Extracto
Antecedentes
El osteosarcoma es el tumor primario más común del hueso. Los tumores sólidos son de poblaciones de células heterogéneas, que muestran diferentes objetivos y roles en la economía del tumor. Un lugar pequeño subconjunto de células puede mantener o adquirir potenciales madre, ganando la agresividad y el aumento de la esperanza de recurrencia. El antígeno CD133 es una glicoproteína de membrana pentaspan, que ha sido propuesto como un marcador de células madre de cáncer, ya que se ha demostrado previamente para ser capaz de identificar un cáncer de iniciar subpoblación en el cerebro, colon, melanoma y otros tumores sólidos. Por lo tanto, nuestro objetivo era observar la posible presencia de células que expresan el antígeno CD133 dentro de las líneas celulares de tumores sólidos de osteosarcoma y, a continuación, comprender sus características biológicas y actuaciones.
Metodología y Principales conclusiones
en este estudio, el uso de SAOS2, MG63 y U2OS, tres líneas celulares de sarcoma humanos aislados de sujetos de raza caucásica jóvenes, hemos sido capaces de identificar y caracterizar, entre ellos, CD133
+ células que muestran las siguientes características: alta tasa de proliferación, ciclo celular la detección en una fase M G2 \\, positividad para Ki-67, y la expresión de los transportadores de ABCG2. Además, en el FACS, hemos sido capaces de observar el CD133
+ fracción de células que muestra el perfil de la población lado y formando esfera-clusters en medio libre de suero con una alta eficiencia clonogénico.
Conclusiones
en conjunto, nuestros hallazgos conducen a la idea de que podemos suponer que hemos identificado, por primera vez, CD133
+ células dentro de las líneas celulares de osteosarcoma, que muestra muchas características de las células madre del cáncer. Esto puede ser de más interés para el diseño de nuevas terapias contra el cáncer de hueso
Visto:. Tirino V, Desiderio V, R d'Aquino, De Francesco F, G Pirozzi, Galderisi T, et al. (2008) Detección y caracterización de CD133
+ cáncer de las células madre en tumores sólidos humanos. PLoS ONE 3 (10): e3469. doi: 10.1371 /journal.pone.0003469
Editor: Thomas Zwaka, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 12 de mayo de 2008; Aceptado: September 29, 2008; Publicado: 21 Octubre 2008
Derechos de Autor © 2008 Tirino et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. MURST ( Italia), 2ª Universidad de Nápoles. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el osteosarcoma es el tumor primario más común del hueso. Se produce en los huesos y los sitios óseos adicionales, y muestra una distribución bimodal de edad, con un primer pico en la segunda década de la vida, en relación con el estirón adolescente crecimiento (400 nuevos casos pediátricos por año en los Estados Estados Estados Unidos) y un segundo pico en los adultos mayores [1]. La incidencia es ligeramente mayor en los afroamericanos que en los caucásicos y la muerte suele ser el resultado de la metástasis pulmonar progresiva con insuficiencia respiratoria debida a la enfermedad generalizada [2]. Sarcoma alteraciones genéticas incluyen tanto oncosuppressor y las vías de oncogenes, cuyos productos regulan la progresión del ciclo celular [3]. En realidad, es bien sabido que los tumores sólidos están pobladas por poblaciones de células heterogéneas que incluyen células madre con propiedades similares, como la alta tasa de proliferación, la rápida expansión y crecimiento invasivo [4], [5].
tumor se puede prever como un órgano completo, formada por diferentes células que muestran papeles distintos en la economía del tumor. Es bien sabido que la función de las células madre es mantener y reparar tejidos. potencial madre pueden ser también adquirido por célula cancerosa y este evento es muy importante para la progresión del tumor.
La opinión actual es que los tumores pueden derivar de un pequeño número de células que tienen características madre-similares. Las nuevas terapias dirigidas a estas células, que son fundamentales para la progresión tumoral, podrían mejorar significativamente el tratamiento clínico del cáncer. Por lo tanto, es de suma importancia para identificar, dentro de los tumores, las subpoblaciones de células que presentan diferencias significativas en cuanto a la proliferación, el vástago de expresión y el comportamiento marcador.
