Extracto
Aplicaciones
Esta ocurrencia evaluado el estudio y la potencial importancia clínica de intratumoral
EGFR
heterogeneidad mutacional en pacientes chinos con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).
Materiales y Métodos
El ochenta y cinco pacientes en estadio IIIa-IV NSCLC que se habían sometido resección quirúrgica paliativa se incluyeron en este estudio. De estos, 45 pacientes llevaron a
EGFR
mutaciones (grupo M) y 40 pacientes eran de tipo salvaje (grupo-W). Cada muestra de tumor se microdissected para producir 28-34 focos tumorales y intratumoral
EGFR
mutación se determinó a través de desnaturalización cromatografía líquida de alta resolución (DHPLC) y el Sistema de amplificación refractario a las mutaciones (ARMS).
EGFR
número de copias se midieron utilizando hibridación in situ fluorescente (FISH).
Resultados
microdisección produjo 1.431 focos tumorales de
EGFR mutantes
pacientes (grupo -M) y 1.238 focos de pacientes de tipo salvaje (grupo O). El
EGFR
la frecuencia de mutantes en el grupo-M eran el 80,6% (1.154 /1.431) y 87,1% (1.247 /1.431) usando DHPLC y los brazos, respectivamente. Una combinación de
se detectó EGFR
células -mutated y de tipo salvaje en 32,9% (28/85) de las muestras por DHPLC y 28,2% (24/85) por las armas, el apoyo a la ocurrencia de la heterogeneidad intratumoral. Treinta y un pacientes (36,5%) fueron identificados como
EGFR
FISH-positivo. Los pacientes que albergan la heterogeneidad mutacional intratumoral poseían menor
EGFR
número de copias de esos tumores contenían células mutantes solos (16,7% vs. 71,0%,
P Hotel & lt; 0,05). De los 26 pacientes que habían recibido EGFR-TKI, la media
EGFR
el contenido de mutaciones fue mayor en los pacientes que muestran una respuesta parcial (86,1%) o enfermedad estable (48,7%) en comparación con los pacientes que sufren enfermedad progresiva (6,0%) (
P
= 0,001). También mostraron relación entre la supervivencia libre de progresión (SLP) y diferentes contenidos de los grupos de mutación de EGFR (EGFR pura tipo salvaje, con mutación de EGFR mutado pura heterogeneidad y EGFR) (
P
= 0,001).
Conclusión
Aproximadamente el 30% de los pacientes presentó intratumoral
EGFR
heterogeneidad mutacional, acompañando con el número relativamente bajo de copias de EGFR.
EGFR
contenido mutante se correlaciona con la respuesta y el pronóstico de EGFR-TKI
Visto:. Bai H, Wang Z, Wang Y, Zhuo M, Zhou Q, Duan J, et al. (2013) Detección y significación clínica de intratumoral
EGFR
mutacional La heterogeneidad en los pacientes chinos con avanzado de células no pequeñas cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (2): e54170. doi: 10.1371 /journal.pone.0054170
Editor: William CS. Cho, Hospital Queen Elizabeth, Hong Kong
Recibido: 21 Agosto, 2012; Aceptó 7 de diciembre de 2012; Publicado: 13 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Bai et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales Distinguidos jóvenes estudiosos [81025012]; y el Programa Nacional de Ciencias Naturales de la Fundación General [81172235]; y los sistemas de salud líder académico de Beijing [02.22.2011]. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
inhibidores epiteliales del factor de crecimiento al receptor de la tirosina quinasa (EGFR-TKIs) tales como gefitinib y erlotinib se habían aplicado ampliamente para el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Varios informes han sugerido que los pacientes tratados con EGFR-TKI exhiben una mayor eficacia y supervivencia tiempos de tratamiento cuando llevan a la activación de mutaciones en
EGFR
[1] - [6]. Sin embargo, Na et al informaron de que los pacientes con adenocarcinoma de sexo femenino con mutación sensible a EGFR presentan más la recurrencia postoperatoria y la supervivencia más cortos que los de tipo salvaje EGFR [7]. También existen
EGFR
pacientes con CPNM -mutated que exhiben una respuesta deficiente a EGFR-TKI o que recaen después de un período de control de la enfermedad, lo que sugiere que hay factores adicionales que median la respuesta a EGFR-TKI. mutación secundaria (T790M) en el exón 20 de
EGFR
así como otras aberraciones genéticas de derivación y aguas abajo vías relacionadas EGFR, tales como,
C-MET
amplificación [8] - [10] ,
IGF-1R
mutación [11] habían sido identificados en relación con la resistencia a fármacos inhibidores de TK. Sin embargo, alrededor del 30% de los mecanismos de resistencia de los pacientes siguen sin estar claros. Recientemente, la heterogeneidad intratumoral de
EGFR mutaciones
ha llamado la atención como una fuente potencial de fracaso del tratamiento y la resistencia a los medicamentos a EGFR-TKI [12], [13].
