Extracto
niveles de miARN se alteran en el adenocarcinoma ductal pancreático (PDA), la neoplasia de páncreas más común y letal, y el procesamiento de miRNA intacta es esencial para especificación de linaje durante el desarrollo de páncreas. Sin embargo, el papel de procesamiento de miRNA en PDA no ha sido explorado. Aquí se estudia el papel de los genes miARN la biogénesis en el desarrollo PDA mediante la supresión de los genes miARN procesamiento de la enzima Dicer en un modelo de ratón PDA impulsado por oncogénico Kras. Encontramos que la pérdida de Dicer acelera Kras impulsado desdiferenciación acinar y acinar a ductal metaplasia (ADM), un proceso que se ha demostrado que preceden y promover la especificación de precursores de PDA. Sin embargo, no constreñida ADM también muestra altos niveles de apoptosis. pérdida de Dicer no acelera el desarrollo de precursores PDA Kras impulsadas o PDA, pero, sorprendentemente, se observa que el ratón PDA puede desarrollarse sin dicer, aunque a expensas de la capacidad proliferativa. Nuestros datos sugieren que el procesamiento de miRNA intactos está involucrado en ambos limitan los cambios pro-tumorigénicos en la diferenciación de páncreas, así como el mantenimiento de la viabilidad durante la iniciación de PDA
Visto:. Morris JP IV, R Greer, Russ HA, von Figura G, Kim GE, Busch A, et al. (2014) Dicer regula la diferenciación y viabilidad durante el ratón El cáncer pancreático Iniciación. PLoS ONE 9 (5): e95486. doi: 10.1371 /journal.pone.0095486
Editor: Murray Korc, Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Enero, 2014; Aceptado: March 26, 2014; Publicado: May 1, 2014
Derechos de Autor © 2014 Morris et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo en Grupo de Matthias Hebrok fue apoyado por una beca de la Red de Acción contra el cáncer pancreático AACR. www.pancan.org. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) parece desarrollarse a través de una serie de lesiones precursoras ductales, incluyendo el tipo más común, la neoplasia intraepitelial pancreáticas (PanIN). Ambos PanINs y presentan mutaciones de KRAS PDA, que puede ser un suceso iniciador. Los modelos de ratón apoyan esta noción como expresión dirigida y persistente de KRAS mutado en el epitelio de páncreas del ratón tanto recapitula la secuencia PanIN para PDA observado en los seres humanos, y es necesario para el mantenimiento de la enfermedad [1], [2], [3]. La evidencia de modelos de ratón sugiere que mutante Kras puede contribuir a la iniciación PDA mediante la reprogramación de las células acinares en un conducto como linaje capaz de convertirse en PanINs a través de un proceso denominado acinar a metaplasia ductal (ADM) [4], [5], [6]. Esta capacidad de cambiar la plasticidad pancreática puede ser un paso importante en la iniciación PDA, como han demostrado las células acinares ser dramáticamente más sensibles al desarrollo PanIN dependiente de Kras en comparación con las células del conducto [7]. Dado que los intentos de la inhibición directa de Kras oncogénicos no han tenido éxito [8], que define mediadores críticos de la diferenciación pro-tumorigénicos y viabilidad aguas abajo del mutante Kras puede representar enfoques terapéuticos alternativos.
Los microARN (miRNA) son una clase de pequeños RNAs no codificantes, que regulan la expresión de genes post-transcripcional. niveles aberrante miARN se asocian con el desarrollo de tumores, y conducen a la expresión inapropiada de oncogenes y supresores de tumor [9]. los niveles de miRNA asociados con el cáncer son el resultado de la expresión defectuosa de miRNAs específicos, así como la desregulación de la vía de la biogénesis miARN [10]. miRNAs son generalmente regulados a la baja en los cánceres humanos [11], y el procesamiento de miRNA inhibido promueve la tumorigénesis [12]. Sin embargo, la pérdida de procesamiento miARN puede ser incompatible con el desarrollo de algunos tumores [13], [14], [15], lo que sugiere que los umbrales críticos de procesamiento de miRNA pueden estar implicados en el mantenimiento de la viabilidad durante la transformación. Mientras que los miRNAs se misexpressed en PanINs y PDA, y se sabe que regulan las vías que contribuyen a la iniciación de PDA y la progresión [16], [17], [18], [19], el papel que el procesamiento de miRNA desempeña en el desarrollo de PDA no ha sido investigado.
al eliminar la enzima Dicer miARN-procesamiento en un modelo de ratón impulsada Kras de PDA, nos encontramos con que el procesamiento de miRNA regula tanto la diferenciación y viabilidad durante la transformación de páncreas Kras impulsada. eliminación dicer promueve Kras la pérdida de la identidad impulsada acinar y ADM, pero también se traduce en mayores niveles de apoptosis y la disminución de la expresión de genes implicados en el mantenimiento de la viabilidad durante el desarrollo y en PanIN PDA. Sorprendentemente, encontramos que el ratón PDA puede desarrollar en ausencia de Dicer, aunque con disminución de la proliferación. En su conjunto, este trabajo sugiere un papel crítico para el procesamiento de miRNA en la iniciación PDA Kras impulsada.
