Extracto
Los métodos mejorados para la identificación precisa de la presencia y severidad de la neoplasia intraepitelial cervical (CIN) y se necesitan extensión de la propagación de los carcinomas invasivos del cuello uterino (IC). La calorimetría diferencial de barrido (DSC) ha demostrado recientemente para detectar cambios específicos en el comportamiento térmico de proteínas del plasma sanguíneo en varias enfermedades. Esta metodología está siendo explorada para proporcionar un enfoque complementario para el cribado de la enfermedad cervical. El presente estudio evaluó la utilidad de DSC en la diferenciación entre los controles sanos, el aumento de la gravedad de la CIN y temprana y avanzada IC. la discriminación significativa fue evidente con respecto a la extensión de la enfermedad con ningún efecto claro de los factores demográficos como la edad, el origen étnico, el tabaquismo y la paridad. De mayor relevancia clínica, hubo una fuerte diferenciación de CIN de controles sanos y IC, y entre los pacientes con IC entre FIGO Etapa I y cáncer avanzado. Los cambios específicos de la enfermedad observados en DSC perfiles (termogramas) se plantearon la hipótesis de reflejar la expresión diferencial de biomarcadores de la enfermedad que posteriormente unidos a y afectados el comportamiento térmico de las proteínas más abundantes del plasma. El efecto de los biomarcadores que interactúan puede deducirse de la modulación de termogramas pero no puede ser identificada directamente por DSC. Para investigar la naturaleza de las interacciones propuestas, se emplearon espectrometría de masas (MS) análisis. La evaluación cuantitativa de los fragmentos de baja proteína de peso molecular de las muestras de plasma y orina reveló una pequeña lista de péptidos cuya abundancia se correlaciona con el grado de la enfermedad cervical, con los datos peptidome de plasma más llamativos que apoya la teoría interactoma del péptido porcionado a las proteínas plasmáticas abundantes. La DSC enfoque combinado y MS en este estudio fue éxito en la identificación de biomarcadores firmas únicas para el cáncer de cuello uterino y demostraron la utilidad de los perfiles plasmáticos de DSC como una herramienta de diagnóstico complementario para evaluar la salud del cáncer cervicouterino
Visto:. Garbett Carolina del Norte, Comerciante ML, timón CW, Jenson AB, Klein JB, Chaires JB (2014) Detección de Patrones de cáncer de cuello de biomarcadores en sangre de plasma y orina por calorimetría diferencial de barrido y espectrometría de masas. PLoS ONE 9 (1): e84710. doi: 10.1371 /journal.pone.0084710
Editor: José M. Sánchez-Ruiz, Universidad de Granada, España |
Recibido: 31 Agosto, 2013; Aceptado: 18 Noviembre 2013; Publicado: 8 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Garbett et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este material se basa en el trabajo apoyado por la Oficina de Investigación y Desarrollo, Servicio de Investigación médica, Departamento de Asuntos de Veteranos, el Departamento de Energía de la Oficina de Programa de Asistencia Financiera Ciencia (dE-FG02-05ER6406 de MLM y JBK), y la subvención P30ES014443 NIEHS ( de MLM y JBK). Este trabajo también fue apoyado por un subcontrato adjudicado a JBC del Instituto Nacional del Cáncer de subvención R44 CA103437 y con una donación de JBC del Elsa. Fundación U. Pardee. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. NCG, ABJ y JBC son co-inventores en las solicitudes de patentes que describen el termograma DSC de plasma la tecnología para la cual Louisville Bioscience, Inc. (LBI) posee una licencia exclusiva de la Universidad de Louisville. JBC y ABJ son fundadores y accionistas de LBI; NCG es un fundador, accionista y empleado de LBI. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El carcinoma invasor del cuello uterino (IC) es el tercer cáncer más común que afecta a las mujeres con un estimado de 529.000 casos diagnosticados en todo el mundo en 2008 y 274.000 muertes [1]. En las últimas décadas el cribado de rutina ha ayudado a reducir significativamente la incidencia y la mortalidad por IC en los EE.UU., pero, sin embargo, se estima que 12.340 nuevos casos serán diagnosticados con 4.030 muertes en 2013 [2]. cáncer cervical invasivo es precedida por una condición precancerosa, neoplasia intraepitelial cervical (CIN), en la que el crecimiento celular anormal se produce en el revestimiento epitelial del cuello del útero. CIN se divide en grados (1 = leve, 2 = moderado, 3 = grave) según las características histológicas incluyendo cambios nucleares y el grado de participación del epitelio. El riesgo de progresión de la NIC de IC con el tiempo se eleva por grado, siendo más alto para CIN 3 [3], [4]. CIN puede ser tratado para reducir en gran medida la probabilidad de IC en desarrollo. En parte para ayudar con la planificación del tratamiento, CIN 2 y CIN 3 se agrupan comúnmente en conjunto como de alto grado de lesión intraepitelial escamosa (HSIL), que sería tratada y CIN 1 y HPV condiloma como de bajo grado lesión intraepitelial escamosa (LSIL), que sería sin tratar . Una vez IC se detecta la necesidad principal es determinar si hay enfermedad en estadio temprano (estadio I FIGO), que está confinado al cuello uterino o si hay enfermedad metastásica más avanzada. Sólo enfermedad confinada al cuello uterino y de tamaño suficientemente pequeño se considera tratable con cirugía.