Tumorigénesis de cáncer de pulmón es una proceso de varias etapas por el cual las células cancerosas monoclonales convertido gradualmente heterogénea debido a la evolución clonal y la inestabilidad genética /epigenética. Aunque se cree que todas las células malignas que se deriva de una célula precursora común, adquirido la inestabilidad genética da lugar a las siguientes generaciones que expresa características únicas, tales como oncogenes activados y genes supresores de tumores [14]. Sin embargo, estudios recientes de la heterogeneidad genética intratumoral han generado resultados contradictorios. Gerlinger et al (2012) [15] informaron de una marcada heterogeneidad intratumoral con respecto a las mutaciones somáticas en los genes de conductor y pasajero, que puedan fomentar la adaptación del tumor y el fracaso terapéutico a través de la selección darwiniana. Snuderl et al (2011) [16] informó de convivencia estable de clones heterogéneos poseen diferente amplificación de la tirosina quinasa del receptor (
EGFR, MET
, y
PDGFRA
) dentro del mismo tumor. Como un gen conductor,
EGFR
se sugirió a ser asociada con la resistencia a EGFR-TKI cuando las mutaciones en este gen mostraron heterogeneidad intratumoral. Nuestro estudio reciente (2012) [17] También indicó que
EGFR
cambio mutación derivada de chemotherpy puede estar relacionado con la heterogeneidad intratumoral de
EGFR
mutación y para diferentes niveles de chemosensitivity mutante y silvestre las células tipo, por el contrario, Yatabe et al (2011) [18] informó de que
EGFR
heterogeneidad ocurrieron muy raramente en el adenocarcinoma de pulmón. Estos autores especularon que la heterogeneidad observada en estudios anteriores era un artefacto que sea el resultado de un desequilibrio específico de alelo mutante y heterogéneamente distribuidos
EGFR
amplificación o de una diferencia en
EGFR
la sensibilidad de detección de mutaciones a través de diferentes métodos.
a partir de los resultados dispares de los estudios anteriormente serie en la heterogeneidad intratumoral, que intentó investigar
EGFR
estado de la mutación mediante análisis de microdisección multi-focal a través de diferentes métodos (DHPLC vs ARMS), explorar la asociación de la heterogeneidad intratumoral con
EGFR
número de copias y imfluence de
EGFR
contenidos de mutación sobre la respuesta de la terapia EGFR-TKI para los pacientes con CPNM localmente avanzado o.
Materiales y Métodos
pacientes y muestras
Todas las muestras utilizadas en este estudio se obtuvieron a partir de un banco de tejidos en el Departamento de Oncología médica Torácica, hospital de cáncer de la Universidad de Pekín, que fue establecido en junio de 1999 y que poseía alrededor de 1900 pacientes con muestras de tejidos que había sido genotipo para
EGFR
estado de mutación utilizando métodos de rutina (DHPLC). Se seleccionaron pacientes del banco de tejidos de acuerdo con los siguientes criterios: 1) histológicamente confirmados estadio IIIa-IV NSCLC (informe patológico); 2) habían recibido la resección paliativa operativa; 3) podría proporcionar suficientes muestras de tejido primario para microdisección y análisis molecular. Los criterios exclusivos incluidos: 1) tuvo tejidos, pero era muestras lugar de la metástasis; 2) el contenido de las células tumorales era demasiado bajo para análisis. Las resecciones paliativas operativos se definen como la operación realizada en los pacientes con CPNM avanzado que tenían pequeños nódulos intra-pulmonares, metástasis solitaria en un solo órgano o enfermedad metastásica no identificada preoperatoria.