Resultados
Pérdida de Dicer Acelera Driven Kras eliminación ductal metaplasia
Dicer en progenitores pancreáticos primeros los resultados en la agenesia de páncreas y de la muerte postnatal [20]. Por lo tanto, hemos probado si un Pdx1 distinta cepa impulsada Cre,
Pdx1-Cre
Late
, permitió el desarrollo de páncreas en el entorno de la pérdida de la función Dicer.
Pdx1-Cre
tardías
resultados en la actividad de desarrollo retardado en comparación con el conductor Pdx1-Cre empleado por Lynn
et al
, dando como resultado la recombinación en un conjunto más restringido de células adultas, específicamente la mayoría de los acinos, algunas células endocrinas, y rara vez en las células del conducto [21]. Sugiriendo requisitos temporales para Dicer en el desarrollo de páncreas,
Pdx1-Cre
Tardío; Dicer
flox /flox gratis (
dicer
Homo
) ratones prosperó y se muestra el desarrollo de páncreas sumamente normal en P0, incluso en el contexto de una disminución significativamente la expresión de Dicer en comparación con el control
Pdx1- Cre
Tardío; Dicer
Flox /+ ratones
(
dicer
Het
) (Figura S1 A, B, E).
A las 3 semanas de edad, acinos, conductos, y los islotes eran reconocibles en
Dicer
Homo
ratones (Figura 1A), aunque hubo algunas áreas exocrinas con disminución de la tinción eosina. La inmunofluorescencia reveló la distribución normal de la amilasa marcador acinar, conducto marcador CK19, y la insulina marcador de células β (Figura 1B). morfología exocrina fue perturbada, aunque, como a menudo nos encontramos con acinos desorganizado células pequeñas y fragmentadas no detectados en los controles (Figura 1B, la figura S2), de forma similar a las células acinares desorganizadas observadas en hypomorphs Dicer somáticas [22]. masa pancreática en
Dicer
Homo
ratones también se redujo (Figura 1D) en el contexto de disminución de la expresión de Dicer (Figura 1C). A pesar de los cambios en la morfología, no se observan células que expresan co-amilasa y elevados niveles de CK19 como se observa en las células acinares de someterse a Kras ADM conducido (Figura S3), lo que sugiere que las células acinares desorganizados no fueron sometidos activamente ADM.
(A). Hematoxilina y eosina (H & amp; E) tinción, de 3 semanas de edad páncreas de
Dicer Het
y
Dicer
Homo
ratones. (A) acinos, (D) del conducto, y los islotes (I). La barra de escala 100 mM. (B) La inmunofluorescencia para la amilasa (rojo), CK19 (verde), e insulina (azul) en 3 semanas de edad
Dicer
Het
y
Dicer
Homo
ratones. La barra de escala 100 mM. (DO). Reducción de la expresión Dicer a las 3 semanas en ARN extraído de tejido pancreático de genotipos indicados. Media ± SD, n = 3. (D). masa páncreas: relación de peso corporal a las 3 semanas en los genotipos indicados. P-valores se calculan a partir de dos colas, prueba t no pareada comparando
Dicer Het
e indicados genotipos. (Media ± SD,
Dicer
Het
n = 17,
Dicer
Homo
n = 14,
Kras; Dicer
Het n = 9, Kras ; Dicer
Homo n
= 14). (MI). H & amp; E tinción, de 3 semanas de edad
Kras; Dicer
Het
y
Kras; Dicer
Homo
ratones. Inserciones: E-izquierda, foco rara de metaplasia y PanIN; derecho, metaplasia ductal in
Kras; Dicer
Homo
ratones. La barra de escala 100 mM. (F) La inmunohistoquímica para la amilasa, Sox9, CK19 en 3 semanas de edad
Kras; Dicer
Het
y
Kras; Dicer
Homo
ratones. La barra de escala 100 M
Para probar el efecto de la pérdida de Dicer en Kras transformación de páncreas impulsado, generamos
Pdx1-Cre
Tardío.; LSL-Kras
G12D; Dicer
flox /flox gratis (
Kras; dicer
Homo
) ratones. Al igual que otros modelos de segmentación mutante Kras en el páncreas embrionario,
Pdx1-Cre
Tardío; LSL-Kras
G12D
ratones desarrollan gradualmente ADM, así como PanINs, con PDA que surge en algunos animales después de una larga latencia [23]. Al igual que en tales modelos [1], a las 3 semanas de edad, la masa páncreas en el
Pdx1-Cre
Tardío; LSL-Kras
G12D; Dicer
Flox /+ gratis (
Kras; dicer
Het