Los métodos fiables para detectar con precisión CIN y IC son críticos. detección actual no puede diferenciar de bajo grado de CIN de grado superior, CIN de IC, a principios de los estadios más avanzados de IC, o determinar indicadores de estado de la enfermedad adicionales, tales como la presencia de afectación ganglionar. Durante muchos años el método de cribado inicial para CIN ha sido la prueba de Papanicolaou, que permite a las anormalidades citológicas para ser detectados en los raspados de la cerviz. Las mujeres con citologías vaginales que sugieren lesiones intraepiteliales escamosas se evaluarían luego, incluso mediante el examen clínico y la colposcopia y la biopsia, para determinar el grado y extensión de cualquier presente CIN y para excluir (o diagnosticar) la presencia de IC. examen de papanicolaou ahora se está integrando con las pruebas para los genotipos de alto riesgo del virus del papiloma humano (VPH HR) que puede ser detectado en la misma muestra de Papanicolaou citológico con captura de híbridos basados en la tecnología líquida II [5]. Todos los grados de NIC se asocian con una alta probabilidad de que la presencia de VPH AR. En las mujeres entre 30 y 65 años la prueba del VPH HR mejora la tasa de detección de CIN 3 o superior al 17-31% en la primera ronda de selección y reduce la incidencia de IC en la segunda ronda de cribado [6], [7], [8], [9]. La prueba del VPH HR ahora también se está integrando en el seguimiento de las mujeres que han sido previamente demostrado tener la infección VPH AR o NIC, ya que la infección persistente por VPH de recursos humanos se asocia con un mayor riesgo para el desarrollo de CIN recurrente e IC [6] , [10]. A pesar de las pruebas de VPH AR puede mejorar la detección de CIN no puede diferenciar entre lesiones CIN que tienen una mayor probabilidad de progresar de los que no lo hacen. Los biomarcadores se han investigado en este sentido, pero aún no han demostrado ser útiles [11], [12], [13], [14]. El tratamiento y el tratamiento para las mujeres con frotis de Papanicolaou anormales es traumático físicamente, emocionalmente y financieramente y, por desgracia, debido a la incapacidad para diferenciar lesiones CIN que tienen una mayor probabilidad de progresión a la IC muchas mujeres todavía superarlo tratada.
