Extracto
En representación de una fuente renovable para el reemplazo de células, las células madre neurales han recibido una gran atención en los últimos años. El ensayo neurosphere representa un método para detectar la presencia de células madre neurales, sin embargo, debido a una deficiencia de marcadores específicos y definitivos para identificarlos, su cuantificación y la tasa que se expanden aún es indefinido. Aquí proponemos una interpretación matemática del ensayo neurosphere permitiendo la medición real de células madre neurales por división de frecuencia simétrica. El algoritmo del modelo demuestra una correlación directa entre la expansión pliegue general de la célula con el tiempo medido en el ensayo de la esfera y el tipo de células madre se expanden a través de la división simétrica. El modelo ofrece una metodología para evaluar específicamente el efecto de las enfermedades y los tratamientos sobre la actividad de células madre neuronales y la función. No sólo proporcionar nuevas perspectivas en la evaluación de las características cinéticas de las células madre neurales, nuestro modelo contempla además la biología del cáncer como se han sugerido las células madre, como el cáncer de mantener el crecimiento del tumor como células madre somáticas mantener la homeostasis del tejido. De hecho, la resistencia de las células madre del tumor a la terapia hace que estas células de un objetivo necesario para el tratamiento eficaz. El modelo matemático ensayo neurosphere que aquí se presenta permite la evaluación de la tasa de células madre-como malignas se expanden a través de la división simétrica y la evaluación de los efectos de la terapéutica en la auto-renovación y la actividad proliferativa de esta población clínicamente relevantes que impulsan el crecimiento del tumor y la recidiva.
Visto: Deleyrolle LP, Ericksson G, Morrison BJ, JA López, Burrage K, Burrage P, et al. (2011) Determinación de somática y el cáncer de células madre auto-renovación simétrica División Tasa de Uso de Esfera ensayos. PLoS ONE 6 (1): e15844. doi: 10.1371 /journal.pone.0015844
Editor: Mike O. Karl, CRT Dresden, Alemania |
Recibido: 4 Agosto, 2010; Aceptado: 25 Noviembre 2010; Publicado: 5 Enero 2011
Derechos de Autor © 2011 Deleyrolle et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud (NIH) y el Consejo de Investigación médica y Salud Nacional (NHMRC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Tradicionalmente, se creía que las células madre que se encuentra sólo en tejidos en los que las células diferenciadas son más susceptibles a la pérdida y la necesidad del reemplazo grande, tal como la piel [1], los epitelios intestinales [2] y la sangre [ ,,,0],3]. Dado que el sistema nervioso central adulto (CNS) se consideró que carecen de una cantidad significativa de la muerte neuronal, y no tienen capacidad de regeneración, la existencia de células madre neurales (NSC) parecía tanto poco probable, e innecesario. Sin embargo, en 1992 se demostró la existencia de células madre neurales en el SNC de mamíferos adultos con la capacidad de dar lugar a nuevas neuronas [4]. Al igual que las células madre se encuentran en otros tejidos, células madre neurales (que recubren los neuroeje enteras ventriculares del SNC de mamíferos adultos [4], [5]) exhiben la definición de
in vitro
tallo características de las células [2], [6] de la proliferación, extensa auto-renovación, la generación de un gran número de progenie, y potencial de diferenciación multi-linaje, así como la
in vivo
característica de regenerar el tejido después de la lesión [4], [7], [8 ]. Las células madre adultas representan un depósito relativamente quiescente de células no comprometidas. Estas células tienen la capacidad de dividirse durante toda la vida del organismo para dar lugar a células progenitoras más comprometidas que generan un gran número de células no diferenciadas. Estos progenitores en última instancia, se diferencian en células funcionales linaje restringido. Debido a su capacidad para dar lugar a nuevas células, los factores que regulan la división de las células madre y progenitoras, y la diferenciación de su progenie es de gran interés en el tratamiento de trastornos del SNC que resultan de la pérdida o el funcionamiento inadecuado de las células. Por lo tanto, el desarrollo de herramientas que permitan estudio específico de células madre representa un desafío formidable. Las células madre son difíciles de definir visualmente, ya que no existe ningún marcador positivo bien aceptada. Como resultado, estas células se definen basándose en una definición funcional. Si bien el empleo de un funcional de lectura de salida ha hecho posible identificar la presencia (o ausencia) de las células madre en una población, que por desgracia prohíbe el aislamiento directo o la discriminación de las células madre a partir de células no madre impidiendo de ese modo todos los datos cuantitativos significativos relativos a su frecuencia y /o expansión tasa.