) los ratones fue ligeramente, pero significativamente, aumentó en comparación con
dicer
Het
ratones (Figura 1D ). El compartimiento exocrina en
Kras; Dicer
Het
ratones parecían sumamente normal, predominantemente compuesto de células acinares positivos amilasa, con zonas poco frecuentes de ADM negativo amilasa y PanINs de bajo grado que expresan niveles moderados a altos de CK19 y Sox9 (Figura 1F), ductal /páncreas embrionario marcadores progenitoras característicos de ADM Kras impulsado y la formación de PanIN [6]. Por el contrario,
Kras; Dicer
Homo
páncreas se muestra disminución de la expresión de Dicer (Figura 1C), fueron atrófica (Figura 1D), y poseía la sustitución generalizada del compartimiento exocrina con estructuras de los conductos de metaplasia se asemeja a ADM raro en
Kras; Dicer
Het
ratones (Figura 1E). metaplasia ductal in
Kras; Dicer
Homo
ratones muestran disminución de la expresión de la amilasa, la baja expresión de CK19 a moderada y fuerte expresión de Sox9 (Figura 1F). acumulación sox9 también se observó en estructuras de retención alguna acinares morfología (Figura 1F). metaplasia ductal no se observó en P0 en
Kras; Dicer
Homo
ratones (Figura S1D), lo que sugiere que la deficiencia de Dicer en el contexto de Kras mutante no bloquea el desarrollo embrionario acinar, y ADM ocurre entre el nacimiento y 3 semanas de edad. Por lo tanto, la pérdida de Dicer en el contexto de mutante Kras acelera drásticamente ADM, un proceso que se ha demostrado que tanto preceder y promover la formación de PanIN Kras impulsado [4], [6], [24].
Dicer Pérdida compromisos acinar identidad y promueve Kras Driven acinar ductal de reprogramación
para explorar por qué
Kras; Dicer
Homo
ratones se someten a acelerarse Kras ADM impulsado, nos preguntamos si las células acinares deficientes Dicer inapropiada exhiben propiedades asociadas con ADM, tales como marcadores de estrés acinares y pérdida de identidad acinar. Para centrarse en las células que se habían sometido a recombinación Cre incluimos un alelo inducible Cre YFP expresa condicionalmente del locus Rosa26 (
R26-EYFP). YFP tinción reveló que tanto el compartimento exocrina en
Pdx1-Cre
Tardío; Dicer
flox /flox; R26-EYFP gratis (
Dicer
Homo; YFP)
ratones y ADM en
Pdx1-Cre
Tardío; LSL-Kras
G12D; Dicer
flox /flox; R26-EYFP gratis (
Kras; Dicer
Homo; YFP
) ratones derivado de las células en las cuales Cre estaba activo, y no a partir de la expansión de una población-un recombinada (Figura 2B, D).
(a-D) clusterina (azul) y YFP tinción (verde) en 3 semanas de edad
Dicer
Het; YFP gratis (A),
Dicer
Homo; YFP gratis (B),
Kras; Dicer
Het; YFP gratis (C), y
Kras; Dicer
Homo; YFP
ratones (D). La barra de escala 100 M (e) Análisis de RT-PCR de Dicer, miRNA-141 y 216b (izquierda), acinares enriquecido genes para amilasa y Mist1 (centro), y los genes de conductos enriquecida CK19 y Sox9 (derecha) de YFP +, CD49f +, CD133- las células de los
Dicer
Het; YFP gratis (n = 4),
Dicer
Homo; YFP gratis (n = 4),
Kras; Dicer
Het; YFP gratis (n = 3), y
Kras; Dicer
Homo; YFP
(n = 3) ratones. La media ± desviación estándar. P-valores se calculan a partir de dos de cola, prueba t no pareada comparan
Dicer
Het
y
Dicer
Hom °
CK19 y Sox9 valores de expresión.
para determinar si la pérdida de Dicer llevó a acinares estrés asociado con ADM, se analizó la expresión de clusterina, un marcador de estrés, de-diferenciada acinos [6], [25]. Clusterina era principalmente ausente en YFP + células acinares de control de
Dicer
Het; YFP
y
Kras; Dicer
Het; YFP
ratones, pero estuvo presente en raras YFP + ADM en
Kras; Dicer
Het; YFP
animales (Figura 2A, C). no sólo lo que sugiere que las células deficientes Dicer están bajo estrés observada en ADM, clusterina se observó de manera uniforme en YFP + ADM en
Kras; Dicer
Homo; YFP
ratones, pero también expresan ampliamente en YFP + células acinares en
Dicer
Homo; YFP
animales (Figura 2 B, C).