a continuación se describe la aplicación de un enfoque combinado usando calorimetría diferencial de barrido (DSC) y espectrometría de masas (MS) para la caracterización de la enfermedad cervical. DSC se usa comúnmente para medir los perfiles de desnaturalización de las biomoléculas, conocidos como termogramas, mediante la supervisión directa de los cambios de calor asociados con eventos moleculares como una función de la temperatura. En condiciones de solución dada, un termograma proporciona una firma única para una determinada proteína que refleja motivos estructurales específicos y las fuerzas moleculares. Recientemente se ha demostrado que la DSC se puede aplicar al análisis de plasma sanguíneo para proporcionar una indicación del estado clínico de un individuo [15], [16], [17], [18], [19], [20], [ ,,,0],21], [22], [23], [24]. El termograma de plasma de individuos sanos refleja la suma ponderada de los perfiles de desnaturalización de las proteínas más abundantes del plasma; Sin embargo, los termogramas de individuos con diferentes condiciones o enfermedades se han cambiado de manera significativa [15], [16], [17], [18]. cambios termograma parecían ser sensible al estado de enfermedad particular y se indica que el DSC plasma podría tener utilidad como un método de cribado de diagnóstico clínico. Los mecanismos para cambios específicos de la enfermedad en los termogramas están actualmente bajo investigación en nuestro laboratorio pero la hipótesis de que reflejan la presencia de biomarcadores de la enfermedad que modifican o interaccionan con las proteínas plasmáticas que ello afecte a sus propiedades de desnaturalización. Tales interacciones biomarcadores apoyarían el concepto "interactoma" que propone que los péptidos de bajo peso molecular presentes en el proteoma del plasma forman complejos con las proteínas plasmáticas más abundantes creación de una red de proteína-proteína y las interacciones péptido-proteína [25]. Aunque la presencia de marcadores biológicos de bajo peso molecular putativo se puede inferir a través de cambios en el termograma de no identificación directa puede ser hecha por este método. Hemos aplicado un enfoque peptidomic MS para investigar la naturaleza de los perfiles termograma plasma asociados con la enfermedad cervical.
MS se ha utilizado como una herramienta para ayudar en la comprensión de la patogénesis de la enfermedad y la generación de biomarcadores candidatos de la enfermedad [ ,,,0],26], [27], [28], [29], [30], [31], [32]. Una aplicación de MS ha sido el análisis cuantitativo y cualitativo de los fragmentos de bajo peso molecular de proteínas encontradas en el plasma y /o en la orina, que se refiere como un enfoque peptidomic [33], con el objetivo de correlacionar la abundancia con la detección o el pronóstico de la enfermedad. Los péptidos observados en estos estudios reflejan el movimiento metabólico de las proteínas de origen con los cambios de abundancia entre los casos (enfermedad) y las condiciones de control relacionadas con una alteración (s) de vida media metabólica catabólico o anabólico normal de la proteína. Estos estudios han peptidomic en algunos casos demostrado con éxito las correlaciones entre las cantidades o patrones de varios péptidos con la enfermedad o la progresión de la enfermedad. Con respecto a la enfermedad cervical, el potencial metastásico de CIN se ha correlacionado con la expresión de tres proteínas, incluyendo la metaloproteinasa de matriz 2 (MMP-2), MMP-9, y de tipo uroquinasa activador del plasminógeno [14]. Debido a la participación principal de las metaloproteinasas de la generación de péptido en la progresión de la enfermedad, esta correlación de CIN podría extenderse al fenotipo peptidomic. Como tal, la presencia de plasma único y /o el perfil (s) péptido urinario se podría establecer por enfoques MS y correlacionarse con perfiles termograma que reflejan la presencia y grado de la enfermedad cervical. Se describen los resultados que demuestran sensibilidad del DSC termogramas con la situación clínica y las pruebas para la asociación de perfiles termograma con interactuando biomarcadores de péptidos identificados por la EM.
