Extracto
Para analizar simultáneamente mutaciones y los niveles de expresión de múltiples genes en una plataforma de detección, se propone un método denominado "sonda de amplificación amplificación digital dependiente de ligado multiplex junto con hidrogel de talón-array" (MLPA-DABA) y lo aplicó para diagnosticar el cáncer colorrectal (CCR). células y tejidos de CRC se tomaron muestras para extraer el ácido nucleico, realizar MLPA con sondas de secuencia marcada, lleve a cabo la reacción en cadena de la polimerasa emulsión digital (PCR), y producir un hidrogel de talón-array para inmovilizar perlas y formar una sola capa de grano en la matriz. Después de la hibridación con sondas fluorescentes, el número de cuentas de colores, lo que refleja la abundancia de los genes expresados y la tasa de mutación, se contó para el diagnóstico. Sólo los granos rojos o verdes se produjeron en las fichas en las muestras mezcladas, lo que indica el éxito de una sola molécula de PCR. Cuando una muestra de una sola fuente se analizó utilizando sondas de MLPA mixtos, cuentas de un solo color se produjeron, lo que sugiere la alta especificidad del método en el análisis de CRC mutación y la expresión génica. En el análisis de la expresión de genes de un tejido de un paciente CRC CRC, el porcentaje mutante era 3,1%, y los niveles de expresión de genes relacionados con el CRC eran mucho más altos que los del tejido normal. El altamente sensible MLPA-DABA tiene éxito en la cuantificación relativa de mutaciones y expresiones de genes de células exfoliadas en muestras de heces de pacientes con CRC en la misma plataforma chip. MLPA-DABA hidrogel acopla con perlas de matriz es un método prometedor para el diagnóstico no invasivo de la CRC
Visto:. Huang H, Li S, L Sun, Zhou G (2015) Detección digital de múltiples mutantes minoritarios y niveles de expresión de múltiples genes relacionados con el cáncer colorrectal usando digital-PCR Junto con Bead-array. PLoS ONE 10 (4): e0123420. doi: 10.1371 /journal.pone.0123420
Editor Académico: Ken Mills, la Universidad Queen de Belfast, Reino Unido
Recibido: 17 de diciembre de 2014; Aceptado: February 23, 2015; Publicado: 16 Abril 2015
Derechos de Autor © 2015 Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
financiación:. la Fundación Nacional de Ciencias de China (subvención Nº 21305069 y 21275161) proporcionó los fondos para la decisión de publicar y la preparación del manuscrito. El proyecto de formación de jóvenes talentos en la provincia de Jiangsu Hospital de Salud Materno Infantil (FRC201302) proporcionó los fondos para la recolección y análisis de datos. de la provincia de Jiangsu Ciencia Clínica & amp; Proyecto Especial Tecnología (SBL2012061) proporcionó los fondos para el diseño del estudio
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común en hombres y el segundo cáncer más común en las mujeres en todo el mundo [1]. En China, el CRC es uno de los cánceres malignos más comunes y tiene una alta tasa de mortalidad. Tradicionalmente, el diagnóstico CRC utiliza el sistema de clasificación de Dukes, que clasifica el cáncer en etapas A, B, C, o D. Los datos relacionados muestran que las tasas de supervivencia a los 5 años de los pacientes con CCR postoperatorias son 81-85% en la fase A, 64- 78% en la fase B, 27-33% en la etapa C y 5-14% en la etapa D; Por lo tanto, el diagnóstico precoz del CCR y posterior tratamiento puede aumentar de manera efectiva las tasas de supervivencia. pruebas de detección temprana son la clave para el diagnóstico precoz del CRC y la mejora de las tasas de supervivencia [2]. pruebas de cribado de CCR incluyen procedimientos tales como una colonoscopia, examen de sangre oculta, y fibersigmoidoscopy [3]. Aunque estos métodos tienen buenos resultados clínicos, también tienen inconvenientes. Por ejemplo, las técnicas invasivas pueden causar fácilmente una hemorragia y perforación, y la sensibilidad y especificidad de algunos métodos son insuficientes; Por lo tanto, es necesario para el diagnóstico precoz del CCR el desarrollo de un enfoque simple, no invasiva con alta sensibilidad y especificidad.