Finalmente, 85 pacientes cumplieron con los anteriores criterios y fueron incluidos en este estudio, que contenía 45 muestras escritas como
EGFR mutante
(grupo M) y 40
EGFR
muestra de tipo salvaje (grupo-W). Todos los pacientes proporcionados consentimiento informado por escrito para el análisis de biomarcadores. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Ética del Hospital de Cáncer de la Universidad de Pekín.
microdisección y la extracción de ADN
Todas las muestras habían sido evaluadas por
EGFR
mutación mediante DHPLC rutinaria y se clasificaron en 40 de tipo salvaje y 45 muestras de tipo mutante. De cada bloque incluidas en parafina (FFPE) fija en formalina, una sección de 15 micras de grosor se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E).
Para garantizar que las muestras analizadas tenían contenidos tumorales más de 90% , un protocolo se realiza rutinariamente en nuestro grupo: en primer lugar, la cobertura del tumor en la sección fue tirado por dos patólogos independientes bajo microscopía y excluyó a los tejidos no malignos tan pronto como sea posible. En segundo lugar, pequeños focos (alrededor de 0,1 cm2 de tamaño) dentro de la región del tumor se microdissected usando sistema láser microdisección (LMC, Leica Wetzler, Alemania) y asegurar cada focos contienen más de 90% de células tumorales.
Se extrajo el ADN a partir de alícuotas muestras de microdissected usando el kit de FFPE DNA Extraction de acuerdo con las instrucciones del fabricante (omega). Las muestras de ADN fueron examinados por la pureza y concentración utilizando un kit Nano gota (Thermo Scientific) y se diluyeron hasta una concentración de trabajo de 10 ng /l.
análisis de mutaciones de EGFR por DHPLC y brazos
La
EGFR
estados de mutación de muestras de ADN genómico derivados de microdisecciones tumorales se determinaron mediante la aplicación tanto de DHPLC y los brazos a cada muestra. DHPLC se llevó a cabo como se describe anteriormente [19], y los brazos se llevó a cabo utilizando un DxS
EGFR Mutation Test Kit
, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Amoy Diagnóstico Co., LTD, China). PCR (qPCR) reacciones cuantitativas se realizaron mediante un Sistema de QPCR en tiempo real Mx3000P (Stratagene, Agilent Technologies, EE.UU.).
semiquantitation de heterogeneidad mutación de EGFR
Un DHPLC análisis semicuantitativo de
EGFR
abundancia se realizó mediante el cálculo de la relación de alturas de los picos entre el mutante (M) y productos de tipo silvestre (W) (relación, H /W). La DHPLC análisis se limitó a mutaciones en el exón 19, porque M y W picos se separaron por completo, pero se superponen en el exón 21 de detección de mutaciones.
copia EGFR detección de número
EGFR
copia los números fueron determinados por hibridación in situ fluorescente (FISH) a partir de tejido grueso usando sondas de ADN de doble color (Beijing GP médica Tec., LTD, china). especímenes tumorales se clasifican en seis categorías sobre la base de los resultados de FISH de acuerdo con los criterios de Cappuzzo [20]. patrones citogenéticos se clasificaron como PEZ negativo si se muestran o no de baja ganancia genómico (
es decir
, ≤4 copias de
EGFR Hoteles en & gt;. el 40% de las células). Las muestras fueron clasificadas como FISH-positivo si exhiben un alto nivel de polysomy (≥ 4 copias de
EGFR Hoteles en ≥40% de las células) o en caso de mostrar la amplificación de genes, que se define como la presencia de apretado
EGFR
grupos de genes y una relación de
EGFR
/cromosoma 7 centrómero de 2 o más por célula o 15 o más copias de
EGFR
por célula en al menos 10% de las células analizadas .
Estadísticas
χ2 test se utilizaron para analizar la asociación entre el contenido de mutaciones con el número de copias. Se aplicó la prueba de McNemar para comparar disparidad de
EGFR
heterogeneidad mutación entre DHPLC y los brazos. Se aplicó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para comparar la abundancia mutante entre los diferentes grupos de mutación. Las pruebas no paramétricas se utilizó para analizar el contenido de mutación entre los diferentes grupos. Los valores de p & lt dos caras; 0,05 se consideró significativo. Evaluación de los datos se realizó con Todos los cálculos se realizaron con SAS versión 10.0 (SAS Institute, Inc., Cary, NC).