Materiales y Métodos
Recogida de muestras
el protocolo de estudio y los procedimientos de consentimiento de los pacientes fueron aprobados por la Universidad de Louisville Junta de Revisión Institucional (IRB#08,0108, 608.03). Las mujeres que asisten a las clínicas de la División de Oncología Ginecológica con demostrada por biopsia carcinoma cervical neoplasia cervical intraepitelial y invasiva fueron elegibles y dieron su consentimiento informado por escrito para su sangre y los tejidos que se introducirán en un repositorio de tejidos (IRB#608.03) y se utilizan para motivo de investigación. El IRB aprobado específicamente el uso de tejidos desde el repositorio de tejido para su uso en este estudio, sin necesidad de consentimiento adicional (IRB#08,0108). Las mujeres se sabe que son VIH positivas no cumplían los requisitos. Las muestras de sangre y orina punto se recogieron de pacientes reclutados durante su visita a la clínica inicial en el momento de la evaluación y antes de recibir la terapia. Las muestras de orina se dividieron en alícuotas y se almacenan inmediatamente a -80 ° C hasta su análisis. Se extrajo sangre en 5 ml de la punta morada (plasma; K
2-EDTA anticoagulante) tubos al vacío. Los tubos se mezclaron suavemente por inversión 8-10 veces inmediatamente después de la recogida de sangre para distribuir uniformemente el aditivo anticoagulante seguido de centrifugación a 3200 rpm durante 10 minutos (BD-Clay Adams compacto II de centrífuga). plasma separado se aspiró cuidadosamente para evitar la hemólisis o contaminación de las fases separadas de la sangre, se dividió en alícuotas y se almacenó inmediatamente a -80 ° C hasta su análisis. muestras de sangre de control y orina fueron recogidas bajo los mismos procedimientos de estudio de voluntarios sanos sin antecedentes de frotis de Papanicolaou anormales o cáncer. Como el anterior, el protocolo y los procedimientos del estudio de consentimiento fueron aprobados por la Universidad de Louisville Junta de Revisión Institucional (IRB#08,0108, 608.03). Todos los voluntarios dieron por escrito, el consentimiento informado para la sangre y los tejidos que se entró en un repositorio de tejidos (IRB#608.03) y se utiliza para fines de investigación. El IRB aprobado específicamente el uso de tejidos desde el repositorio de tejidos (IRB#608.03) para su uso en este estudio, sin necesidad de consentimiento adicional (IRB#08,0108). alícuotas de muestras se descongelaron para el análisis y el resto se descartan. Toda la manipulación de las muestras y modelo de los residuos se ha ajustado a los procedimientos de patógenos sanguíneos de OSHA. Todas las muestras tomadas para el estudio fueron desprovistos de identificación y se almacenan en la Oncología Ginecológica Banco de Tejidos del Centro de Cáncer de Brown James Graham. demográfica asociada y la información clínica fue recogido por personal del estudio clínico y almacena de forma segura en el equipo de estudio. El banco de tejidos fue aprobado por la Universidad de Louisville Junta de Revisión Institucional (IRB#608,03) y era totalmente compatible con HIPAA. Las muestras proporcionadas al personal de estudio básicos de ciencia (NCG, MLM, ABJ, JBK, JBC) para los estudios de DSC y MS fueron codificados por el número de colección banco de tejidos. De esta forma especímenes fueron desprovistos de identificación y cegados por tanto el estado de la enfermedad patológica demográfica y la recopilación de datos imparcial. situación demográfica y la enfermedad se presentó posteriormente para la clasificación de datos y la interpretación.
DSC Estudios
Preparación de muestras para estudios de DSC.
Las muestras de plasma (100 l) se dializa frente a un patrón tampón fosfato (KH 1,7 mM
2 PO
4, 8,3 mM K
2HPO
4, NaCl 150 mM, citrato 15 mM de sodio, pH 7,5) durante 24 horas a 4 ° C con el fin de lograr normalización de las condiciones de tampón para todas las muestras. muestras de plasma congeladas se descongelaron durante la noche a 4 ° C el día antes de la diálisis. En la mañana de la diálisis, las muestras se cargaron en unidades de mini diálisis Slide-A-Lyzer (MWCO 3500; Pierce, Rockford, IL) que había sido equilibrada frente a tampón de diálisis durante la noche. Con base en el precio y la fiabilidad que rutinariamente vuelto a montar las unidades de diálisis lavadas sustitución de la membrana de diálisis original con tamaño de corte de piel de serpiente-plisado Diálisis Tubing (Pierce, Rockford, IL). Las muestras se dializaron frente a 1 L de tampón de fosfato con cambios de tampón, después de tres horas de diálisis, a continuación, después de dos períodos de cuatro horas con un periodo de diálisis durante la noche final. Las muestras se recuperaron de diálisis y se filtró para eliminar las partículas utilizando un filtro de tubo de centrífuga Spin-X (0,45 m de acetato de celulosa; Corning Incorporated, Corning, NY). El tampón de diálisis final también se filtró (0,2 micras polietersulfona; Pall Corporation, Ann Arbor, MI).. Y se utiliza para todas las diluciones de la muestra y como solución de referencia para los estudios de DSC