El antígeno CD133 es una glicoproteína de membrana pentaspan, caracterizado por dos estudios independientes [6], [7] y se identificó originalmente en las células madre neuroepiteliales [8]. Su interés como marcador madre de cáncer ha crecido dramáticamente desde que apareció que era capaz de identificar un cáncer iniciar subpoblación en el cerebro [9] y de colon [10]. Por otra parte, CD133
+ células también se han encontrado en el hepatocarcinoma [11] y melanoma [12], pero, hasta ahora, todavía no está en osteosarcomas, en el que la presencia de células madre como supuestos que forman esferas ha informado [13 ].
Por lo tanto, nuestro objetivo era utilizar el CD133 como un marcador para detectar la posible presencia de células madre del cáncer dentro de las líneas celulares de sarcoma humano aisladas de osteosarcomas de sujetos de raza caucásica jóvenes SAOS2, MG63 y U2OS. Estas líneas celulares se han utilizado previamente como modelos de osteosarcoma [14], [15] y células similares a osteoblastos [16], [17]. En este estudio, con el fin de identificar específicamente CD133
+ células madre de cáncer, hemos investigado la relación entre las características madre y la cinética de la expresión de los marcadores CD133.
Nuestros resultados, en primer lugar demuestran, por la primera vez, que el antígeno CD133 es observable en las células en diferentes osteosarcoma estabilizado líneas celulares. Por otra parte, hemos demostrado que estas células muestran alta tasa de proliferación y de que son capaces de formar esferas de racimo. Además, hemos encontrado que estas células son altamente clonogénico y tumorigénico. Tomados en conjunto, nuestros datos de plomo a la idea de que las células madre del cáncer (CSC), que son las células iniciadoras de tumores, puede ser encontrada en los osteosarcomas y esto puede ser de suma importancia en el diseño de nuevas terapias contra el cáncer de hueso.
resultados
SAOS2, U2OS y MG-63 líneas de células de osteosarcoma se ensayaron con el fin de detectar, dentro de ellos, la presencia de una CD133
+ población celular. CD133 es un marcador de células madre se describe por primera vez en progenitores neuro-endotelial, y recientemente se ha supuesto que es un marcador selectivo para células madre de cáncer (CSC) en algunos tipos de cáncer. Nuestros resultados muestran claramente que en todas las tres líneas de células, dos subpoblaciones: a CD133
+ (que van del 3% al 5%) y un CD133
-, se pueden identificar (Fig. 1). Utilizando el FACsorting, se obtuvo un CD133
+ población enriquecida (98,8%) y un CD133
- población de células. La expresión del antígeno CD133 se analizó mediante el uso de dos anticuerpos diferentes. Los resultados confirmaron que las células negativas CD133 no expresan el antígeno en la superficie celular y que las células CD133 positivas se expresaron en el mismo nivel de porcentaje usando ambos anticuerpos.
Una población celular se puede detectar CD133
+ en todas las tres líneas celulares.
Además, todas las tres líneas celulares fueron negativos para el antígeno CD34 pero evidenciaron igual positividad fuerte para CD29, CD44 y CD90, las células mesenquimales y madre del cáncer marcadores. Tanto las fracciones de CD133
+ y CD133
- células fueron positivas para los antígenos CD29, CD44 y CD90 en las tres líneas celulares (Fig. 2)
Las tres líneas de células son negativas para CD34. antígeno, pero que evidencian la igualdad fuerte positividad para CD29, CD44 y CD90
Las dos poblaciones de células (CD133
+ y CD133
-). después se utiliza para realizar el análisis del ciclo celular, el crecimiento análisis, ensayo de formación de agrupaciones esfera, ensayo de agar blando y detección lado la población.
ciclo celular, ensayos de proliferación y analiza el crecimiento
yoduro de propidio (PI) de ensayo mostró una marcada diferencia en el ciclo celular de CD133 ordenadas células. CD133
+ células eran en su mayoría en la fase G2 \\ M, mientras que CD133
- células eran predominantemente en G0 \\ G1 (Figura 3A.), Lo que indica que el CD133
+ subpoblación es la fracción de células en proliferación activa. Por otra parte, todo el CD133
+ células resultaron ser Ki-67
+ (Fig 3B.) Mientras que la mayoría de CD133
- células fueron negativas para este marcador. Ki-67 es una proteína expresada solamente en la proliferación de células, por lo tanto nuestros resultados confirman que el CD133
+ fracción es la fuente de células recién generadas.