Los recientes avances rápidos en biología molecular hacen que sea posible llevar a cabo el diagnóstico no invasivo precoz del CCR mediante el análisis de sensibilidad células de descamación en las muestras de heces de pacientes con CRC. Debido a que la oncogénesis de CRC, que implica la interacción de múltiples genes, es un proceso de múltiples etapas [4], tales como la activación de proto-oncogenes y la inactivación de genes supresores de tumores, el método de detección de un solo gen con frecuencia errores de diagnóstico la enfermedad; Por lo tanto, la detección combinada de múltiples genes es útil para aumentar la tasa de diagnósticos positivos de la enfermedad. La aparición y el desarrollo de CRC a menudo acompaña a la mutación de genes y cambios en la expresión de genes [5]; por lo tanto, el diagnóstico CRC implica la detección de estas actividades [6-11]. Aunque la técnica de secuenciación de ADN es un método clásico por el que se detectan mutaciones de genes, no se puede analizar muestras en las que el número de mutaciones es & lt; 20% [12]. Para la detección de mutaciones de genes en niveles bajos en las primeras etapas del cáncer, un método /basado en la ligasa de exploración mutación EndoV se desarrolló con un límite de detección de 1,0% [13]; Sin embargo, el método es incapaz de detectar mutantes (MutS) a un nivel mucho más bajo, debido a su análisis cuantitativo basado en la señal analógica. Aunque el método de análisis digital, llamado BEAMing [14,15], fue desarrollado para detectar MutS a un nivel ultra bajo (0,1% de los MutS), el citómetro de flujo utilizado en el proceso es caro y sólo se detecta un gen en una juicio. Debido a su alta sensibilidad y alta especificidad, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) se considera que es el mejor método por el cual la expresión del gen pueden ser analizados; sin embargo, debido al número limitado de marcadores fluorescentes, qPCR no es adecuado para el análisis de múltiples genes en la misma reacción. A pesar de microarrays de ADN se puede analizar simultáneamente múltiples genes, el problema sigue siendo de un bajo límite de detección y el bajo rendimiento cuantitativo para el análisis de los genes relacionados con el cáncer expresadas en niveles bajos en el diagnóstico precoz del CCR. Por otra parte, si bien el análisis combinado de mutaciones y la expresión de genes relacionados con el cáncer puede aumentar la precisión y la sensibilidad del diagnóstico CRC, casi todas las técnicas de memoria aplican a un solo campo de la detección de mutaciones o bien la expresión génica.
A continuación, hemos propuesto un método denominado "sonda de amplificación amplificación digital ligación dependiente de multiplex junto con hidrogel de talón-array" (MLPA-DABA) por el cual las mutaciones y los niveles de expresión de múltiples genes a niveles bajos pueden analizarse simultáneamente en una plataforma de detección. Basado en el trabajo anterior [3,16,17], la plataforma técnica de MLPA-DABA se desarrolló mediante la mejora de los siguientes tres aspectos: en primer lugar, MLPA, en lugar de PCR o PCR multiplex objetivo enriquecida (Tem-PCR) convencional, se utilizó para preparar plantillas con fines comunes; segundo, las mutaciones y las expresiones de genes múltiples, en lugar de sólo uno o el otro, se midieron simultáneamente con la plataforma técnica cambiando el diseño de sondas específicas de MLPA; En tercer lugar, sin colorantes y sondas de MLPA de genes específicos, en lugar de alto costo y sondas fluorescentes específicos de genes, fueron utilizados para etiquetar múltiples MUTS y los genes relacionados con el cáncer. Los problemas de números inciertos de desoxinucleótidos trifosfato marcados con colorante (dNTP) incorporados en una cadena de ADN y la competencia entre la reacción de extensión y reacción de hibridación se hace referencia en trabajos anteriores fueron resueltas; Por lo tanto, se alcanzaron la alta especificidad, bajo coste, y alta estabilidad del método. El método fue aplicado con éxito para el diagnóstico CRC mediante el análisis de la expresión de cinco genes (
β-actina
,
C-myc
,
H-ras
,
CD44v6
,
Cox-2
, y
N-ras
) y tres loci de mutación en los genes APC (codones 1406, 1338 y 1356) en los tejidos de CRC, las células de CRC, y las heces muestras de pacientes con CRC. Los resultados muestran que el método puede ser una herramienta poderosa en el diagnóstico precoz del CCR.