Análisis DSC
datos de DSC fueron recogidos con un instrumento MicroCal VP-DSC capilar con inyector automático integrado (MicroCal, LLC, Northampton, MA, ahora parte de GE Healthcare). calibración eléctrica de la señal de diferencia de poder y la calibración de la temperatura utilizando estándares de temperatura de hidrocarburos se realizaron como parte del mantenimiento anual instrumento fabricante. las especificaciones de rendimiento del fabricante para los estándares de temperatura son ± 0,2 ° C. el rendimiento del instrumento provisional se evaluó a través de los patrones biológicos lisozima y ARNasa. las especificaciones de rendimiento del fabricante para los estándares biológicos son ± 0,5 ° C. muestras de plasma dializado se diluyeron 25 veces para obtener una concentración de proteína adecuado para el análisis DSC. Las muestras y dializado se transfirieron a placas de 96 pocillos y luego se cargan en el inyector automático instrumento termostatizado a 5 ° C hasta su análisis. Se requieren volúmenes de muestra de 400 l para proporcionar un volumen suficiente para la carga del capilar instrumento y asegurar un llenado adecuado de la zona de detección térmica 135 l. exploraciones de DSC se registraron a partir de 20 ° C a 110 ° C a una velocidad de barrido de 1 ° C /min con un termostato pre-scan de 15 minutos, el modo de retroalimentación mediados y un período de filtración de 2 segundos. Se obtuvieron exploraciones de DSC duplicados para cada muestra de plasma. Para cada conjunto experimento, se procesan por lotes muestras para asegurar el análisis se completó dentro de una ventana de siete día después de la descongelación inicial de muestras. En el desarrollo de nuestro procedimiento experimental que hemos evaluado cuidadosamente barridos de muestra y de amortiguamiento en función de la secuencia de ejecución, instrumento de lavado de cámara y protocolo de limpieza, y el tiempo desde la preparación. Hemos examinado exploraciones tampón recogidas al principio y al final de un conjunto de muestras y después de las exploraciones de muestra individuales o consecutivos y determinado reproducibilidad aceptable y una limpieza eficaz de las cámaras de instrumentos. Hemos comparado las exploraciones de muestras duplicadas recogidos después de una exploración tampón o muestra y se encontró que es posible recoger barridos de muestra consecutivos después de una extensa enjuague de las cámaras de instrumentos, sin efecto sobre el perfil termograma. rutinariamente Se compararon las exploraciones de muestras duplicadas recogidos en diferentes secuencias de ejecución y en diferentes puntos de tiempo para asegurar el perfil termograma era reproducible. Se analizaron
datos de DSC usando Origen 7 (Origin Corporation, Northampton, MA). datos de DSC primas se corrigieron para la línea de base instrumental de la resta de una exploración de referencia tampón adecuado. exploraciones Corregido se normalizaron para la concentración de proteína total que se determinó colorimétricamente usando el kit de ensayo de proteínas bicinconínico ácido y el procedimiento de microplacas de Pierce (Pierce, Rockford, IL), con modificaciones menores en el protocolo del fabricante. Las lecturas de absorbancia se tomaron usando un lector de microplacas absorbancia Tecan Sunrise (Tecan EE.UU., Research Triangle Park, Carolina del Norte). Tras la normalización, las exploraciones de DSC de plasma se corrigieron para las líneas de base distintos de cero mediante la aplicación de un ajuste de línea de base lineal. La elección de una corrección de línea de base de muestra adecuado se complica por la presencia de una región limitada de la línea de base después de la transición seguido de eventos de agregación y precipitación se producen después de la envolvente de la desnaturalización térmica. Hemos evaluado todas las opciones de corrección de línea de base disponibles en el software de análisis y se encontró la opción de línea de base lineal para dar los resultados más consistentes cuando se prueba en mediciones repetidas, diferentes muestras y determinaciones independientes de usuarios. Aceptamos que nuestro enfoque podría tener limitaciones, pero ha seleccionado el método de corrección de línea de base más consistente que se puede aplicar en todos nuestros estudios. termogramas finales se representan como el exceso de capacidad de calor específico (cal /° CG) frente a la temperatura (° C).
El análisis estadístico de los datos de DSC.
