celular se resuspendió en 2 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). El nuevo tubo cónico (50 ml) se llenó con 20 ml DMEM, y 5 ml de Ficoll se colocó en la parte inferior. Las células urinarios se transfirieron entonces a la parte superior de la solución. Después de centrifugación a 2500 rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente, se retiró la capa superior de 10 ml, y la interfaz (~ 8 ml) con células urinarios se transfirió a un nuevo tubo cónico (25 ml). La muestra se centrifugó de nuevo a 2500 rpm durante 10 minutos a 4 ° C. Finalmente las células se recogieron, se resuspendieron en 2 ml de DMEM con 10% de sulfóxido de dimetilo, y se almacena a -80 ° C para su uso posterior.
(A) Distribución de muestras de orina evacuada en el grupo A y B de la normalidad controles (NC), pacientes con cáncer de vejiga clínicamente evidente (UC) y los pacientes con antecedentes de cáncer de vejiga (HiUC). (B) Distribución de muestras de orina evacuada en categorías A y B de acuerdo con el grado histológico y el estadio dicotomizadas en bajo grado invasivo superficial papilar de la Universidad de California (LGPUC, pT
a - pT
1 bis) y alto grado no papilar UC ( HGNPUC, T
1b y superior). (C) de Kaplan - Mayer parcelas de metástasis y la supervivencia específica de la enfermedad de los pacientes con cáncer de vejiga en las categorías A y B.
Preparación de lisados de células y análisis proteómico
Se prepararon lisados celulares como se indica en el sitio web de Bio-Rad. [18] En resumen, fueron remolcados las muestras, se centrifugaron a 5000 g durante 10 minutos, se lavaron en PBS, y se resuspendieron en un tampón de lisis (Tris 10 mM [pH = 9], NaCl 10 mM, 0,1% de dodecil mattoside). Los lisados de proteínas se prepararon mediante sonicación usando un aparato de ultrasonidos de sonda (Cole-Parmer Instrument Co., Chicago, IL, EE.UU.), fijado en 5 vatios 10 veces durante 15 segundos con intervalos de 45 segundos de enfriamiento en hielo. El contenido total de proteínas se midió en cada muestra usando un kit de reactivos de ensayo de proteínas Micro BCA (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Inmovilizados virutas de metal de captura por afinidad IMAC3 (Ciphergen Biosystems, Fremont, CA, EE.UU.) se utilizaron para el análisis proteómico. Chips activados por sulfato de cobre se lavaron brevemente en agua desionizada y se incubaron con acetato de sodio 100 mM (pH, 4,5) durante 5 minutos para eliminar cualquier exceso de Cu
2 y de nuevo se lavó con agua desionizada. Los chips se equilibraron brevemente con tampón de lisis celular y se incubaron durante 1 hora con lisados de proteínas que contiene 1 g de proteína total en un volumen de 3-8 l de tampón de lisis. Antes de la lectura, los chips se lavaron tres veces con tampón de lisis, dos veces con agua desionizada, se secaron al aire, y cristalizan con 0,3 l de ácido sinapínico en ácido trifluoroacético /1% de acetonitrilo 50%. Todos los pasos de preparación se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Los perfiles de proteínas se analizaron mediante un lector de PBS II ProteinChip Ciphergen (Ciphergen Biosystems Fremont, CA, EE.UU.). Antes de cada serie de mediciones, el sistema fue calibrado usando un estándar de "todo-en-1" de Ciphergen Biosystems, y el perfil proteómico de un tejido normal de referencia, es decir, del tejido urotelio normal o del sedimento de orina de individuos normales, era probado.
(a) de perfiles de proteínas entre 3300 y 3600 m /z de muestras representativas correspondientes a NC, LGPUC y HGNPUC que muestran el patrón de expresión de los tres picos de proteínas con 3.370, 3.440 y 3.490 ± 10 m /z se refiere como picos 1-3 (1-3 pk) que representa el grupo de alfa-defensinas. (B) Zoomed mapa de calor que muestra el patrón de expresión de α-defensinas clúster en el conjunto de entrenamiento. (C) Las intensidades de expresión grupo α-defensinas 1-3 que corresponden a pk en muestras de mesadas de ensayo y formación conjuntos de Carolina del Norte, y LGPUC HGNPUC. líneas rojas cruzadas y las barras verticales representan las desviaciones medias y estándar. Se utilizó dos muestras t-test para comparar las intensidades de los picos log2-transformado en muestras de cáncer y controles para cada pico respectivo (p & lt; 0,001).