Materiales y Métodos
Reactivos
éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), activado por sefarosa columna y dNTPs afinidad HP se compraron de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).
Taq ADN polimerasa
era de Promega (Madison, WI). DC 5225C Formulación Aid y DC 749 Fluid se adquirieron de Dow Chemical Co. (Midland, MI). Aceite de silicona Ar20 se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO). Superíndice III transcriptasa inversa fue adquirido de Invitrogen (Carlsbad, CA). Amplicase se adquirió de Epicenter (Madison, WI). Otros productos químicos eran de un grado comercialmente extra-puro. Todas las soluciones se prepararon con agua desionizada y esterilizada.
Secuencias de cebadores y sondas
El cebador modificado con amina (5'-NH
2-TTT TTT TTT TCC ATC TGC TGT GTG CGT CGC-3 ') fue sintetizado por Takara Biotecnología Co., Ltd (Dalian, china). Todos los demás cebadores fueron sintetizados por Invitrogen Inc. (Shanghai, China). Un par de cebadores comunes, comunes-1 (5'-CCA TCT GTT GCG TGC GTG TC-3 ') y común-2 (5'-AAC AAC TGG TCA GGC GAA TC-3') se utilizó para amplificar productos de MLPA. Las sondas de MLPA de genes específicos para la detección de mutantes se listan en la Tabla 1. Las sondas de MLPA de genes específicos para el análisis de la expresión génica se enumeran en la Tabla 2. Las sondas de fluorescencia para el grano-decodificación fueron 5'-Cy3-TGC CTT GTC ATT CGG- 3 'y 5'-Cy5-GGA AAA GAG CCA A-3'. El cebador de transcripción inversa era oligo (dT) 15.
Preparación de la plantilla
Las muestras de células de tejido y CRC CRC se obtuvieron del Hospital del Cáncer de Jiangsu (Nanjing, China) . La recolección de tejidos, células y las heces de los participantes fue aprobado por el comité de ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Nanjing y las participantes proporcionaron su consentimiento informado por escrito. ARN totales se extrajeron a partir de tejidos de pacientes con CRC y células CRC utilizando RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Alemania) según las instrucciones del fabricante. El ARN extraído se determinó por electroforesis en gel se realiza en un gel de agarosa al 2% y un (Naka Instruments, Japón) espectrofotómetro UV-VIS. El ADNc de primera cadena se sintetizó a partir de oligo (dT) 15 cebadores mediante el uso de superíndice III transcriptasa inversa, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
ADN genómico fue extraído de las células y tejidos por extracción con fenol-cloroformo. Antes de la extracción, las células se lavaron dos veces con solución salina normal y se cortaron los tejidos y se homogeneizaron en 1 ml de solución salina normal. El ADN extraído se diluyó en tampón TE y se determina por el espectrofotómetro UV-VIS.
heces de un paciente CRC en Cancer Hospital Jiangsu (Nanjing, China) se homogeneizó en tampón ASL y se extrajo con un ADN QIAamp Mini Stool Kit (Qiagen, Alemania).
Multiplex sonda de amplificación amplificación digital ligadura dependiente
Después de la adición de los pares de sondas (100 fmol de cada uno) y 1,0 U Ampligase, la mezcla de reacción que contiene el muestras de ADN o de ADNc se incubó a 94 ° C durante 1,0 minutos, seguido de 60 ° C durante 4,0 min; este ciclo se repitió 10 veces.
emulsión Digital PCR (emPCR)
Las perlas empaquetadas (10 mmol NHS sitios /ml) a partir de 1 ml de columna de afinidad de Sepharose HP activada con NHS fueron retirados de la columna y dispersa en isopropanol. Después se lavó con HCl 1 mM para eliminar a fondo isopropanol, las perlas se activan por HCl enfriado en hielo 1 mM a 4 ° C durante 1 h. A continuación, las perlas activadas y cebadores modificados con amina (10 mM) se incubaron en el tampón de unión (0,5 M NaCl, 0,2 M NaHCO
3, pH 7,5) a 20 ° C durante 5 h. Las perlas se mantienen lejos de la sedimentación en la incubación. Después de la incubación, las perlas de cebadores inmovilizados se almacenaron a 4 ° C para su uso.