El examen de todos los datos termograma reveló que el rango de temperatura 45-90 ° C abarcó el perfil de desnaturalización completa para todas las muestras y las exploraciones fueron truncados a este rango para todos los análisis posteriores. La comparación cuantitativa de termogramas se logró mediante el cálculo de un número de la forma y de la característica métricas. Parámetros considerados fueron el área total del pico; altura del pico; anchura del pico a media altura; temperatura del pico máximo (T
max); capacidad calorífica de la transición principal en el intervalo de 60-65 ° C [C
p
ex (pico 1)]; capacidad calorífica de la transición secundaria a 68-72 ° C [C
p
ex (pico 2)]; relación de la primera y segunda amplitudes de transición [C
p
ex (pico 1)] /[C
p
ex (pico 2)]. Debido a la complejidad de las formas termograma, un parámetro adicional se calcula para proporcionar una medida de la distribución de la superficie del perfil de desnaturalización con respecto al eje de temperatura. Se determinó la primera temperatura momento (T
FM) de acuerdo con la ecuación 1: (1)
Los termogramas se agruparon por el estado de la enfermedad patológica en cinco grupos: controles sanos, LSIL (CIN 1), HSIL (CIN 2, CIN 3), primera etapa IC (etapa I) y avanzado IC (fase II-IV). termogramas de medias con desviaciones estándar fueron determinados para cada grupo de estudio.
Las diferencias en la forma y termograma de características métricas se evaluaron mediante métodos no paramétricos. En primer lugar, las cartas de la caja se utilizaron para comparar diferencias en la distribución entre cada grupo de estudio. diagramas de cajas fueron construidos con la siguiente forma: la parte inferior y superior de la caja representaron el 25
º y 75
percentil, respectivamente, y el percentil 50 fue representada por la banda en el medio de la caja. La extremos inferior y superior de los bigotes denotan el 5
º y 95
º percentiles, respectivamente. Las líneas horizontales indican los valores mínimo y máximo de todos los datos y las cruces representan el 1
ª y 99
º percentiles. La media se denota por una plaza abierta. Las diferencias en las métricas termograma para cada grupo clínico fueron las pruebas de significación utilizando la prueba no paramétrica de Mann-Whitney para las medianas desiguales [34].
MS Estudios
Diseño experimental de los estudios de EM.
El orden de manipulación de muestras y análisis (número de muestra, para la preparación de muestras, la liofilización, MALDI-TOF detección de placa, y adquisición de datos TOF) se asignó al azar para minimizar la variabilidad sistemática durante la adquisición de datos. Las muestras se procesaron para aislar péptidos libres (fracción 1 o FX1), aislar péptidos que se unen a las proteínas plasmáticas totales (fracción 2 o FX2), aislar péptidos liberados durante la immunodepletion de albúmina e IgG del plasma (Fracción 3 o FX3), y aislar péptidos unidos selectivamente a las proteínas muy abundantes, albúmina e IgG (Fracción 4 o FX4). Las muestras fueron vistos por triplicado, los datos de MALDI-TOF MS adquiridos y de señal promedio a través de los tres puntos. Análisis de los datos promediados para diferencialmente abundantes péptidos se llevó a cabo utilizando el análisis de componentes principales (ACP) y la prueba t de Student, seguido de la revisión manual de las intensidades de iones de péptidos seleccionados. Manual de revisión se realizó para garantizar que los péptidos no fueron excluidos como resultado de la normalización de la línea de base incorrecta o sustracción de línea de base.
manipulación de las muestras.
Las muestras se descongelaron una vez para alícuotas en volúmenes de 100 l durante almacenamiento a -80 ° C y una vez para la preparación de muestras para la cuantificación de péptidos. Las muestras se analizaron usando dos alícuotas separadas y partes alícuotas individuales se analizaron por triplicado. Las muestras de plasma se agotaron de albúmina e IgG utilizando columnas de afinidad de giro disponibles en el mercado (Sartorius N. A. Inc, Edgewood, NY) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los péptidos no unidos a las proteínas del plasma se aislaron utilizando una modificación del método de precipitación de Chertov et al [35]. Los péptidos unidos a la albúmina y la IgG se recuperaron de la resina de afinidad de albúmina /IgG por el ácido de extracción con ácido acético al 10%. Péptidos unidos a las proteínas plasmáticas fueron recuperados de las proteínas en disolventes orgánicos coagulado por ionización de sal o ácido. soluciones de péptidos recuperados se liofilizaron y se resuspendieron en 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) antes del análisis MALDI-TOF MS. las muestras de orina se descongelaron spot de -80 ° C en hielo. Las muestras de orina se centrifugaron a 1500 x g durante 15 minutos a 4 ° C para sedimentar los restos celulares y partículas. péptidos de orina fueron aislados utilizando Amicon Ultra-4 (10.000 NMWCO) (Millipore, Billerica, MA) como se describe anteriormente [26].