(A) Figura del ciclo celular análisis realizados en SAOS2, líneas de células MG63 y U2OS. Un CD133
+ población celular es principalmente observable en la fase G2 \\ M, mientras que CD133
- células eran predominantemente en G0 \\ G1; (B) Figura que muestra la reactividad Ki-67. CD133
+ células resultaron ser Ki-67
+, mientras que CD133
- fueron principalmente negativas para este marcador; (C) La figura muestra las curvas de crecimiento de CD133
+ células CD133 con respecto
- células en SAOS2, MG63 y líneas de células U2OS. CD133
+ células poseen un alto potencial proliferativo en todas las tres líneas celulares.
Además, con el fin de demostrar si CD133
+ células eran capaces de proliferar extensivelly cuando se compara con CD133
- células, se observó su crecimiento. Nuestros datos muestran que los cultivos tumorales derivadas de CD133
+ células muestran mayor potencial proliferativo con respecto a CD133
- células en todas las tres líneas celulares. De hecho (figura 3C) CD133
+ células presentaron una media de tiempo de aproximadamente 40 h, 33 hy 38 h en las líneas celulares SAOS2, MG63 y U2OS duplicar respectivamente, mientras que CD133
- células mostraron una media hora de doblar 48 h, 44 h y 42 h en SAOS2, MG63 y líneas de células U2OS respectivamente. Cuando las células eran adherentes, después de la clasificación, el porcentaje de células que expresan CD133 disminuyó significativamente (p & lt; 0,001) con el tiempo de cultivo (datos no mostrados)
Formación Esfera Cluster
La capacidad de crecer. en suspensión en medio libre de suero, que se describe por primera vez para seleccionar células madre neurales a través de la formación de neuroesferas, se ha investigado en gran parte como un método de selección de células iniciadoras de tumores. Glioblastoma, cáncer de colon, melanoma y células sobre todo, seleccionados por su capacidad de formar grupos de esfera, se encontraron para ser altamente tumorigénico y capaz de propagar y reconstituir arquitectura tumor original cuando se inyecta en huéspedes permisivas. Nuestros resultados sobre líneas celulares de osteosarcoma indicaron que las agrupaciones esfera se observaron claramente ya después de 24 h en CD133
+ culturas, mientras que CD133
(Fig 4A, C, D). - No formar esferas (Fig 4B.). Después de 7 días de cultivo, esferas obtenidas en CD133
+ células se sembraron en placas estándar con 10% de FBS. Las células migradas de las esferas dentro de unas pocas horas y se adhirieron al fondo de los matraces, asumiendo una forma poligonal. Estas células resultó ser más pequeño en tamaño, en comparación con CD133
- células. Después de una semana, se realizó una prueba adicional para el antígeno CD133 sobre células adherentes. Curiosamente, de nuevo un CD133
- no se observó la población, proporcionando evidencia de que CD133
- células, en este momento, se derivan de CD133
+ celular. A continuación, se realizó una nueva clasificación de estas células y observamos que el CD133
+ fracción aún conservaba la capacidad de formar esferas, mientras que el CD133
- se formó no
grupos (A) Esfera. por CD133
+ células en medio semisólido después de 24 horas (aumento original x 100); (B) CD133
- células en medio semisólido después de 7 días, no forman esferas. (Aumento original x 100); grupos (C) Esfera formados por células CD133
+ después de 48 horas (aumento original × 200); (D) Esfera grupos formados por CD133
+ células después de una nueva clasificación (aumento original × 400).
Además hemos probado expresiones Oct3 /4 y CD133 en 6
º celular pasaje y en 4
º y 6
º paso, respectivamente, en sarcospheres derivados de CD133
+ células después de la clasificación. Los resultados mostraron que las esferas se enriquecieron tanto en OCT3 /4 y CD133 con el tiempo de cultivo (Fig. 5).
La línea azul indica controles de isotipo, líneas rojas y verdes indican la expresión de CD133 en el 4
º y 6
º paso de células, respectivamente. En los histogramas, OCT3 /4 expresión se analiza en el 6
º paso célula; la línea verde indica controles de isotipo. Sarcospheres tanto en CD133 y OCT3 /4 son fuertemente positivas.