El sistema de mezcla emPCR contiene fase oleosa y fase acuosa. La fase acuosa se divide en dos partes, Mock mezcla de amplificación y la mezcla de reacción de PCR. Los productos de ligación se utilizaron como plantillas para la PCR. En primer lugar, para hacer la emulsión más estable, 225 l de mezcla de amplificación maqueta (1 x Promega
Taq Buffer
, MgCl 2 mM
2, 0,1% de BSA y 0,01% de Tween-80) se homogeneizó con 375 l de aceite de emulsión (40% (w /w) DC 5225C Formulación Aid, 30% (w /w) DC 749 Fluid y 30% (w /w) de aceite de silicona AR20) por un microstir-barra magnética a 1200 rpm durante 5 min en un vial de 5 ml. En segundo lugar, 200 l de la mezcla de reacción PCR (1 x Promega
Taq Buffer
, MgCl 2 mM
2, 0,5 mM de mezcla de dNTP, 0.125 U /ml
Taq ADN polimerasa
, 0,1 % de BSA, 0,01% de Tween-80, 0,06 mM cebador común-2 y 0,6 mM de cada uno de comunes 1-cebadores), se añadieron perlas de imprimación recubierto y las plantillas en el vial y después el vial se agitó a 1500 rpm durante 3 min para mezclar bien las emulsiones. Las emulsiones se dividen en partes alícuotas con 100 l cada uno en 8 de PCR-tubos. En tercer lugar, el termociclado se realizó en PTC-225 Peltier Thermal Cycler (MJ RESEARCH, INC.) A una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 3 min, luego 40 ciclos (94 ° C, 58 ° C y 68 ° C durante 30 s , 60 s, 90 s cada uno) para la amplificación y 13 ciclos (94 ° C y 58 ° C durante 30 s, 360 s cada uno) para la hibridación y extensión.
digital grano las contando con auto-producido Microesfera hidrogel
matriz
Después de la amplificación, las emulsiones se descompone mediante la adición de isopropanol. Las emulsiones con isopropanol se filtraron a través de una membrana de microporos 25 mm de diámetro y las perlas fueron atrapados en la membrana. Después de que los granos en la membrana se deseaban con isopropanol, 80% de etanol en solución (4,0 mM Tris, pH = 7,5), y 0,1% de Tween 20, que se recuperaron en 1.0 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). DNA (dsDNA) perlas inmovilizadas se trataron con NaOH 0,1 mM durante 5,0 min para preparar ADN monocatenario (ssDNA) perlas inmovilizadas. Después de eliminar el sobrenadante, las perlas se lavaron dos veces con ddH
2O y se almacenan en la solución. Se prepararon
diapositivas modificados Acryl según Xiao et al [18]. Los portaobjetos de microscopio (Shanghai Jinglun Industrial Glass Co., Ltd., Shanghai, China) se limpiaron por inmersión en ácido nítrico acuoso al 10% durante 2,0 h
.
El hidrogel de talón-array se preparó añadiendo que las perlas una solución de monómero de acrilamida y en portaobjetos acrílicos modificados e inmediatamente cubren con una hoja de cubierta (20 x 20 mm) para sujetar la capa de una sola perla. Después de la copolimerización, que se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 10 min, la hoja de la cubierta se retiró cuidadosamente desde el hidrogel. Las sondas de fluorescencia (1,0 pmol /l) se hibridaron con ssDNA sobre las perlas en el gel de poliacrilamida a 40 ° C durante 1,0 h. Para eliminar las sondas libres y no coincidentes desde el chip gel, las diapositivas de la sonda hibridada se sometieron a electroforesis a 4,0 ° C bajo 50 V para 5,0 min en 1 x Tris /tampón borato /EDTA. Después de lavar con agua, imágenes de las diapositivas se realizaron utilizando el LuxScanner (CapitalBio Corporation, Beijing, China). Finalmente, la imagen de barrido del cordón-array usado como entrada al Genepix Pro 4.0 para contar los granos del color en la matriz.