MS de aislados de plasma y orina péptidos.
Todas las muestras se desalaron y se concentraron para el análisis MALDI-TOF MS usando C18 ZipTips (Millipore, Billerica, MA). Los péptidos se eluyeron de la resina C18 usando matriz de la muestra, 5 mg ml /ácido 4-hidroxi-α-cianocinámico (α-CN), y directamente manchado por triplicado en la placa MALDI. Los espectros de masas de iones positivos MALDI-TOF fueron adquiridos como se describe [36]. Los péptidos seleccionados para estudios posteriores se analizaron mediante el AB4700 en modo TOF /TOF e interpretación de datos de fragmentación utilizando la mascota (Ciencia Matrix, Boston, MA) ver1.9 como se describe anteriormente [26]
El análisis estadístico de la EM. datos.
los archivos de datos (.t2d) fueron exportadas de la AB4700 Proteómica Analizador e importados en el software MarkerView. Este software se puede encontrar picos espectrales de los límites de tolerancia de masa definidos por el usuario o espectros bin vía tamaños definidos por el usuario bin. Además, el usuario puede definir las respuestas de señal mínimo y máximo, lo que ayuda en el tratamiento de conjuntos de datos del espectro de masas de alta dimensión. Los datos fueron analizados mediante el binning de datos, lo que permitió para la sustracción de línea de base. los datos de expresión de péptidos se examinaron en primer lugar utilizando PCA. Después de la importación de datos, los datos fueron tratados previamente con cualquiera de los datos-medias centradas o Pareto de escala antes de la PCA sin ponderación y. PCA es un método de análisis de datos exploratorio que reduce la complejidad de los datos, mientras que conserva su variabilidad, mediante la transformación de los datos en un nuevo grupo de variables, que se refiere como los componentes principales. PCA se utilizó para obtener una evaluación objetiva de si o no el MALDI-TOF MS auto-ordenados en grupos que corresponden a pacientes con CIN, cáncer cervical y los controles sanos sin cáncer CIN /cervical de datos de expresión de péptidos. la expresión diferencial de proteínas y péptidos se comparó mediante la prueba t no pareada, dos colas de Student usando espectros MALDI alineados y el área de grupo de picos promedio de péptidos individuales. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró significativo. Se seleccionaron los péptidos expresados diferencialmente por análisis de MS en tándem con el AB4700 Proteómica Analyzer.
Resultados
muestras de plasma de 67 mujeres que asisten a la clínica de la División de Oncología Ginecológica y 4 voluntarios sanos fueron recogidos para su análisis DSC. El desglose de los números de muestra fue el siguiente: control = 4, CIN 1 = 3, CIN 2 = 4, CIN 2-3 = 3; CIN 3 = 22, IC = 35 (FIGO Etapa I = 14, II = 10, IIIb = 7, IV = 4); rango de edad = 18-69 años (media 38,7 años) (Tabla S1). información demográfica y clínica completa, incluyendo el estado de CIN y IC confirmado por biopsia, se ha recopilado para todos los especímenes de los miembros del equipo de estudio clínico. Las muestras proporcionadas con el equipo básico de estudio de la ciencia fueron desprovistos de identificación y carente de toda la información demográfica y clínica. análisis DSC de muestras de plasma produjo, termogramas duplicados de referencia corregida normalizados para cada muestra. En esta etapa, no se proporcionó información clínica y demográfica para el equipo de ciencia básica para su posterior análisis.