Soft Agar de ensayo
ensayos de agar blando se realizaron con el fin de observar las diferencias en la tumorigenicidad de células por medio de la capacidad de CD133
+ células para formar colonias con respecto CD133
- células. Como se muestra en la Tabla 1, se formaron colonias de manera más eficiente por CD133
+ células, lo que dio lugar a un 5,5 ± 1,8 veces mayor número de colonias que los detectados en CD133
- población (
p
& lt; 0,005) en SAOS2; 7,7 ± 1,5 veces mayor número de colonias que los observados en CD133
- población (
p
& lt; 0,001) en MG63, y 6,8 ± 1,7 veces mayor número de colonias que los observados en CD133
- población en U2OS (P & lt; 0,005) guía empresas
población lateral y ABCG2
Dentro del CD133
+ fracción de un subconjunto muy pequeño (0,97%) expresa la característica. el perfil de una población lado. Se sabe que el fenotipo población lado es el atributo más importante de las células madre de cáncer. En este estudio se muestra por primera vez que en líneas celulares de osteosarcoma se puede detectar una población lado. Por otra parte, se encontró que todas las tres líneas de células expresan el transportador ABCG2 (Fig. 6) que generalmente se asocia con el fenotipo población lado y resistencia a los medicamentos.
análisis (A) de citometría de la población lado. El CD133
+ fracción, incluye un pequeño subconjunto (0,97%), que expresa el perfil característico de una población al lado de FACS. (B) ABCG2 expresión en la línea celular SAOS2, mostrando una positividad evidente; la línea gris indica que el control de isotipo.
La inmunohistoquímica e inmunofluorescencia
Tanto inmunohistoquímica e inmunofluorescencia análisis sobre células adheridas y esferas flotantes se llevaron a cabo en este estudio. Nuestros resultados, en consecuencia con el análisis FACS, confirmaron la presencia del antígeno CD133 en la membrana celular de CD133
+ células clasificadas. Por otra parte, las esferas flotantes mostraron una tinción difusa ampliamente para CD133, lo que corrobora el hecho de que las esferas están formadas por CD133
+ células. Curiosamente, el CD133
- fracción según se tiñeron para CD133, que se localiza dentro de vesículas citoplasmáticas intra-como se muestra en la microscopía confoal (Fig 7A, B, C, D, E, F.). Con el fin de comprender en profundidad este aspecto, se realizó, en el FACS, una tinción intracelular para CD133. Se encontró que en todos los tres líneas celulares de una positividad intracelular se observó (Fig. 8A), mientras que los isotipos de control fueron negativos.
análisis (A) inmunohistoquímica en células adherentes y esferas flotantes (B) que muestra la presencia de antígeno CD133 (flechas). (Aumento original × 100.); (C) El análisis de inmunofluorescencia en SAOS-2 para CD133 PE, citoesqueleto se tiñe con faloidina-FITC, núcleo con DAPI (aumento original x400.); (D) Inmunofluorescencia análisis sobre SAOS-2 esferas de CD133 PE después de 24 horas en la adhesión. (Aumento original × 200); análisis (E) confocal en células adherentes y (F) esferas que confirman la presencia del antígeno CD133 flotantes. (Aumento original. × 400).
(A) Figura realizada en FACS que muestra la expresión intracelular del antígeno CD133 en SAOS-2, MG-63 y U2OS. (B) Figura que muestra en la PCR en tiempo real de la transcripción de expresión de ARNm de CD133
+ y CD133
- células. Los niveles son casi idénticos como se detecta por tanto en las células CD133 positivas y negativas.
Time-PCR real de análisis
La expresión de los niveles de ARNm de CD133 en CD133
+ y CD133
- células adherentes fueron casi idénticos detectada por PCR en tiempo real (figura 8B.). Esto confirma ambos FACS y los resultados de inmunofluorescencia, como se muestra arriba.