un creciente cuerpo de evidencia apoya la hipótesis de que una población de células iniciadoras de tumores (TIC), que exhiben propiedades biológicas similares a las células madre somáticas normales, mantiene los tumores malignos. Los tics se postularon a residir en la leucemia mieloide aguda [9], así como en cáncer de mama [10], [11], de próstata [12], tumores de pulmón y mesenquimales [13]. Es importante destacar que, tics neuronales también se han aislado y encontrado que exhiben propiedades funcionales muy similares a las células madre neuronales [14], [15], [16], [17]. El modelo llamado cáncer de células madre sugiere que son estas características las células madre que forman las TIC resistentes al tratamiento e impulsan la recurrencia del tumor. Como resultado, estas células representan un objetivo esencial para la terapia contra el cáncer eficaz. Por lo tanto el desarrollo de los métodos de investigación de su biología y comportamiento cinético es relevante para el diseño de tratamientos innovadores dirigidos a esta población celular específica.
En el SNC, uno de los métodos para aislar y expandir las células somáticas y germinales de cáncer es el neurosphere ensayo (NSA) [4], [14], [15], [18]. De interés y que acredite a su robustez, el sistema de cultivo esfera de libre flotación también se utiliza para estudiar entre otras, las células madre del cáncer de mama [11], [19]. Sin embargo, mientras que la NSA es un método adecuado para identificar la actividad de células madre, sostenemos que la enumeración de las esferas no es apropiado para medir la frecuencia de células madre o la tasa de expansión ya que esto da lugar a una sobreestimación [20], [21].
el actual estudio presenta el desarrollo, validación y aplicación de un método que permita específicamente cuantificación de células somáticas tasa de división simétrica y cáncer madre utilizando ensayo de esfera flotante.
resultados
experimento mental
a diferencia del cultivo y los pases de la mayoría de las líneas en las que la mayoría de las células sobreviven desagregación y pasar a proliferar hasta que el cultivo se vuelve confluente, durante los pases en la NSA, la mayoría (& gt; 90%) de las células mueren o no proliferan más. Esto es apoyado por el hecho de que durante un paso de la mayoría de las células en división da lugar a al menos 256 progenies al someterse a un mínimo de ocho divisiones celulares (datos no mostrados). Esto daría lugar a una expansión de 256 veces en cada paso si cada célula de chapado solo eran el factor de crecimiento y de respuesta dividida 8 veces. Sin embargo, nuestros experimentos descritos a continuación muestran una expansión pliegue celular entre 1 y 20 con los diferentes tipos de células que utilizamos. Estos datos, junto con los datos de clonalidad publicados [20], [21], [22] demuestran que menos del 10% de las células sembradas en la NSA contribuir a la expansión de la población general. Por tanto, sólo la fracción superviviente de células de formación de esferas de factores de crecimiento que responde a dividir, forman esferas, y renovar la población fundadora. La muerte celular a pesar de, durante cada paso, hay un aumento geométrico en el número de células que se generan. Normalmente, si se siembran 100.000 células, mayor que 90.000 de las células mueren dentro de las primeras 24-48 horas, dejando a 10.000 células a proliferar, forman esferas y en última instancia generar alrededor de 500.000 células. Esta expansión 5 veces tiende a ser bastante constante al pasar las células a través del tiempo y nunca muestra una escalada dependiente del tiempo en la expansión de plegado (es decir, 5 veces, 7 veces, 8 veces, etc.) [23]. Además, cada línea neurosphere individual es esencialmente único con respecto a la doblez-aumento en el número de células generadas a partir de paso a paso (algunas líneas pueden mostrar una expansión 5 veces, mientras que otros una expansión 6 o 4 veces), pero consistente en la línea en particular.