Resultados y Discusión
Principio
Dirigido a manera simultánea el análisis de múltiples mutaciones y la expresión de múltiples genes, un MLPA enriquecido con objetivo se combinó con emPCR basado en perlas para la amplificación de una sola molécula multiplex. Los protocolos del ensayo se muestran en la figura 1 y comprenden las siguientes etapas:. Preparación plantilla, la emulsificación, la amplificación de un solo molecular, demulsification, la preparación de hidrogel de talón-array, la hibridación de la sonda, y el recuento de talón
El ensayo comprende los siguientes tres pasos: (1) de MLPA para preparar las plantillas etiquetados con secuencias universales; (2) emulsión (em) PCR para la preparación de perlas recubiertas con amplicones generados a partir de una sola molécula de productos de MLPA; y (3) del talón de decodificación por hibridación de sondas marcadas con Cy5 universales y sondas marcadas con Cy3 universales. Si un cordón de muestra de color verde, los amplicones recubiertos en la perla deben ser amplificadas a partir de plantillas MUT u objetivos de los genes relacionados con el CRC, mientras que un cordón rojo significa que las plantillas de tipo salvaje o blancos de los genes de limpieza.
en primer lugar, el ADN y ADNc se utilizaron como los objetivos en MLPA para preparar las plantillas calificado para emPCR, que es una técnica de PCR digital de gran precisión en las que hay una reacción para la amplificación de una molécula de realizar la amplificación de una sola molécula. En la detección de mutaciones, la ligadura necesita tres sondas para loci uno, a saber, la "sonda de izquierda", "derecha sonda 1" y "2 sonda correcta". Hay dos partes en la sonda de la izquierda y tres piezas en cada una de las dos sondas adecuadas. Las dos partes de la sonda de izquierda son una cola común en el extremo 5 'para el suministro de un sitio de cebado común necesario en la posterior amplificación PCR y una secuencia específica de gen en el extremo 3' para recocer el objetivo. Las sondas adecuadas contienen una secuencia de gen específico con un sitio de mutación de interés en la primera base de el extremo 5 ', una secuencia de código específica para la hibridación de sondas fluorescentes en el medio, y un sitio de cebado común en el extremo 3'. sondas derecha 1 y 2 corresponden a la MUT y tipos silvestres (WT), respectivamente. En el análisis de la expresión génica, dos sondas, una sonda de la izquierda y la derecha de la sonda, se utilizaron en la reacción de ligación. La sonda de la izquierda contiene un sitio de cebado común y una secuencia de gen específico. La sonda de la derecha contiene una secuencia específica de gen en el extremo 5 ', una secuencia de código específico en el medio, y un sitio de cebado común en el extremo 3'. Posteriormente, la amplificación de una sola molécula se llevó a cabo en emulsión de agua-en-aceite. Debido a que tanto los granos y las plantillas de MLPA se diluyen de manera que está presente en cada compartimento hay más de una molécula diana y una perla, cuentas amplicones generados a partir de emPCR originan a partir de exactamente una molécula diana. Después demulsification, los granos se recogen y se fijan como una capa de un solo talón (40 micras de espesor) en un hidrogel grano-matriz. Las perlas amplificados a partir de la limpieza de genes (o amplicones WT) se decodifican mediante la hibridación de sondas marcadas con Cy5-3 ', mientras que los gránulos amplificaron a partir de los genes relacionados con el CRC (o MUTS) fueron decodificados por hibridación de sondas marcadas con Cy3-3'; Por lo tanto, el número de bolas de color rojo (Cy5) y el número de verde (tinte Cy3) perlas reflejan los niveles de expresión del gen de mantenimiento (o amplicones WT) y genes relacionados con CRC (o MutS), respectivamente. El coste del ensayo se redujo drásticamente mediante el uso de sondas fluorescentes comunes para la decodificación de las perlas recubiertas con los amplicones de MutS, amplicones WT, la limpieza de genes, y los genes relacionados con CRC.