Para evaluar la exactitud de las mediciones, se realizaron varios estudios. [19] Se evaluó la intensidad de 26 picos en 24 espectros de duplicados de la misma muestra de tejido normal de urotelio para comprobar la reproducibilidad (Figura S1). coeficientes máximos de variación (CV) osciló entre el 13,7% y el 63,1% de la media. El CV medio fue de 22,7%, y el rango intercuartil era del 19,4% al 27,7%. También probamos la sensibilidad de la relación masa-carga (m /z) los valores de una cantidad de la proteína total por diferentes cargas de 0,5 a 2 mg, y las lecturas M /Z variado en menos del 1% (datos no se muestra).
Procedimientos analíticos
Todos los espectros se exportan como archivos * .xml utilizando el software Ciphergen. Los espectros primas fueron procesados mediante secuencias de comandos de MATLAB de desarrollo propio para (a) eliminar el ruido aleatorio, (b) restar la línea de base de baja frecuencia, y (c) detectar y cuantificar los picos individuales de la muestra. Reducir el ruido y la resta de referencia se realizaron utilizando el enfoque de ondas de umbral. [20] Después de la eliminación de ruido, se normalizaron los espectros. La detección de picos hizo uso del espectro medio después de la eliminación de ruido. [21] Los datos de todos los espectros se resumieron en una matriz de intensidades de los picos, en donde cada fila corresponde a una específica
M /Z
valor (un pico) y cada columna corresponde a una muestra específica.
exactitud en la clasificación se evaluó a través de la sensibilidad y la especificidad y los valores predictivos positivos y negativos. La regla de clasificación también se evaluó mediante curvas ROC (ROC). El parámetro variable en la curva ROC fue el ángulo entre la línea de frontera de decisión y el eje X normal: un ángulo de 0 ° conducido a todas las muestras de ser clasificado como normal, y un ángulo de 90 ° conducido a todas las muestras de ser clasificado como el cáncer. Además, anulados espectros de orina fueron examinadas usando la agrupación sin supervisión para evaluar el grado de las asociaciones entre los dos grupos y varias covariables clínico-patológicas, incluyendo el seguimiento.
Resultados
La estrategia analítica utilizada en nuestro estudio para formular un perfil de proteínas para la detección de cáncer de vejiga se resume en la Figura 1. para identificar la combinación óptima de picos de proteínas de diagnóstico de cáncer de vejiga, se analizaron primero un perfil proteómico de su desarrollo desde
in situ
neoplasia y comparado con el perfil proteómico de orina evacuada sedimentos de pacientes con cáncer de vejiga. Para identificar las proteínas que se expresan de forma anormal durante el desarrollo temprano del cáncer de vejiga, se analizaron los patrones de su expresión en 18 muestras apareadas de tumor de vejiga y el tejido urotelio adyacente y los comparamos con su patrón de expresión en 13 muestras de epitelio urinario normal. En primer lugar seleccionamos picos que eran claramente identificables en muestras de tejido y se utilizan pruebas t para identificar los picos que tenían expresión diferencial significativa a través de las diferentes categorías de tumor de vejiga y emparejado muestras uroteliales adyacentes. Con este enfoque, se conoce como etapa de filtración 1, hemos identificado 473 picos de proteínas expresadas en el tejido normal de urotelio y conjuntos de proteínas hacia arriba y hacia abajo regulados, que eran un poco solapamiento, pero distinta, significando con ello el desarrollo de cáncer de vejiga de
in situ a través de la neoplasia papilar y vías no papilares. Dado que los sedimentos de orina anulados pueden contener una mezcla de tumor y no tumorales células, incluyendo inflamatoria, estroma y células de sangre periférica, así como células necróticas con proteínas degeneradas, nos centramos en los mismos 473 picos identificados en las muestras de tejido y examinamos sus intensidades en una formación conjunto de muestras de orina espontánea de 53 pacientes con cáncer de vejiga clínicamente evidente y 32 individuos sanos. En esta fase, se hace referencia como filtración paso 2, se realizaron búsquedas, de nuevo utilizando pruebas t, para los picos con expresión diferencial significativa entre los tipos de cáncer y controles.