la capacidad de NSC indefinidamente por pases seriados [23] y el hecho de que la mayoría de las células mueren o dejan de proliferar en cada pasada, indica que la población debe ser mantenida por una célula en proliferación a largo plazo (s) (por definición una célula con características de células madre). Nos contenido que la frecuencia de las células a largo plazo proliferantes (LTP) (también conocido como NSC) se refleja en la velocidad a la que se expande la población (es decir, doblar aumento de paso a paso) y esto se refleja en la pendiente de la curva de crecimiento. Con el fin de entender cómo las divisiones simétricas auto-renovación de células LTP afectan la curva de crecimiento, considere el siguiente experimento mental (Figura 1)
(a):. Simulación numérica de /crecimiento de las células progenitoras madre. A medida que aumenta el número de células madre (es decir, células LTP) generados en una esfera clonalmente derivada, la expansión general veces y la pendiente de la curva de crecimiento se incrementan también. (B): Si el número de células madre (LTP) dentro de una esfera se mantiene constante y se duplica el número total de células dentro de una esfera (ii) o cuadruplicado (iii), ni la expansión pliegue ni la pendiente de la curva de crecimiento se cambian sin embargo se eleva la curva. LTP, a largo plazo la proliferación de las células; STP, a corto plazo la proliferación de las células; ND, las células que no se dividen.
(Figura 1a) En el caso de una célula LTP que genera una esfera de 1.000 células sin someterse a ningún divisiones celulares simétricas, la esfera resultante contendrá sólo una única PLP celda. Tras un paso posterior, todas las células volverán a morir o no participar en la expansión de cultivo con excepción de la única célula LTP, que sobrevive, divide, y forma una nueva esfera. A medida que seguimos el paso de esta esfera (o población de células) de esta manera se podría observar una expansión de 1 canal, que está representado por una curva de crecimiento plana como se ve en la figura 1a (i).
Considere ahora que una sola célula LTP se somete a una división celular simétrica auto-renovación, ya que genera una esfera de 1000 células. En este caso la esfera tendría 2 células LTP. Tras un paso posterior, 998 de las células morirían y cada una de las dos células LTP daría lugar a una esfera de 1000 células. Esta duplicación del número total de esferas (y por tanto las células) continuaría, dando una curva de crecimiento que se parece a la figura 1a (ii).
Por último, si tenemos en cuenta que la célula se somete a LTP 3 divisiones simétricas que dan lugar 4 células de LTP y 996 células no LTP, esto produciría una expansión de 4 veces en cada paso y una curva de crecimiento que se expresa como en la Figura 1a (iii).
(Figura 1b ) Si ahora mantenemos el número de células de LTP en una constante esfera (por ejemplo, 4) y con cada iteración de cambiar las células totales generados por la esfera a partir de 1000 (i) a 2000 (ii) a 4000 (iii), nos encontramos con que la elevación de la curva de crecimiento se ve afectada pero no su pendiente (como se ve por una expansión pliegue sin cambios). Esto indica que el número total de células generado influye en el gráfico, pero no la pendiente de la curva de crecimiento.
Por lo tanto, la expansión de células veces, representado por la pendiente de la curva de crecimiento, refleja la velocidad a la que la LTP células se expanden. Dado que la tasa de expansión de las células LTP es una indicación directa de los números de divisiones celulares simétricas auto-renovación, se deduce que la expansión pliegue o pendiente se pueden utilizar para predecir LTP (o tallo) de células auto-renovación división simétrica.
el modelado matemático
Supuestos.
a continuación se propone un modelo matemático que permite cuantificar la división de células madre simétrica de auto-renovación en cultivo de tejidos.