Especificidad de grano-array
se investigó la especificidad de la plataforma de chip de hidrogel para el análisis de los objetivos de diferentes fuentes. El ADNc de
β-actina
se ligó con las sondas de MLPA específicos de genes que contienen la etiqueta de secuencia para la codificación de sondas labled-Cy5 para producir productos de MLPA
β-actina
. Los productos de MLPA se amplifican usando dos cebadores comunes y el extremo 5 'de un cebador se modificó con biotina. Después de que los productos de PCR modificados con biotina se inmovilizaron sobre perlas de estreptavidina-modificado, el cordón-array se preparó y se cubrió con sondas labled-Cy3 Cy5 y para el análisis. Como se muestra en la figura 2A, sólo hay granos rojos en las imágenes. Del mismo modo, cuando el cDNA de los genes relacionados con el CRC se ligó con las sondas de MLPA específicos de gen que contiene la secuencia de etiqueta para la codificación de sondas labled-Cy3, solamente los granos verdes se pueden escanear (Fig 2B). Los resultados indicaron que la electroforesis elimina de forma efectiva las sondas no coincidentes en la superficie de las perlas "o las sondas restantes en el interior del hidrogel. La hibridación entre las sondas fluorescentes y objetivos en el interior del hidrogel es específica. La plataforma del talón-array se puede aplicar a distinguir con precisión los objetivos de diferentes fuentes en MLPA-DABA.
Tanto la electroforesis etiquetados Cy5 y se añadieron sondas marcadas con Cy3 a la perla-array para la hibridación, y se llevó a cabo para eliminar las sondas no coincidentes y gratuitas. Por último, las tres fotografías de grupo A o en el panel B se toman mediante el uso de tres tipos de canales de fluorescencia, ambos Cy3 y Cy5 canales, único canal Cy3, Cy5 y único canal, respectivamente.
La especificidad de MLPA -DABA para el análisis de los mutantes y las expresiones de genes
para el análisis de la expresión génica, la fracción de perlas CRC falsamente anotó en el 100% de ADNc de
β-actina
y la fracción de granos de limpieza falsamente marcado en 100 se determinaron% cDNA de genes de CRC. Después de la hibridación y la electroforesis, se tomaron imágenes de las perlas recubiertas con 100% de fragmentos
β-actina
y 100% de fragmentos de genes relacionados con el CRC; los resultados se muestran en la figura 3A y 3B. Hubo cerca de los granos sin marcado falsamente que se encuentran en cualquiera de las pruebas; por lo tanto, el uso de MLPA-DABA es altamente específico para el análisis de expresión de genes relacionados con el CRC en CRC
Las muestras fueron del 100% objetivos de
β-actina
(A).; 100% de las dianas de genes relacionados con el CRC (B); DNA WT 100% de codón 1338 en el tejido normal (C); y el ADN MUT 100% de codón 1338 en las células SW480 (D). Siete pares de sondas de genes relacionados con el CRC y
β-actina
se añadió a la mezcla de reacción de MLPA (A y B), y todas las sondas de codones 1406, 1338 y 1356 se utilizaron para las reacciones de MLPA (C y D). Después de la PCR en emulsión, tanto las sondas marcadas con Cy5 y marcados con Cy3 se añadieron a la perla-array para la hibridación.
SW480 células (células de CRC humanos) con una mutación homocigota en el codón 1338 (4012 C & gt; T) fueron seleccionados como objetivo MUT. El tejido normal se utiliza como el destino WT se analizó de forma simultánea. Se detectó la fracción de granos falsamente anotados en un ADN MUT 100% o un 100% en el ADN WT. Los resultados mostrados en la figura 3C y 3D indican que el porcentaje de cuentas falsamente marcados (incluyendo impurezas) en tanto es casi 0, lo que sugiere que el método también es específico para la detección de mutaciones en el CCR.