Discusión
El osteosarcoma es un tumor altamente agresivo, que afecta predominantemente a los jóvenes. De acuerdo con estudios recientes [10] - [13], [18] el apoyo a la presencia de un subconjunto de células altamente tumorigénicas - comúnmente se llama cáncer de células madre (células madre cancerosas) - dentro de la masa tumoral, tratamos de aislar y caracterizar esta subpoblación en líneas celulares de osteosarcoma . lesiones tumorales abarcan poblaciones de células heterogéneas, entre los cuales la presencia de antígenos madre puede ponerse de manifiesto por medio de análisis fenotípicos. La presencia de un CD133
+ subpoblación dentro de los tumores sólidos humanos ha sido documentada por varios informes [10] - [13], [18] - [21], y las células que expresan este marcador parecen ser diferentes de las otras células cancerosas . En particular, CD133
+ células poseen características madre similar, como la capacidad de diferenciación, de alta tasa de proliferación, la formación de agrupaciones esfera y la capacidad de propagar tumor en huéspedes permisivas. fracasos tratamiento del cáncer pueden deberse a efectos ineficientes de la terapia actual sobre células madre cancerosas potencialmente inactivas, que siguen siendo vital y retienen la capacidad de regenerar el tumor [22], [23]. Desarrollo de nuevas estrategias orientadas CSC actualmente se ve obstaculizado por la falta de marcadores fiables para la identificación de células madre cancerosas y la mala comprensión de su comportamiento y el destino. Las líneas celulares derivadas de tumores,, conservan patrones jerárquicos de células madre, demostrables con capacidades diferentes clonogénico, relacionados con las propiedades celulares, tales como el tamaño, la adhesividad, la exclusión de colorante y los patrones de expresión de genes [24].
En este estudio, se utilizó el antígeno CD133 como marcador de células madre de cáncer con el fin de identificar, dentro estabilizado líneas celulares de osteosarcoma, células que exhiben diferentes propiedades en términos de tasa de proliferación, la eficiencia clonogénico, formación de esferas-cluster y el tinte de exclusión. Screening tres líneas celulares de osteosarcoma, se encontró que CD133
+ subconjuntos ser 3% a 5% de las células totales, de acuerdo con la suposición de que los CAC debe ser sólo un subconjunto muy pequeño de células. No hay diferencias en la CD29, CD44 y CD90 expresiones tanto en CD133
+ y CD133
- células. En realidad, se consideran las células madre del cáncer que ser de reposo
in vivo
y rara vez se dividen asimétricamente, dando nacimiento a la progenie altamente proliferantes [5]. Sin embargo, si una jerarquía madre existe en líneas de células, las células con características madre pueden no estar en reposo; de lo contrario, deben ser perdidos en algunos pasajes. De acuerdo con esta consideración, se encontró que CD133
+ células fueron altamente proliferativa, cuando se compara con CD133
- células, tal como se confirma por análisis de PI, Ki-67 etiquetado y el crecimiento análisis
CD133
+ mostraron muchas diferencias con respecto a sus contrapartes negativas, que tiene la capacidad de crecer como esferas en un medio semisólido y para formar de manera eficiente colonias en agar blando. Estos ensayos se consideran comúnmente, respectivamente, como índices de auto-renovación, tumorigenicidad y clonogenicidad. Por otra parte, sarcospheres, que derivan de CD133
+ células, expresaron altos niveles de OCT3 /4, que son factores de transcripción implicados críticamente en la auto-renovación y en el mantenimiento de la pluripotencia de células madre embrionarias no diferenciadas [25]. En nuestras manos la CD133
+ células mostró todas esas habilidades y expresó ABCG2, que es un transportador de membrana, por lo general asociados con el lado fenotipo de la población y las drogas resistencia [26]. Por lo tanto, esto puede ser considerado como un marcador adicional para células madre cancerosas. Además, en este estudio, se mostró efectivamente, por primera vez, que una población lado se puede detectar también en líneas celulares de osteosarcoma. La parte de población se define por Hoechst exclusión en citometría de flujo [27], [28]. Se representa sólo una pequeña fracción de toda la población de células y expresa los altos niveles de varios miembros de la familia de transportadores ABC, tales como ABCG2 y MDR1, que son responsables de la resistencia a fármacos [29], [30]. Como era de esperar, se encontró que la población lado fue hecho por una fracción muy pequeña (0,97%) del total de células, y, curiosamente, fue incluido por completo dentro del CD133
+ subconjunto.