Ejemplos de espectros de SELDI-TOF de muestras de tejido normal y urotelio muestras pareadas de urotelio adyacente y el tejido tumoral, así como los resultados de la etapa de filtración 1 se muestran en la Figura 2A. Los espectros de los sedimentos orina evacuada de pacientes con cáncer de vejiga y los controles normales y los resultados de la etapa de filtración 2 se muestra en la Figura 2B. Las diferencias en los perfiles de expresión de proteínas de tumores identificados en el tejido y miccionales muestras de orina se resumen en las figuras 2C y D. Es evidente que HGINs o carcinomas uroteliales papilares de alto grado (HGNPUC) tienen patrones de expresión de proteínas veces coinciden, pero distintas que pueden ser también identificado en el tejido urotelio adyacente. Este hallazgo implica que los perfiles de expresión de proteínas anormales pueden ser identificados en el tejido urotelio superficie antes del desarrollo de cáncer clínicamente evidente. Al comparar los patrones de proteínas expresadas de forma anormal en los tumores de vejiga, su urothelia adyacentes, y las muestras de orina evacuada del conjunto de entrenamiento, hemos identificado un conjunto de proteínas hacia arriba y hacia abajo-regulados distintas que estaban presentes en ambos tejidos tumorales de vejiga y ANULADO sedimento urinario muestras de pacientes con cáncer de vejiga que se mantuvo después de dos etapas de filtración. (Figuras 3A y B).
Usando sólo los picos que han superado las dos etapas de filtración, se utilizó la matriz de 41 intensidades de los picos de proteínas para construir una regla de clasificación para las muestras individuales en la formación y las pruebas conjuntos. (Figura 3C) Las posiciones de las muestras individuales en relación con el X (normal) y el eje Y (cáncer) se define mediante un par de números que indican sus asociaciones con ambos perfiles normales y cancerosas de la proteína. En esta regla de clasificación, las muestras con altas asociaciones con los perfiles de proteínas normales y bajas asociaciones con perfiles de cáncer se agruparon en la región 1 y se clasificaron como benignos. Por el contrario, las muestras con las asociaciones bajas con perfiles normales y altas asociaciones con perfiles de cáncer se agruparon en la región 2 y se clasificaron como el cáncer. Las muestras con asociaciones igualmente débiles o fuertes con perfiles normales y cancerosas formados se agruparon en la región 3 y se designaron como ambigua. Los límites de estas agrupaciones se definen utilizando la licencia-un-out validación cruzada.
Exactitud en la clasificación se evaluó inicialmente en el conjunto de entrenamiento en términos de sensibilidad de 0,59, una especificidad de 0,90, valor predictivo positivo en el conjunto de entrenamiento de 0,92, valor predictivo negativo en el conjunto de entrenamiento de 0,53, y el área de la curva ROC de 0,84. (Figura 3D) Habiendo definido la regla de clasificación en el conjunto de entrenamiento, entonces validado su precisión en el set cegado pruebas de 33 muestras de control normal y 35 muestras de cáncer de vejiga, lo que produjo una sensibilidad de 0,80, la especificidad de 1,0, valor predictivo positivo en el conjunto de pruebas de 1,0, valor predictivo negativo en el conjunto de pruebas de 0,83, y el área de la curva ROC de 0,91. (Figura 3D) Los casos que se consideraban ambigua fueron excluidos cuando se calcula la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo. Todos los casos fueron retenidas para el montaje de curvas ROC.
Para evaluar la forma en la regla de clasificación basado en la matriz de intensidades de los picos de proteína 41 realizadas en diferentes subgrupos de cáncer de vejiga, que combina la formación y las pruebas conjuntos y se evalúa su precisión diagnóstica para el carcinoma urotelial de bajo grado papilar (LGPUC) y HGNPUC por separado. El análisis de 65 muestras de control benignas y 53 muestras LGPUC produjo una sensibilidad de 0,74, una especificidad de 0,95, valor predictivo positivo de 0,91, valor predictivo negativo de 0,84, y el área de la curva ROC de 0,88. (Figura 4A) Un análisis similar de 65 muestras de control benignas y 35 muestras HGNPUC produjo una sensibilidad de 0,77, una especificidad de 0,95, valor predictivo positivo de 0,90, valor predictivo negativo de 0,88, y el área de la curva ROC de 0,88. (Figura 4B) Análisis de la precisión general de clasificación para el entrenamiento combinado y las pruebas conjuntos produjo una sensibilidad de 0,75, una especificidad de 0,95, valor predictivo positivo de 0,95, valor predictivo negativo de 0,75, y el área de la curva ROC de 0,88. (Figuras 4C y D) El análisis de 39 muestras de pacientes con cáncer de vejiga para los cuales estaban disponibles los datos paralelos sobre los resultados de la citología de orina espontánea indican que la clasificación basada en los datos proteómicos diagnosticó correctamente 28 (72%) muestras, mientras que la citología orina evacuada diagnosticado correctamente 19 (49%) muestras. (Figura 4E) Prueba de la diferencia entre las muestras positivas identificadas por la proteómica y la citología usando una prueba z para proporciones se obtuvo un valor de p bilateral de 0.032.