rompemos la la clase de todas las células posibles en dos tipos (i) división de las células y las células (ii) que no se dividen (ND). Los ejemplos de células ND son células que se han diferenciado totalmente o células que han muerto. Rompemos aún más la clase de células que se dividen en dos subtipos, células proliferantes a largo plazo (LTP) y las células (STP) en proliferación a corto plazo. El tiempo de vida de las células de LTP se define para ser infinita, y en el contexto de un entorno experimental, significa que la vida útil es más larga que la del experimento. Los productos de una división celular LTP se supone que son o bien dos células LTP (división auto-renovación simétrica) o una célula de LTP y una célula STP (división celular asimétrica). Asumimos la diferenciación tasa de división celular simétrica LTP (LTP → STP + STP) a ser nulo en las condiciones de cultivo original del ensayo. Suponemos además que durante el tiempo de experimento de la supervivencia y propiedades de auto-renovación de las células de LTP es definitiva y estable (definido por un estado estacionario como se discute más adelante).
La vida útil de las células de STP se define como finito, que en el contexto de un entorno experimental, significa que el tiempo de vida es significativamente más corto que el del experimento. Los productos de una división celular STP se supone que son cualquier combinación binaria de células STP y células ND. Se debe enfatizar que esto excluye específicamente la división celular STP de producir una célula de LTP. Asumimos además que cualquier célula en división, cuando se coloca en el entorno correcto, se procederá a través de su ciclo celular y, finalmente, dividir, de una manera que es independiente de la presencia de otras células. Los productos de la división de las células se adherirán y el ciclo celular continúa para todas las células en división. Después de un tiempo, un grupo de células, en lo sucesivo como una esfera, se han desarrollado. Es importante destacar que estas suposiciones implican que una esfera procedente de una célula STP contendrá células STP y células ND, mientras que una esfera procedente de una célula LTP LTP contendrá células, células y células ND STP.
neuroesferas pases implica necesariamente la disociación de las esferas en los componentes individuales (es decir, células). Una fracción de estas células constituyentes son entonces muestras al azar y se sembró en un nuevo matraz que contiene un entorno permisivo para la división celular (Figura 1). Aquí asumimos que las células son células madre LTP-como, mientras que las células de STP son células progenitoras más restringidas. Por lo tanto, la expansión a largo plazo de la población depende directamente de la expansión de la LTP y no las células STP. Hemos demostrado anteriormente que 95% de las esferas en la NSA no se puede pasar más de 4 o 6 veces lo que sugiere que la mayoría de las esferas se derivan de células de STP y que las células LTP exhiben un mayor potencial proliferativo [20], [21]. Por lo tanto, para definir con precisión una población de células contiene células madre similares (es decir, LTP) el tiempo de curso general del experimento necesita abarcar mayor que 4 a 6 pasajes.
El modelado directo del Ensayo de neuroesferas.
Después de unos pasajes iniciales (que corresponden a un "período de recuperación", si a partir de tejido primario recién disecados), la disociación, chapado, y cada vez mayor de esferas en cultivo en masa se convertirá consistente como el proceso alcanza un estado estable que refleja un equilibrio complejo entre la supervivencia celular, la muerte, la proliferación y la diferenciación. Es decir, se siembran un número inicial de células (por ejemplo, 2,5 × 10
5), que generan las esferas y producir un recuento total de células para el frasco (por ejemplo, 1 × 10
6), una parte de los cuales se cosechan (por ejemplo, 25% son llevados) y se utilizó para sembrar otro matraz para el paso. Las cantidades medibles son el recuento de células al inicio del pasaje,
T
i
, y el recuento de células al final del pasaje,
T
f
. La expansión de plegado,
F
, se calcula
Después del período de adaptación de las células a condiciones de cultivo, cuando el experimento ha entrado en el estado estable, F es constante dentro de los límites de la experimentación error. Si el estado es estable, entonces también debe ser cierto que el número inicial de células LTP, STP y ND son los mismos para cada pasaje. Del mismo modo, los números finales deben ser los mismos para todos los pasajes. Además, estos tipos de células deben ser sometidos a la misma expansión global veces, es decir, España
Dado que las células LTP sólo pueden ser creados a partir de células de LTP, y cada célula LTP forma una esfera, entonces también debe ser cierto, que en promedio , hay
F
células LTP en todas las esferas derivada LTP. Es decir, el número de células LTP creados en un LTP se originó esfera (definido como
l
) ha de facilitarse por,
l = F
.