Nuestros datos , en conjunto, pueden conducir a la listada que CD133
+ células son las células madre del cáncer. En realidad, aunque esto debe ser apoyado por un
in vivo
xenoinjerto de tumor, como se muestra en otros tumores sólidos [10] - [13], [18] - [21], por desgracia, no eran capaces de realizar
in vivo
experimentos porque las líneas celulares de osteosarcoma no se injertan con cualquier host. Nosotros intentamos de manera efectiva para llevar a cabo
in vivo
trasplante de nuestras células madre CD133, pero sin éxito, al igual que todos los demás investigadores.
Además, también podemos plantear la hipótesis de que el CD133
+ subconjunto abarca un CD133 menor
+ \\ ABCG2
+ \\ SP
+ población, lo que podría ser resistente a las drogas, posee características tallo y puede impulsa eficazmente la progresión del cáncer.
interesante e inesperada, en nuestras manos, algunas células que no expresan el marcador de CD133 en la membrana como resultado de producir una cantidad detectable de transcritos de CD133 de ARNm, y expresan el antígeno CD133 en vesículas citoplásmicas como se muestra por microscopía confocal. Sin embargo, CD133
+ y CD133
- poblaciones según muestran claramente diferentes comportamientos. Esto nos lleva a especular sobre el papel funcional de CD133 en la organización de la membrana y la selección de los CAC, de la siguiente manera: i) se CD133 altamente involucrado en la formación de agrupaciones de esfera, que es necesaria para el crecimiento de células no adherentes, así como para la célula a las células beta diafonía, lo que permite que las células se comunican y reciben estímulos que normalmente son suministrados por las moléculas de adhesión; ii) CD133
+ y CD133
- las poblaciones de células madre cancerosas están en continuo y el intercambio mutuo y verdadero expresar CD133 constantemente en la membrana
En conclusión, nuestros resultados sugieren que CD133 marcador puede ser útil. indicar el estado diferenciado /indiferenciada de los tumores de osteosarcoma y esto puede conducir a nuevos enfoques para el diseño de una terapia más específica y mejorar el pronóstico.
Materiales y Métodos
cultivo de células
SAOS2, MG63 y U2OS se adquirieron de ATCC banco de células; las células se colocaron en medio de cultivo α-MEM, suplementado con 15% FCS, ácido 2P-ascórbico 100 mM, 2 mM L-glutamina, 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina (todos comprados de Invitrogen, San Giuliano Milanese, Milán, Italia) y se colocó en matraces de 75 ml con válvulas filtrados. Los matraces se incubaron a 37 ° C en un 5% CO
2 y el medio cambian dos veces por semana. Después de la confluencia, las células se dividieron en nuevos frascos hasta el final del experimento.
citometría de flujo y la célula Ordenando
Las células fueron separadas utilizando EDTA al 0,02% en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se contaron y se lavaron en 0,1% de BSA en PBS. Al menos 500.000 células (en 100 l de PBS /0,5% BSA) se incubaron con anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia o controles de isotipo respectivos (décimo diluyeron 4 ° C durante 30 min en la oscuridad). Después de las etapas de lavado, las células marcadas se analizaron mediante citometría de flujo utilizando un clasificador de células FACS Vantage (Becton & amp; Dickinson, Mountain View, CA, EE.UU.). Los anticuerpos utilizados fueron ratón anti-humano CD133 /2 PE conjugado (Miltenyi Biotec Srl Calderara di Reno, Bolonia, Italia), de ratón anti-humano CD133 PE conjugado (eBioscience), ratón anti-humano CD29 CY conjugado (BD Pharmingen, Buccinasco, Milán, Italia), de ratón anti-humano CD34 PE conjugado (Miltenyi Biotec), ratón anti-humano CD44 conjugado con FITC (Miltenyi Biotec), ratón anti-humano CD90 conjugado con FITC (BD Pharmingen), ratón anti-humano OCT3 /4 no conjugado (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, California, EE.UU.), de ratón anti-humano conjugado con FITC Ki67 (Miltenyi Biotec) y el ratón anti-humano ABCG2 no conjugado (Santa Cruz). CD133
+ células se clasifican para los experimentos. CD133
- células se recogieron como control. La pureza de las poblaciones clasificadas era rutinariamente 90%. Isotipos se utilizaron como controles
Siete días después de la clasificación, el CD133
-. Las células fueron separadas y se probaron dos veces para la expresión CD133. OCT3 /4 expresión se analizó a las 6
º paso de células (un "paso" indica que las células se separan cuando en la confluencia), mientras que la expresión de CD133 se analizó a las 4
º y 6
º paso celular en sarcopheres derivados de CD133
+ células en las tres líneas celulares
Para la tinción intracelular de Ki67, CD133 y OCT3 /4, las células fueron procesadas usando el Caltag Fix & amp;. Kit de Perm (Invitrogen, Milán, Italia) siguiendo las instrucciones del fabricante. Todos los datos fueron analizados utilizando un software CellQuest.