agrupamiento no supervisado se llevó a cabo utilizando la distancia euclídea y la vinculación completa en todas las 65 muestras de control normales, 88 muestras de pacientes con cáncer de vejiga clínicamente evidente, y 127 muestras de pacientes con un HiUC. (Figura 5) El uso de la matriz de las intensidades de expresión para los 473 picos de proteínas, que clasifica las muestras en dos grupos principales. El primer grupo (grupo A) consistía en una mayoría (97%) de las muestras de control benignas. (Figura 6A) El grupo segundo (grupo B) consistía en 56% de las muestras de pacientes con cáncer de vejiga clínicamente evidente. Curiosamente, sólo 24% de las muestras de pacientes con un HiUC co-segregados con muestras de pacientes con cáncer de vejiga clínicamente evidente en el grupo B. El 76% restante de las muestras de pacientes con un HiUC y 44% de las muestras de pacientes con cáncer de vejiga clínicamente evidente co-segregados con muestras de control benignos en clúster A. la hipótesis de que esta co-segregación puede significar distintas clases de cáncer de vejiga y analizado los parámetros patológicos y clínicos de las muestras en los grupos A y B. Cluster (Figura 6B) a las muestras compuestas predominantemente normales de control (62%), además de un 27% y un 11% LGPUC HGNPUC. Por el contrario, el grupo B compuesta sólo 4% de muestras normales de control, el 49% LGPUC, y 47% HGNPUC. Los tumores en el grupo B se caracterizaron por significativamente menor supervivencia libre de metástasis y específica de la enfermedad que los tumores de clúster A. (Figuras 6C y D) En general, la probabilidad de morir de cáncer de vejiga en los pacientes en el grupo B fue de aproximadamente 12%, mientras la probabilidad de morir para aquellos en el grupo a fue de menos del 5%.
a pesar de que no se realizó la identificación de los picos se utilizan en una regla de clasificación, nos dirigimos a su naturaleza potencial, centrándose en los tres picos más prominentes utilizado en el análisis de nuestros perfiles de expresión de proteínas. El grupo de tres picos de proteína con valores de m /z más probables correspondientes a alfa-defensinas se incluyó en la regla de clasificación. [22] - [24] Los ejemplos de los perfiles de los espectros de SELDI-TOF entre 3300 y 3600 m /z en muestras de orina representativas de control negativo, LGPUC y HGNPUC que representa el patrón de expresión de tres picos correspondientes a alfa-defensinas y el mapa de calor ampliada en el conjunto de entrenamiento se muestra en la Figura 7A y B. el patrón de expresión de las mismas proteínas en la formación y la prueba combinada conjuntos muestra su sobreexpresión en LGPUC y HGNPUC. (Figura 7C) El patrón de la sobreexpresión de alfa-defensinas es altamente significativa tanto en LGPUC y HGNPUC en comparación con los controles normales e incluso si se toma fuera de contexto de los 41 picos de proteínas anónimas utilizados en la regla de clasificación, estas proteínas realizan razonablemente bien como diagnóstico marcadores (sensibilidad 0,77 y especificidad 0,84). (Figura 7C).
Discusión
El diseño del estudio de perfiles proteómicos consiste típicamente en una comparación de patrones proteómicos de muestras de pacientes con cáncer y muestras de control benignos utilizando algoritmos de inteligencia artificial tales como los algoritmos genéticos o análisis del árbol. [25] - [29] Este enfoque identifica un número limitado de picos de proteínas anónimas para discriminar el cáncer a partir de tejido benigno. Cuando tales picos fueron identificados por secuenciación de péptidos, que representaban, en general, los llamados proteínas de fase aguda en lugar de productos específicos de tumores [28].
Varios estudios utilizando perfiles proteómicos de orina evacuada para la detección de cáncer de vejiga con la plataforma de SELDI se publicaron recientemente. [30], [31] Estos estudios utilizaron diferentes enfoques para el análisis de los espectros de proteínas que van desde el uso de algoritmos de inteligencia artificial combinada con la agrupación supervisada a pico de identificación individual y grupo de picos como parámetros de diagnóstico discriminatorias. [30], [31] Tal como se esperaba, los controles segregadas algoritmo de agrupamiento automático de muestras de cáncer con una alta sensibilidad (80%) y especificidad (& gt; 90%) en el conjunto de entrenamiento, pero se asoció con una caída dramática de la sensibilidad y la especificidad en el ensayo establecido en un rango de aproximadamente 50% y 60%, respectivamente. [30] El enfoque combinatorio de biomarcadores individuales y grupos de biomarcadores proporcionó una sensibilidad del 87% y una especificidad del 66%, pero este estudio no incluyó la formación independiente y las pruebas conjuntos de muestras. [31] Curiosamente, los marcadores individuales identificados por este método incluyen los picos correspondientes a la familia de alfa-defensinas.