El mismo análisis no se puede aplicar a las células STP porque tanto LTP y células STP producen células STP. Del mismo modo, el mismo análisis no se puede aplicar a las células ND. Como tal, el análisis de datos se convierte en una cuestión de la medición de los recuentos de células al inicio y al final de cada paso, que divide los dos para proporcionar una expansión de plegado, entonces el promedio de las expansiones de plegado de pasajes en el estado estable. Por definición, este promedio es equivalente al número de células (es decir LTP NSC) en una esfera derivado de LTP. Por lo tanto, esta metodología debería reflejar con precisión la frecuencia de células madre similares en esferas derivadas de células madre similares.
LTP auto-renovación tasa de división simétrica.
La unidad de tiempo más pequeña en el modelo anterior es un solo paso. Ahora derivamos un modelo para el número de células LTP intra-paso. Como se señaló anteriormente, la división celular LTP tiene dos resultados posibles (i) un
división simétrica
auto-renovación (LTP LTP → + LTP) o (ii) una división asimétrica (LTP LTP → + STP). Se denota la probabilidad de que el primer resultado de
p
ll
y el segundo resultado por
p
ls
. Puesto que no hay otros resultados posibles, la suma de estas dos probabilidades debe ser la unidad. Deja que el tiempo de ciclo celular de las células de LTP se denota por
c
l
. La probabilidad de una división celular simétrica por unidad de tiempo es, pues,
p
ll
/
c
l
. Esto también se puede interpretar como la tasa de división celular simétrica LTP y lo denotaremos por
K
ll
. Puesto que sólo las células LTP producen células LTP, la tasa de crecimiento del número de células LTP es proporcional a los números totales actuales de células LTP. También hay que señalar que una división asimétrica no cambia el número total de células de LTP. La tasa de crecimiento del número de células de LTP por lo tanto se puede expresar como
Esta expresión puede ser resuelto para expresar el número absoluto de células LTP a la vez
t
, España
ahora es posible equiparar este modelo con el modelo directo anteriormente. Para un pasaje a partir de t = 0 y terminando en t =
t
f
, España
Reorganización de esta expresión se obtiene un método de cálculo de la tasa de división celular LTP simétrica
es decir, la tasa de células LTP división simétrica de auto-renovación se puede calcular tomando el logaritmo natural de la expansión de plegado y dividiendo por el tiempo de paso. Por lo tanto, los cambios en la expansión de plegado (pendiente de la curva de crecimiento) reflejan modificaciones en la LTP (es decir, tallo) la frecuencia de células por variaciones en su tasa de división celular simétrica de auto-renovación.
La validación del modelo mediante el Neural de colonias de células ensayo de formación de (N-CFCA)
similar a NSCs (células LTP), las células progenitoras (STP) tienen la capacidad de proliferar, y generar progenie que pueden diferenciarse en células funcionales. Sin embargo, a diferencia de las células madre, las células progenitoras tienen un potencial de proliferación tiempo extra más limitada. El ensayo desarrollado recientemente neural de formación de colonias de células (N-CFCA) explota estas diferencias en la capacidad proliferativa, lo que permite una discriminar NSCs a partir de progenitores en función del tamaño de las colonias que producen cuando se transfiere a la cultura [21]. Consistente con la hipótesis de que las células progenitoras exhiben capacidad proliferativa limitada en comparación con las células madre, y que el tamaño (diámetro) de la colonia puede ser utilizado para distinguir su tipo de célula fundador, hemos demostrado que las colonias grandes (& gt; 2 mm) tienen una mayor potencial proliferativo y exhibir todas las características principales de células madre de cultivo de tejidos (extensa auto-renovación, la generación de gran cantidad de progenie y potencial de diferenciación multi-linaje) en comparación con las colonias más pequeñas (que no presentan estos criterios de células madre). Por lo tanto, la N-CFCA proporciona un método para enumerar los nervios frecuencia de células madre [21].