Resultados
Caracterización de los pacientes
Durante el periodo de octubre 2005 a diciembre 2011, 85 pacientes fueron incluidos en este estudio retrospectivo. criterios se evaluaron los subtipos histológicos de cada muestra CPNM sobre la base de Organización Mundial de la Salud (OMS) [21]. El adenocarcinoma es el subtipo histológico más común (63 pacientes, 74,1%). La estadificación del cáncer se realizó de acuerdo con el sistema UICC-AJCC-TNM (versión 7, 2009) [22]. La enfermedad avanzada (estadios IIIb - IV) se identificó en el 61,2% de los pacientes incluidos. Los datos del paciente se resumen en la Tabla 1. Cuarenta y cinco pacientes fueron confirmados como
EGFR
tipo mutante (grupo M), incluyendo 25 pacientes con el exón 19 (grupo de deleciones-M /E19) y 20 pacientes con exón 21 mutaciones (grupo-M /E21).
La heterogeneidad de la mutación EGFR detectado por DHPLC y brazos
microdisección del tumor produjo 2.699 focos, incluyendo 1.238 focos de tipo salvaje
EGFR gratis (grupo-W) y 1.431 casos grupo-M. La frecuencia de mutantes en general en el grupo-M fue de 80,6% en DHPLC (1.154 /1.431) y 87,1% (1.247 /1.431) por las armas. la frecuencia de mutantes variaron ampliamente en los distintos tumores, que oscila entre el 5% -100% en DHPLC y 1% -100% por las armas. muestras Grupo-M fueron subdivididos por el contenido de mutaciones de la siguiente manera: 1) pura
EGFR
se detectó la mutación (100%) o heterogeneidad mutacional en 21 casos por DHPLC (12 grupo-M /E19, 9 Grupo-M /E21) y en 31 casos por las armas (20 grupo-M /E19, 11 grupo-M /E21); 2) moderado contenido mutante (≥50%) o moderada a nivel de heterogeneidad se detectó en 16 casos por DHPLC (10 grupos-M /E19, 6-grupo M /E21) y en 9 casos por las armas (2-grupo M /E19 7 de grupo-M /E21); y 3) un bajo contenido mutante o heterogeneidad de alto nivel (& lt; se detectaron 50%) en 8 casos por DHPLC (3 grupo-M /E19 y 5 del grupo-M /E21) y en 5 casos por las armas (3 grupo-M /E19 y 2 grupo-M /E21).
Entre los 40 casos del grupo W, 4 casos muestran la frecuencia de mutantes bajas que van desde 5,0% a 8,0% cuando focos tumorales microdissected se analizaron por DHPLC. Tres de estos casos lleva a un
EGFR
mutación exón 19, y un caso llevado a un
EGFR
exón 21 mutaciones. ARMAS confirmaron estos 4 casos e identificaron 6 casos adicionales que muestra la frecuencia de mutantes muy bajas que van desde 1,0% a 5,0%. Mediante la combinación de las cajas de grupo-M que llevan tanto de tipo salvaje y mutante de tipo
EGFR
células y los casos de grupos W que contienen células mutantes a baja frecuencia, el 32,9% (28/85) y el 28,2% (24/85 fueron identificadas) de las muestras para llevar a intratumoral
EGFR
heterogeneidad mutacional por DHPLC y los brazos, respectivamente. Diferencia de intratumoral
EGFR
heterogeneidad mutacional identificado por dos métodos no fue estadísticamente significativa (
P = 0,031
, la prueba de McNemar) (Figura 1).
El color diferente de la empanada representan diferentes heterogeneidad mutación de EGFR. La izquierda tres partes (azul claro, púrpura y verde) de cada gráfico representan el porcentaje de casos con la heterogeneidad de EGFR.
análisis semicuantitativo del exón 19 mutaciones por DHPLC
También determina semicuantitativamente la
EGFR
abundancia mutante mediante el cálculo de la relación M /W pico de altura a partir del gráfico DHPLC. Hemos limitado este análisis a la deleción del exón 19 porque la M correspondiente y picos W no se superponen en condiciones no desnaturalizadas (50 ° C) (Figura 2). El medio M /W proporciones del exón 19 fueron 2,43 (rango: 0,40 a 18,15) entre las muestras del grupo-M y 0,12 (rango, 0,06-0,22) entre las muestras del grupo W (
P
= 0,005). En condiciones parcialmente desnaturalizado (62,2 ° C), la M y W picos correspondientes a la sustitución del exón 21 se superponen, lo que impide cualquier determinación de sus alturas relativas.