Cuantificación de dos genes usando MLPA-DABA
para verificar la viabilidad del uso de MLPA-DABA para analizar diferentes genes, dos genes de limpieza se utilizaron como un ejemplo. En un tubo, los objetivos de la
ß-actina
se ligaron con las sondas de MLPA que puedan hibridar las sondas labled-Cy5, mientras que los objetivos de la
GAPDH
se ligó con las sondas de MLPA que podrían hibridar las sondas labled-Cy3. Después de la amplificación digital de los productos de ligamiento y la hibridación de la sonda de las perlas, se contaron las perlas rojas y verdes. Los resultados se muestran en la figura 4. El número de bolas de color rojo y los granos verdes reflejan los niveles de expresión de
β-actina
y
GAPDH
, respectivamente. Al contar las bolas de colores en el chip, se encontró que la relación de expresión de
β-actina
a la de
GAPDH
era casi 1: 1, lo que sugiere que los dos genes de limpieza eran detectado con éxito. No hubo perlas amarillo, lo que indica que la amplificación de un solo molecular se consigue manteniendo no más de una molécula diana en cada compartimiento, y que es posible que MLPA-DABA puede analizar genes de diferentes fuentes.
Un rojo grano originó a partir de una molécula de
β-actina Opiniones y un cordón verde originado a partir de una molécula de
GAPDH
.
Aplicación
Para demostrar la aplicación de MLPA-DABA en la detección de muestras clínicas, se detectaron los niveles relativos de expresión de cinco genes y MutS relacionados con CRC en ambos tejidos tumorales y tejidos normales adyacentes de pacientes con CRC. Las imágenes escaneadas típicos de un paciente se muestran en la Figura 5. Los niveles de expresión relativa del total de los cinco genes relacionados con el CRC a
β-actina
en el tejido tumoral son mucho más altos que en el tejido normal adyacente (Fig 5A y 5B). Todas las perlas eran de color rojo en el análisis de ADN de tejido normal adyacente (Fig 5C), indicando que eran MUT negativo, mientras que los granos verdes (Fig 5D) indican que eran MUT positivo en el tejido tumoral. La tasa de MUT era 3,1%, calculado por la relación de los granos verdes de los granos rojos. diferencias significativas en la expresión de genes entre la mutación y el tejido tumoral y el tejido normal adyacente demostraron que MLPA-DABA puede aplicarse para el diagnóstico precoz del CCR con mutaciones de bajo nivel y una baja abundancia de la expresión génica
.
( A) análisis de la expresión de genes relacionados con el CRC en el tejido normal adyacente; (B) Análisis de la expresión de los genes relacionados con el CRC en el tejido tumoral; (C) la detección de mutaciones de tejido normal adyacente; (D) la detección de mutaciones de tejido tumoral. bolas de color rojo se originó a partir del ADNc de
β-actina
y de tipo salvaje de ADN; los granos verdes se originaron a partir de ADNc de los genes relacionados con el CRC (
C-myc
,
H-ras
,
N-ras
,
CD44v6
, y
Cox-2
) y el ADN mutante.
Para evaluar la viabilidad de MLPA-DABA en la detección no invasiva de muestras clínicas, se utilizaron seis heces de pacientes con CRC. Como se muestra en la Tabla S1, sólo el 50% de los seis pacientes con CRC (3/6) fueron MUT positivo y 83% de los seis pacientes con CRC (5/6) fueron probados con una alta expresión de genes relacionados con la CRC en los análisis no invasivos de muestras de heces. La tasa de detección total de MLPA-DABA es del 83%. Con base en los resultados de la detección y la Duke en fase de los pacientes, se concluye que nuestro método es prometedor en el diagnóstico precoz del cáncer colorrectal debido a que la tasa de detección de los pacientes en las primeras etapas (Dukes etapas A y B) es tan alta como 75% (3/4). Creemos que la tasa de detección se podría aumentar aún más al aumentar el tamaño del panel de loci de mutación y genes relacionados con CRC. Los resultados típicos de MLPA-DABA utilizando una de las heces de los pacientes con CCR y que a partir de un voluntario sano se muestran en la Figura 6. Se detectó la materia fecal del paciente CRC considera MUT positiva con una alta expresión de los genes relacionados con el CRC, mientras las heces del voluntario sano se detectó ser MUT negativa con una baja expresión de los genes relacionados con el CRC
(a) detección de mutaciones de la muestra de heces del caso CRC.; (B) Análisis de la expresión de genes relacionados con el CRC de la muestra de heces del caso CRC; (C) Detección de mutaciones de la muestra de heces de los voluntarios sanos; análisis (D) de la expresión de genes relacionados con el CRC de la muestra de heces de los voluntarios sanos.