Para apoyar el modelado matemático de la NSA con experimentos biológicos hemos comparado el cultivo y expansión de células madre neurales embrionarias y adultas murinos en condiciones que dan lugar a diferentes tasas de crecimiento (es decir, diferentes de expansión veces implican diferente tasa de división simétrica de auto-renovación de células madre). Mientras que el modelo NSA no permite cuantificar con exactitud el número de células madre (debido únicamente a que no se sabe cuántas células madre que empezamos), sí permite una comparación entre los grupos de poblaciones de la tasa de expansión de células madre, que refleja la frecuencia de la división de células madre simétrica. En este caso particular, se comparó la expansión de células pliegue de las siguientes condiciones (Tabla 1): culturas (Grupo 1) fetal E14 vs NSC adultos edad (20 meses), las culturas NSC (Grupo 2) culturas fetal E14 NSC con el EGF mitógeno vs . el uso de cultivos de adulto NSC con el EGF mitógeno vs. el uso de EGF + EGF + bFGF bFGF, (Grupo 3). A partir de estas medidas de la célula madre tasa de división simétrica efectiva (K
ll
) fue derivado (Tabla 1). las células madre fetales cultivadas con ambos factores de crecimiento exhibieron un aumento de la tasa de expansión 7,16 veces en comparación con 24 meses células madre de edad cultivadas con EGF solo (grupo 1) y una diferencia de 1,33 veces en comparación con los cultivos fetales expuestas a EGF solo (grupo 2 ). Grupo 3 muestra una diferencia de 1,57 veces entre las dos condiciones. Estas diferencias dentro de los grupos en las células madre tasa expandido se correlacionó con el número absoluto de células madre medidos utilizando el N-CFCA (Fig. 2) y los resultados de la comparación se muestran en la Tabla 2. Para probar la hipótesis de que ambas metodologías fueron similares se comparó la diferencia de su salida a cero utilizando la prueba t de Student. El valor p de la prueba estadística fue de 0,28 lo que demuestra que ambos ensayos predicen un cambio similar en la relación del número de células madre neurales o se pliegan de expansión (también conocido como tasa de división simétrica de auto-renovación), la validación de esta interpretación matemática de la NSA.
las células de cada grupo se cultivaron en la N-CFCA. Los gráficos se comparan en cada grupo, el número de colonias grandes, mayor de 2 mm de diámetro (el único rango de tamaño que presenta todas las características clave de células madre de cultivo de tejido) obtenida después de 21 días
in vitro
. * P = 0,039, ** p = 5,38 × 10
-11, n = 15, t-test, 2 colas.
La aplicación del modelo
a continuación, utiliza el modelo como una metodología para el estudio de células madre somáticas mecanismo de división simétrica de auto-renovación. El uso de la N-CFCA, que anteriormente mostró que el receptor de la hormona del crecimiento knock out (GHR - /-) ratones mostraron significativamente menos células madre derivadas región periventricular, en comparación con los animales de tipo salvaje (23 ± 3 vs 40 ± 3) [24]. Del mismo modo, se cultivan en la NSA, en comparación con las células madre neuronales de tipo salvaje, GHR - /- NSC se expandieron a una tasa más baja significativa (. 2,04 ± 0,2 vs 3,63 ± 0,4, la figura 3a) [25] correlacionada con una disminución simétrica de autorrenovación tasa de división (Fig. 3b). Una vez más, los dos ensayos predijeron las mismas relaciones entre las dos poblaciones (1,74 y 1,78 para la N-ACCP y la NSA, respectivamente) [24]. Estos resultados sugieren que la señalización de la hormona del crecimiento controla la auto-renovación de las células madre neurales somáticas regulando su velocidad de división simétrica. Pluchino y colegas describen el efecto inhibidor de la inflamación crónica en células madre de auto-renovación [26]. Este estudio informó de que la exposición de la zona subventricular adultas derivadas de células madre para inducir la inflamación citoquinas Th1 causó una disminución significativa en el número de NSCs medida con el N-CFCA y que este fenómeno fue acompañado con una disminución de la pendiente de la curva de crecimiento [ ,,,0],26]. Estos datos validan aún más nuestra interpretación matemática del ensayo neurosphere y apoyan el modelo en el que las citoquinas Th1 regulan por disminución tasa de expansión de las células madre adultas somáticas a través de células simétrica mecanismo relacionado con la división
.