El gráfico de la izquierda muestra la detección de estado de rutina EGFR mutación por DHPLC y correspondiente tejido mayor. El gráfico de la derecha representan la heterogeneidad mutación de EGFR mediante microdisección. Los dos paneles superiores representan EGFR mutante en los tejidos a granel mostró mutación pura y mutación con la heterogeneidad mediante microdisección, respectivamente. El debajo de los dos paneles representan EGFR silvestre en los tejidos a granel con EGFR de tipo salvaje puro o mezclado con baja frecuencia de mutación de las células mediante microdisección.
número de copias de EGFR
FISH análisis se realizó sobre 85 muestras tumorales para medir
EGFR
en número de copias. Treinta y un casos (36,5%) se consideraron FISH-positivo. La asociación de
EGFR
heterogeneidad mutacional detectado por armas con el
EGFR
número de copias se describe a continuación. Entre los 31 pacientes con 100%
EGFR
células -mutated (heterogeneidad), 71,0% (22/31) fueron clasificados como (amplificación de alta polysomy o gen) FISH-positivo. Por el contrario, la baja
EGFR
grupo -mutated exhibieron aproximadamente el 13,3% PEZ positividad (2/15, incluyendo 10 casos mutantes de baja frecuencia en el grupo-W y 5 casos mutantes de baja frecuencia en el grupo-M) , y la moderada
EGFR
grupo -mutated muestra aproximadamente 22,2% (2/9) positividad FISH (
P
& lt; 0,05; Figura 3 y 4), que fueron similares a la detectada en 30 pacientes con tipo salvaje
En venta EGFR se recogieron los focos de microdisección mediante brazos (5/30, 16,7%,
P
= 0,75).
Los diversos
contenidos EGFR
mutación se representan en la leyenda.
Evaluación del gen EGFR se realizó número de copias por FISH utilizando el
EGFR gratis (naranja) CPA 7 sonda (verde) /(Beijing GP médica Tec., LTD, china). Paneles ilustran las muestras de tumor que representan la amplificación de genes (A) y la disomía (B).
La heterogeneidad según el tipo histológico y el estadio
El adenocarcinoma fue el patrón histológico más común identificado en este estudio (74,1 % de los sujetos); esto era de esperar en una serie predominantemente quirúrgico. La positividad de
EGFR
mutación en el adenocarcinoma, como se confirmó mediante análisis de microdisección, fue del 91,8%. La relación H /W fue 2,57 (intervalo, 0,13-18,15). En comparación, el
frecuencia de mutación de EGFR
fue menor entre los otros patrones histológicos (70,9%), y sólo 3 casos lleva a la
EGFR página 19 mutación con relación M /W 1,53. Basado en el sistema de estadificación del tumor UICC-TNM-AJCC, 50 tumores fueron clasificados como estadio IIIa y IIIb (localmente avanzado) y 35 fueron clasificados como estadio IV (avanzado). No se observaron diferencias significativas en la tasa de mutación y abundancias positiva entre las etapas localmente avanzado y avanzado NSCLC (tasa, 87,7% frente a 86,3%,
P = 0,875
; relación M /W, 2,12 vs 2,86,
P = 0,662
).
Impacto de la heterogeneidad mutacional del EGFR en respuesta a EGFR-TKI
Entre los 85 casos, 26 pacientes recibieron EGFR-TKI como primera línea o multi- terapias de línea. 9 pacientes mostraron una respuesta parcial (RP), 7 tenían enfermedad estable (SD), y 10 enfermedad progresiva con experiencia (PD). De acuerdo con los resultados de las armas, el contenido mutante media fue de 86,1% (247/287) en el grupo de relaciones públicas, el 48,7% (110/226) en el grupo SD, y el 6,0% (19/317) en el grupo PD, y con una diferencia significativa (
P
= 0,001).
Hemos dividido 26 pacientes en tres grupos de acuerdo a la mutación de EGFR estado heterogéneo, que eran "pura EGFR tipo salvaje", "mutación de EGFR con la heterogeneidad" y "EGFR mutado pura". El PFS fueron 3,01 meses (IC del 95%: 0,51 a 5,52), 11,35 meses (IC del 95%: 6,37 a 15,21) y 16,21 meses (IC 95% 8,21-25,19) para los tres grupos, respectivamente (P = 0,001).