Hemos demostrado previamente que el termograma de plasma obtenido de individuos sanos es representativa de la desnaturalización térmica de las proteínas plasmáticas más abundantes ponderada en función de sus medios de las concentraciones plasmáticas normales [18]. Para el estudio actual, los termogramas de plasma obtenido de voluntarios sanos fueron promediados para obtener un perfil específico del estudio 'control sano ", que da cuenta de los protocolos de recogida y manipulación específicos empleados en el estudio actual. A modo de comparación, el termograma media publicado previamente se obtuvo a partir de 15 individuos sanos: 9 hombres y 6 mujeres (11 afroamericanos y caucásicos 4) de edades comprendidas entre 22 y 50 años (media 37,0 años). El termograma media tiene una superficie de 5,02 ± 0,23 cal /g y un primer momento la temperatura (T
FM) de 67,4 ± 0,8 ° C. El perfil específico del estudio 'control sano' obtenido a partir de 4 mujeres de raza blanca con un rango de edad similar a la del estudio anterior (25-50 años, con una media de 39,3 años) se compara bien con área similar (4,94 ± 0,19 cal /g) y T
Los valores de FM (66,3 ± 0,3 ° C) guía
Los termogramas se promediaron dentro de los cinco grupos clínicos:. de control, LSIL, HSIL, Etapa I y Etapa II-IV. Los termogramas medias son distintas unas de otras y muestran un cambio progresivo en forma de perfil (Figura 1A). La transición principal en el intervalo de 60 a 65 ° C se vuelve progresivamente más baja con un aumento de la amplitud de la segunda transición alrededor de 70 ° C. Cada grupo clínico se examinó el efecto de los factores demográficos del paciente, específicamente la edad, el origen étnico, el tabaquismo y la paridad sin efecto significativo encontrado en los termogramas medias. La varianza asociada con cada perfil de grupo se examinó a través del cálculo de desviaciones estándar a cada temperatura y la construcción de un gráfico de la desviación estándar de la capacidad de calor como una función de la temperatura (Figura 1B). El grupo de control sano muestra la varianza más pequeña en todo el rango de temperatura. Los otros grupos clínicos muestran mayor varianza asociada principalmente con la importante transición ~ 65 ° C, así como la segunda transición ~ 70 ° C y sus hombros de temperatura más alta. El termograma varianza observada es similar a nuestras observaciones anteriores [18] y refleja tanto la variación clínica esperada en los niveles de proteína de plasma, así como la enfermedad asociada modificaciones de las proteínas.
La media de perfiles termograma de exceso de capacidad de calor específico (C
p
ex) frente a la temperatura (Panel A) y la desviación estándar (Panel B) de cada grupo clínico: controles (negro); LSIL (rojo); HSIL (verde); etapa temprana IC [FIGO Etapa I] (azul); e IC avanzada [FIGO Etapa II-IV] (cian). Termogramas muestran un cambio progresivo hacia mayores temperaturas de desnaturalización con el aumento de la carga de enfermedad. parcelas Diferencia de grupo clínico termogramas comparados con el grupo control (Panel C) muestran los picos de diferencia negativa ~62 ° C y aumento de la transferencia y la magnitud de más alta temperatura picos diferencia positiva. Estos son la hipótesis de reflejar la interacción de los componentes específicos de la enfermedad con abundantes proteínas plasmáticas, principalmente albúmina, con la estabilización térmica resultante y la alteración de los perfiles termograma de plasma.
Los cambios en los perfiles termograma asociados con la carga de morbilidad fueron examinados a través DSC parcelas de diferencia de que reflejen los cambios en el grupo termogramas en relación con el grupo de control sano (Figura 1C). Para cada grado CIN o etapa IC, hubo un pico de diferencia negativa centrada ~62 ° C con una mayor temperatura picos diferencia positiva. Los picos diferencia positiva desplazan a mayor temperatura y el aumento en magnitud con el aumento de la carga de enfermedad. El grupo LSIL no sigue esta tendencia en los picos diferencia positiva; esto podría reflejar una mala definición de este grupo clínico dados los bajos números de muestra (n = 3) disponibles para la evaluación. Si bien estos cambios en el perfil termograma siguen siendo objeto de investigación en nuestro laboratorio sugieren que la estabilización térmica de la proteína (s) de plasma con un perfil de desnaturalización que aparece ~62 ° C.