(a-b) En comparación con los animales de tipo salvaje , GHR - /- células madre neurales exhibieron menor tasa de expansión (a, ** p = 0,005, n = 7, t-test, 2 colas), que se correlaciona con una frecuencia de división celular disminuido simétrica (b, ** p = 0,003, n = 7, t-test, 2 colas). (C-d) Comparación del crecimiento en el ensayo neurosphere de tres muestras de GBM humanos mostraron expansiones distintas de plegado (c) y las pendientes de la curva de crecimiento (d). se utilizó la prueba t (2 colas) para comparar la expansión de plegado entre las líneas A y B (*** p = 1,4 × 10
-6, n = 8-9), las líneas A y C (** p = 1,4 × 10
-5, n = 8-6) y las líneas B y C (* p = 0,001, n = 9-6). (E) La célula de cáncer simétrica por división de frecuencia LTP (K
ll
) fue derivado de la expansión veces observado en cada pase. t-test (2 colas) se utilizó para comparar la K
ll
entre las líneas A y B (*** p = 8,34 × 10
-12, n = 8-9), líneas A y C (** p = 1,66 × 10
-8, n = 8-6) y las líneas B y C (* p = 0,002, n = 9-6). (F) El análisis de supervivencia después de la implantación en el cuerpo estriado de ratones NOD /SCID de 200.000 células de tres líneas de células tumorales diferentes demostró una relación inversa entre la tasa de división simétrica de la célula cancerosa proliferativa a largo plazo y la progresión de la enfermedad. prueba de rango logarítmico, p = 0,0038 comparación de A a B, p & lt; 0,0001 comparación de A a C y B a C. (g) El gráfico representa la media de supervivencia después de hGBM trasplante intracraneal como una función de las células de cáncer de LTP tasa sido sometidos a división simétrica (K
ll
). Las líneas discontinuas corresponden a la banda de confianza 95% del ajuste de la curva obtenida por regresión no lineal (y = 2,323 - 0.2091x + 0.005125x
2). Coeficiente R también se muestran
2 y el valor p.
El modelo matemático podría también ser aplicada a la biología del cáncer. Existen varios tipos de cáncer, incluyendo los de mama y sistema nervioso central, contienen células que presentan características de células madre similares tales como la propiedad de repoblación a largo plazo [10], [14], [16], [27]. La hipótesis de las células madre del cáncer afirma que los tumores se organizan jerárquicamente y mantenidos por una subpoblación de células madre, como el cáncer de repoblación a largo plazo que proporcionan propiedades terapéuticas refractariedad. Por lo tanto, la comprensión de la dinámica de estas células es de gran interés para comprender la biología del cáncer y diseñar tratamientos innovadores y específicos. Usamos nuestro modelo para comparar las células del cáncer de tallo-como (aka células cancerosas LTP) por división de frecuencia simétrica de auto-renovación y la progresión tumoral entre varias líneas de células adultas humanas de glioblastoma multiforme (hGBM) obtenidas en las condiciones de ensayo Neurosphere [16]. Los tres diferentes muestras hGBM analizados (A, B y C) y generados en nuestro laboratorio mostraron perfiles de expansión distintos (reflejados por diferentes pendientes de la curva) y los tipos de células de cáncer de LTP simétricas de división (Fig. 3c-e). trasplante ortotópico de 200.000 células a partir de muestras hGBM A, B y C en el cuerpo estriado de los ratones inmunocomprometidos condujo a la formación de tumores seguido de la muerte de los animales (Fig. 3F). Es importante destacar que la progresión de la enfermedad fue directamente e inversamente correlacionada con la tasa de división simétrica de auto-renovación de las células de cáncer de LTP. Esto se expresó mediante la comparación de la supervivencia media de los animales huésped implantado con una de las tres líneas de células madre tumorales hGBM a la tasa de división simétrica celular de cáncer de LTP (K
ll
) (Fig. 3 g).