Discusión
intratumoral
EGFR
homogeneidad mutación tiempo se ha supuesto en los cánceres de pulmón. Como tal, la determinación de un paciente de
EGFR
estado de la mutación fue interpretado utilizando métodos cualitativos. Sin embargo, sólo una fracción de los pacientes que albergan
EGFR mutaciones
responder a EGFR-TKI, lo que sugiere que los factores adicionales más allá de la mutación EGFR contribuyen a la respuesta al fármaco de un paciente. Además de varios biomarcadores relacionados (
por ejemplo
., K-ras, T790M, c-Met), intratumoral
EGFR
heterogeneidad mutacional ha sido propuesto como mediador candidato de la resistencia a EGFR la terapia de TKI, a pesar de la existencia de dicha heterogeneidad se ha disputado [15] - [17]. En el presente estudio, se observó una heterogeneidad mutacional intratumoral utilizando ambos métodos DHPLC y los brazos.
Una de las controversias sobre la heterogeneidad intratumoral de
EGFR
mutación es si la heterogeneidad atribuye al uso de una baja sensible método de detección, sobre todo cuando mutado señal está por debajo del umbral de detección. Para excluir la posibilidad, hemos utilizado dos métodos de prueba, DHPLC y los brazos, para evaluar la
EGFR
estado de la mutación en los focos intratumoral microdisecado. ARMAS está pensado como un gran ensayo sensible para
EGFR
detección de mutaciones. Mientras que el método de DHPLC no ha sido ampliamente utilizado para
EGFR
análisis de mutaciones, sin embargo, es una alta sensibilidad y especificidad se ha demostrado en nuestros estudios y otros (límite de detección de 3% ~ 10%) [19], [23] - [26]. Los resultados mostraron la parte de especímenes de localmente avanzado y avanzado NSCLC presentan la coexistencia de
EGFR
mutantes y de tipo salvaje células, independientemente de la DHPLC o brazos están utilizando, lo que sugiere que la intratumoral
EGFR
heterogeneidad mutado de hecho existió y no se derivan de la parcialidad de los métodos de detección o frecuencias bajas mutadas intratumorales
.
con el fin de caracterizar mejor la heterogeneidad intratumoral de
EGFR
, que microdissected tejido tumoral para obtener mayor 28-34 focos por tumor y analizó cada foco de
EGFR
estado de mutación utilizando métodos cualitativos y semi-cuantitativos. La mayoría de los focos de microdisección fueron identificados como
EGFR
de tipo mutante con
EGFR
contenido de mutación que van desde 1% a 100%. Los estudios teóricos y experimentales han informado de que las células cancerosas del mismo genotipo localizar de forma contigua [27]. El análisis de una pequeña muestra de tejido tumoral extirpado probablemente indicar una población genéticamente idéntico de las células cancerosas. Sin embargo, nuestro análisis de
EGFR
estados de mutación de numerosos focos intratumorales indicó heterogeneidad. Se excluyeron los sitios no malignas por visualización microscópica, y cada espécimen microsampled se cotejaron para confirmar que el porcentaje de tejido del tumor fue de al menos el 90%, lo que garantiza que las áreas microdissected no estaban contaminadas por las células no cancerosas. Por lo tanto, nuestros datos confirman la existencia de intratumoral
EGFR
heterogeneidad mutacional.
Yatabe et al. (2011) [17] informó de que las distribuciones heterogéneas de
EGFR
mutaciones en el adenocarcinoma de pulmón eran extremadamente raros. Los autores sugirieron que la heterogeneidad tumoral informado de otros era en realidad un pseudoheterogeneity resultante de un desequilibrio específico de alelo mutante (MASI) o de heterogéneamente distribuidos
EGFR
amplificación. Varios estudios apoyan la ocurrencia de MASI en las células tumorales EGFR mutado, y este fenómeno se asocia con un aumento de alelo mutante actividad transcripcional [28] - [30].