Hoechst 33342 Exclusión Ensayo
SAOS2, las células MG63 y U2OS se volvieron a suspender en 2,0 × 10
6 células /ml en pre-calentado α- MEM medio de cultivo y se dividió en dos porciones. Una porción se trató con 50 mM verapamil y el otro se dejó sin tratar. Ambas porciones se incubaron en medio de cultivo α-MEM con 5 mg /ml de Hoechst 33342 (Sigma, Milán, Italia) durante 90 minutos a 37 ° C. Después de la incubación se lavaron las células en PBS y se mantuvieron en hielo durante 5 minutos, y se analizaron para Hoechst 33342 de flujo de salida por FACS vantage (Becton Dickinson, Milán, Italia) [31]. El colorante Hoechst 33342 fue excitado a 350 nm y la fluorescencia ultravioleta resultante se midió en dos longitudes de onda usando un 424/44 BP y 675 filtros LP para la detección de azul y rojo, respectivamente.
Ciclo celular y la proliferación análisis Hoechst
ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo. Las células se recogieron en PBS que contenía EDTA 2 mM, se lavaron una vez con PBS, se fijaron en etanol helado 70 ° y se incubaron con 50? G /ml PI (Sigma) más Rnasi 1 mg /ml durante 60 min a 4 ° C en la oscuridad. núcleos teñidos fueron analizados con un clasificador de células FACS Vantage (Becton & amp; Dickinson, Mountain View, CA, EE.UU.)., y los datos analizados utilizando un programa de análisis del ciclo celular Mod-Fit 2.0 (Becton-Dickinson)
análisis del crecimiento
Después de la clasificación por CD133, SAOS2, MG-63 y las células U2OS se sembraron a una densidad de 8,0 × 10
4 células /pocillo en placas de 6 pocillos. Se recogieron las células de cada doce horas y se resuspendieron en PBS. Una alícuota de la suspensión celular se diluyó con 0,4% de azul de tripano (Sigma-Aldrich), se pipeteó en un hemocitómetro y se contaron bajo un microscopio a 200 × magnificación. Las células vivas excluyen el colorante, mientras que las células muertas admitieron el tinte y por consiguiente de colores intensamente con azul de tripano. El número de células viables para cada condición experimental se contó y se representa en un gráfico lineal. Se determinó el tiempo de duplicación (DT) a partir de las curvas de crecimiento o mediante el uso de la fórmula: en la que T y T
0 fueron los tiempos en los que se contaron las células, y N y N
0 fueron los números de células en momentos T y T
0, respectivamente [32].
Ensayo en agar blando
con el fin de ensayar la diferente potencial tumorigénico en dos fracciones celulares, CD133
+ y CD133
- células se sembraron en agar blando con una densidad de 100, 500 o 1000 células /pocillo en placas de 24 pocillos en triplicado. Colo línea celular de melanoma 38 se utilizó como control positivo.
Para la capa de base, 2,4% de solución de agar de stock se fundió en un horno de microondas, se enfrió a 40 C en un baño de agua y luego se mezcla con medio de cultivo para obtener una solución de 0,8% de agar en α-MEM. se añadieron 0,5 ml /pocillo de esta solución a las placas de 24 pocillos. Para la capa superior, la solución de agar se diluyó con medio de cultivo para obtener una solución de 0,3% de agar en α-MEM. 0,5 ml /pocillo de la solución se mezcló suavemente y se dividió en alícuotas en las placas de 24 pocillos. CD133
+, CD133
- y tipo Wilde SAOS-2, las células MG63 y U2OS se sembraron sucesivamente y se incubaron durante 21 días a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 en aire y 50 l α-MEM . Al final del periodo de incubación, las colonias se tiñeron con 150 l /pocillo de NBT (nitrobluetetraziolium) a la concentración de 1 mg /2 ml en PBS, y se contaron usando un microscopio invertido (Nikon TS 100, Nikon, Milán, Italia) .