Además de los tumores cerebrales hemos aplicado nuestro modelo de cáncer de mama. Hemos cultivado y propagado
in vitro
tres líneas diferentes de células tumorales de mama (KPL-1, MCF-7 y la BT-474, respectivamente, llamado línea A, B, y C) mediante la aplicación de las condiciones de cultivo similares utilizados para la NSA. Se utilizó medio libre de suero que contiene factor de crecimiento epidérmico humano (EGFhr) y factor de crecimiento de fibroblastos básico (rhbFGF) permitir que las células de tumor de mama para crecer y forman mammospheres no adherentes esféricas [11], [19], medida la expansión pliegue del cáncer de mama líneas de más de seis a ocho pasajes y calculan sus respectivas K
ll gratis (Fig. 4a-b). Nuestro modelo matemático del ensayo mammosphere predice una tasa de división celular de cáncer de LTP simétrica de 0,125 ± 0,011 para la línea A, 0,078 ± 0,005 para la línea B y 0,026 ± 0,003 para la línea C. 10
6 células de cada línea celular de tumor de mama se transplantaron bajo la piel de ratones inmunocomprometidos y tumores formados en diferente tasa (Fig. 4c). Al igual que en los experimentos con tumores cerebrales, las líneas celulares que exhiben mayor de células cancerosas LTP tasa de división simétrica llevaron a la progresión del tumor más rápido combinado con una peor supervivencia como se demuestra en el gráfico que compara K
ll
a la supervivencia media de los animales trasplantados (Fig. 4c-d).
(a-b) tres líneas celulares de cáncer de mama se cultivaron en el ensayo mammosphere. En estas condiciones, las líneas celulares 3 muestran diferente tasa de expansión y LTP celular por división de frecuencia simétrica. ** P & lt; 1 × 10
-5, t-test, 2 colas, n = 36-48. (C) El crecimiento tumoral se monitorizó horas extras entre los 3 grupos de los que se realizó el análisis de supervivencia y se representan como porcentaje de animales que no han alcanzar el tamaño máximo del tumor (520 mm
3) como una función del tiempo. Logrank prueba, p & lt; 0,0001 comparación de las tres poblaciones entre sí, n = 10. (d) De manera similar a hGBM, la progresión del tumor después de células de cáncer de mama s.c. El trasplante estaba directamente e inversamente correlacionada con la tasa de división simétrica de la célula de cáncer LTP. Las líneas discontinuas corresponden a la banda de confianza 95% del ajuste de la curva obtenida por regresión no lineal (y = 0,1743 - 0.001123x - 0.00002258x
2). Coeficiente R
2 y el valor p se muestra también.
En total, estos resultados sugieren que la célula cancerosa tasa de división simétrica de auto-renovación LTP mide
in vitro usando
Esfera ensayos pueden ser usado para predecir la progresión del tumor basado en la idea de que el aumento de las divisiones simétricas auto-renovación de las células de cáncer de LTP producirá más tumor iniciar células resultantes en un tumor más agresivo. Estos datos también validan la aplicación potencial de nuestro modelo en el cáncer y apoyan la importancia del compartimiento maligno de células LTP en la conducción de la expansión del tumor y que influye en el resultado de la enfermedad.
El modelo también se puede usar para identificar agentes que se dirigen específicamente a la población de células cancerosas LTP frente a aquellos que se dirigen a la población de células cancerosas STP. Anteriormente se había demostrado que la exposición de hGBM cultivan para BMP4 reduce el K
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lo que sugiere que se dirige a la población de células cancerosas LTP (es decir, las células madre del cáncer), lo cual fue confirmado por una reducción significativa en el