EGFR
mutaciones, ganancias de número de copias de genes, y MASI ocurren juntos en las células tumorales parece sinergizar para efectuar un fenotipo más maligno que estas alteraciones individualmente [28] - [30]. Se observó una elevada
EGFR
número de copias entre los pacientes con pura
EGFR
mutaciones, lo que sugiere que una alta frecuencia de
EGFR
mutaciones ocurren con frecuencia con un elevado
EGFR
número de copias (MASI). Sin embargo, en los pacientes que muestran una heterogeneidad intratumoral,
EGFR
número de copias fue menor que en pacientes con pura
EGFR
tumores mutantes. La posible explicar es que los tumores heterogéneos no sólo contenían
EGFR
células mutantes, sino también las células de tipo salvaje, y la amplificación selectiva de alelos mutantes podrían ser diluidos por los alelos de tipo salvaje, dando lugar a una relativamente baja
EGFR
número de copias.
Entre los tumores que albergan a granel de tipo salvaje
EGFR
, 10 de 40 casos mostraron frecuencias muy mutantes más baja (5-8%) a través de análisis de microdisección en comparación con el 45 los pacientes que albergan mutante
EGFR
. Este llamado "falsa negatividad", medida a partir de tejido mayor podría ser debido a la incapacidad de DHPLC para detectar pequeñas cantidades de ADN mutante cuando pocas células mutantes están contenidas en una muestra. También se determinó semicuantitativamente abundancia mutante mediante el cálculo de la relación de las alturas (H /M) de la gráfica DHPLC. De acuerdo con nuestros datos, la mediana de la relación M /W varió desde 0,13 hasta 18,15 en
EGFR
casos mutantes y ,06-0,22 en los casos de tipo salvaje, lo que sugiere que las células cancerosas en el tejido tumoral mayor por lo general contienen mutante y tipos no mutantes simultáneamente. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio de aplicación de la relación H /W para determinar semicuantitativamente
EGFR
estado de mutación e inferir la heterogeneidad intratumoral.
Sólo 26 pacientes recibieron EGFR-TKI, lo que limita el poder estadístico de este brazo del estudio. Sin embargo, hemos detectado una tasa de mutación significativamente mayor en los pacientes focos de PR y SD en comparación con los pacientes con EP. Estos resultados fueron consistentes con varios otros estudios. Taniguchi et al [31] analizaron la relación entre el
EGFR
heterogeneidad y la respuesta a EGFR-TKI por microdisección en los tumores de NSCLC en etapa temprana, e informó que los pacientes con un mayor
EGFR
frecuencia de mutación eran más sensibles a EGFR-TKI y mostró el tiempo de supervivencia libre de progresión más largos que los pacientes con bajos
EGFR
tasas de mutación. Especulamos que la rápida progresión del tumor se puede producir en las muestras con un bajo porcentaje de
EGFR
células mutantes, debido al hecho de que la apoptosis
EGFR
eran células mutantes que responden a EGFR-TKI superado por la proliferación Las células no mutantes. Sobre la base de esta especulación, se sugiere que la heterogeneidad intratumoral puede ser un factor importante que contribuye a la resistencia a EGFR-TKI. Las respuestas del paciente puede, mediante la mejora mediante la administración de una combinación de terapia EGFR-TKI y otros productos terapéuticos capaz de eliminar la no
EGFR
células tumorales mutantes de manera simultánea o secuencial.
En general, nuestros hallazgos sugieren que los pacientes con cáncer de pulmón avanzado albergaron marcados EGFR heterogeneidad mutacional. La importancia clínica más importante de EGFR heterogeneidad mutacional puede ser capaz de explicar el mecanismo de resistencia de EGFR-TKI. Secundaria, la heterogeneidad intratumoral de mutación de EGFR también indican que un solo punto o biopsia de una sola vez no sean método óptimo para determinar la terapia personalizada EGFR-TKI. histológicos y genéticos combinatoria enfoques que utilizan información sobre los perfiles de supervivencia y de respuesta pueden proporcionar mejores inferencias para la prevención eficaz de la enfermedad y la curación en el futuro.
Reconocimientos
Agradecemos Prof Keneng Chen en el Departamento de Cirugía Torácica para proporcionar muestras parciales, el Dr. Wang Ning en el Departamento de Radiología para la evaluación de la respuesta del tratamiento, el doctor Yu Sun en el Departamento de Patología, por su contribución en el análisis de las muestras de la Universidad de Pekín hospital Cancer & amp; Instituto. Agradecemos a Prof. Yao Chen (Universidad de Pekín Instituto de Investigación Clínica) y Dr.Guoshuang Feng (Centro de Distrito de Chaoyang para el Control y Prevención de Enfermedades) para el análisis estadístico.