la tinción de inmunofluorescencia
CD133
+ y CD133
- células cultivadas en placas de 24 pocillos se fijaron con una solución de paraformaldehído al 4% /0,2% Triton en PBS durante 30 min a 4 ° C, se lavaron en PBS, se trató con PBS /5% de leche durante 60 minutos a temperatura ambiente y después se tiñeron con anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche. Los anticuerpos primarios utilizados fueron ratón anti-humano CD133 /2 PE conjugado (Miltenyi Biotec), ratón anti-humano conjugado faloidina FITC (AlexaFluor-Invitrogen) se incubaron durante 60 min a 4 ° C. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Después, las células se lavaron dos veces como se describe anteriormente y se observa bajo el microscopio de fluorescencia (Nikon TE 2000-S, Milán, Italia). Isotipos y células que no son sondeadas se utilizaron como controles.
Esfera Ensayos
Las células se sembraron a una densidad de 60.000 células /pocillo en placas de 6 pocillos de fijación de ultra baja (Corning Inc., Corning , NY, EE.UU.) en medio /célula F12 DMEM, suplementado con 1% de metilcelulosa, progesterona (10 nM), putrescina (50 mM), selenito de sodio (15 nM), transferrina (13 mg /ml), insulina (10 mg /ml; Sigma) y EGF humano (10 ng /ml) y bFGF humano (10 ng /ml; Sigma) [13]. alícuotas frescas de EGF y bFGF se añadieron cada dos días. Después del cultivo durante 48-72 horas, esferas eran visibles en el microscopio de contraste de fase invertida (Nikon TS 100, Nikon).
de escaneo láser confocal de microscopía
Las células cultivadas en placas de 24 pocillos se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 30 min a 4 ° C, se lavaron en PBS, se trataron con PBS /5% de leche durante 60 minutos a temperatura ambiente y después se incubaron con anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche. El anticuerpo primario era un ratón anti-humano CD133 /1 Pure (Miltenyi Biotec); el anticuerpo secundario (de cabra anti-ratón FITC o PE conjugado Abcam) se incubó durante 60 min a 4 ° C, y la DAPI, que se utiliza para teñir el núcleo, se incubó durante 7 minutos a temperatura ambiente. El mismo procedimiento se realizó en sarcospheres. Todas las células marcadas se almacenaron a 4 ° C antes de la adquisición de imágenes, utilizando un Zeiss de escaneo láser confocal microscopio LSM 510 Meta (Zeiss- Oberkocken-Alemania). Las imágenes fueron capturadas con una resolución de 512 × 512 píxeles. La fluorescencia láser de argón apropiada para la visualización de la CD133 se utilizó con una longitud de onda de excitación de 488 nm y filtro de emisión BP 505-530.
inmunohistoquímica
células
inmunohistoquímico de CD133 en SAOS2, MG63 y U2OS se realizó. Las células se sembraron a una densidad de 50.000 células /pocillo en placas de 24 pocillos, se fijaron con 3,5% de paraformaldehído durante 10 min a 4 ° C, y se lavaron en PBS. El anticuerpo primario utilizado fue de ratón anti-humano CD133 /1 Pure (Miltenyi Biotec). Para el anticuerpo secundario y la tinción, se utilizó el kit DAKO Cytomation En Vision + System-HRP (AEC) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los núcleos se tiñeron con hematoxilina y se observaron las células bajo un microscopio de luz invertida. Este procedimiento también se realizó en sarcospheres.
RT-PCR en tiempo real
Las secuencias de ARNm desde el banco de datos de nucleótidos (Centro Nacional de Información sobre Biotecnología, EE.UU.) se utilizaron para diseñar pares de cebadores para RT reacciones -PCR (Primer express, Applied Biosystems, CA, EE.UU.). Primer secuencias están disponibles bajo petición. regiones apropiadas de HPRT (hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa) de ADNc se utilizaron como controles.