Conclusión
En este estudio, un ensayo sensible y específica para detectar digitalmente MUTS y expresión niveles de múltiples genes en un hidrogel de talón-array fue desarrollado. emPCR mediante la combinación de MLPA y el talón a base de, se logró la amplificación de una sola molécula con cebadores comunes que se utilizan para todos los objetivos. MLPA se aplicó en la preparación de plantillas con extremos universales de ADN y muestras de cDNA de diferentes fuentes, lo que favorece la amplificación multiplex. A diferencia de la amplificación analógica en reacciones de PCR convencionales, & gt; 10
6 reacciones de amplificación individuales pueden llevarse a cabo simultáneamente en un tubo con emPCR basado en perlas
Beads se inmovilizan como una sola capa en un chip de hidrogel para. completar la detección de alto rendimiento. En comparación con los métodos comunes de la utilización de acrilamida en la electroforesis para separar las proteínas y ácidos nucleicos, MLPA-DABA utiliza gel de poliacrilamida para incrustar las perlas. El prepolímero del monómero de acrilamida con los granos está salpicado sobre vidrio modificada con acrilo y la polimerización se lleva a cabo para incrustar las perlas en la superficie del chip de vidrio con persulfato de amonio y tetrametiletilendiamina. Debido a la alta permeabilidad de geles con una estructura porosa 3-dimensional, las sondas no coincidentes y otras impurezas incrustadas en la estructura porosa puede pasar libremente a través de la estructura; Por lo tanto, las sondas y las impurezas se pueden eliminar eficazmente por electroforesis. El alto rendimiento de hidrogel supera los problemas experimentados con otros métodos, como la alta interferencia de fondo de lavado inadecuado de las sondas restantes. En MLPA-DABA, el fondo se redujo significativamente; Posteriormente, la sensibilidad y especificidad de MLPA-DABA se mejoraron considerablemente. Además, debido a gel de poliacrilamida tiene características anfifílicas y no cargados, la biocompatibilidad es propicio para la hibridación de sondas y dianas en un entorno de solución-como
.
Debido a que el diagnóstico de enfermedades se realiza con base en la información general de múltiples genes, no es necesario medir una MUT genética o la expresión de un gen específico relacionado con el cáncer. Un panel de múltiples genes como un único biomarcador de diagnóstico demuestra una diferencia más marcada que los genes individuales. En MLPA-DABA, se aplicó un tipo de señal fluorescente con un color para reflejar múltiples MutS y expresiones de múltiples genes relacionados con CRC. Tanto la información general acerca de la expresión total de genes relacionados con el cáncer y una tasa de MUT general se logra mediante el cálculo de la proporción entre el número total de granos verdes de diversas fuentes para el número de cuentas rojas. Es de destacar que los principales pasos en el proceso de detección MUT y el proceso de análisis de expresión génica son idénticos; Por lo tanto, MLPA-DABA es capaz de analizar ambos a la vez en la misma plataforma de chip, que es altamente deseable en el diagnóstico del cáncer. El uso de MLPA-DABA, que tiene las ventajas de ser específico de tumor; requiriendo el muestreo fácil, tiene una gran precisión; es no invasivo para el cuerpo; y no requiere preparación con los alimentos antes de la prueba en comparación con otros métodos no invasivos, tales como la colonoscopia y la prueba de sangre oculta en las heces, es prometedor para el análisis de células de descamación en las muestras de heces de pacientes con CRC y se convertirá en una herramienta poderosa para no invasiva y principios diagnóstico de CCR.
Apoyo a la Información sobre Table S1. Detalles y detección resultados de 6 pacientes mediante el uso de las heces como material de partida
doi: 10.1371. /Journal.pone.0123420.s001 gratis (PDF)