Para probar si el estrés acinar correspondió con una disminución de la identidad acinar, modificamos un protocolo de clasificación desarrollado previamente para el aislamiento de células progenitoras pancreáticas [26] para separar específicamente diferenciado y acinar células ductales. Se encontró que en el páncreas adulto, acinos y conductos de adultos expresan el marcador epitelial CD49f, mientras que los conductos diferenciados también expresan CD133 (figura S4B, C). RT-PCR para
La amilasa
y
Mist1
, y
CK19
y
Sox9
, enriquecida en células acinares y conductos, respectivamente, reveló que la clasificación basada en CD49f y CD133 permitido para la separación eficiente de estas poblaciones (Figura S4A, 4D). La expresión de efectores Notch Hes1, HEY1, y hey2, restringido a centroacinar y células de los conductos terminales en el páncreas adulto [27], aparecido para segregar con el + población conducto CD49f + CD133 (figura S4E).
YFP +, CD49f + células CD133- fueron ordenados desde los 4 genotipos. A las 3 semanas de edad y los niveles de expresión de Dicer 2 miRNAs expresados abundantemente se redujeron considerablemente en células clasificadas de
Dicer
Homo; YFP
y
Kras; Dicer
Homo; YFP
ratones en comparación con los controles con y sin Kras (Figura 2E izquierda). Para determinar el efecto de la pérdida de Dicer en la diferenciación exocrina, analizamos la expresión de la amilasa marcadores acinares y Mist1 y los marcadores de conducto CK19 y Sox9, en YFP +, CD49f + CD133- células. las células de los
Dicer
Homo ordenados; YFP
ratones muestran disminuyó considerablemente expresión de
La amilasa
y modestamente disminuyó
Mist1
ha comparado con las células de los
Dicer
Het; YFP
ratones (Figura 2E medio). Aunque la expresión de marcadores de diferenciación acinar se redujeron, no observamos un aumento constante de los marcadores ductales
CK19
o
Sox9
en estas células (Figura 2E derecha), similar a la falta de generalizada misexpression CK19 observó en la Figura 1D. En las células CD49f + CD133- de
Kras; Dicer
Homo; YFP
ratones sin embargo,
La amilasa
y
Mist1
expresión se disminuyó aún más, y
CK19
y
Sox9
expresión se incrementó, en comparación con las células . de todos los otros genotipos, en consonancia con el aumento histológica en ADM
Curiosamente, también se observó un modesto, pero no estadísticamente significativa, tendencia a la reducción en la expresión en células clasificadas Mist1 de
Kras; Dicer
Het; YFP
ratones en comparación con
Dicer
Het; YFP
controles, sugiriendo que Kras mutantes solo pueden comenzar comprometer identidad acinar antes de la inducción de genes ductales o morfología. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la pérdida de Dicer compromete la identidad acinar e induce un estado de estrés que acelera Kras impulsado reprogramación ductal y ADM
Dicer pérdida no acelera PanIN o PDA Desarrollo
La pérdida de acinar. identidad y ADM acelera el desarrollo PanIN [6], [24], [28], [29] y ADM acelerado y el desarrollo PanIN, inducida por pancreatitis aguda y crónica, por ejemplo, pueden dar lugar a la disminución de la latencia PDA [30], [31] , [32]. Por lo tanto, esperábamos a observar el desarrollo más rápido y PanIN PDA en
Kras; Dicer
Homo
ratones en comparación con el control
Kras; Dicer
ratones Het
. A pesar de la dramática diferencia en ADM observado a las 3 semanas en
Kras; Dicer
Homo
en comparación con
Kras; Dicer
Het
ratones, la cuantificación de las lesiones PanIN en una pequeña cohorte de ratones a las 9 semanas no reveló ninguna diferencia estadísticamente significativa en la frecuencia de lesiones ductales Alcian azul positivos, lo que sugiere que la pérdida de Dicer no acelera el desarrollo PanIN (Figura 3A , ANTES DE CRISTO). progresión de la enfermedad a largo plazo también convergente independiente del estado de Dicer condicional. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la supervivencia de una pequeña cohorte de edad
Kras; Dicer
Homo
y
Kras; Dicer
Het
ratones (mediana de supervivencia en comparación con 336 441,5 días, χ
2 = 0,2271, p = 0,6637, calculada mediante la prueba Logrank) (Figura 3F). 6/7 de
Kras; Dicer
Het
ratones desarrollaron ampliamente a nivel local o PDA invasivo que se diferencian por lo general moderadamente, pero incluyen un cáncer indiferenciado. 4 de 6
Kras; Dicer
Homo
ratones desarrollaron moderadamente diferenciado, de forma local o ampliamente invasiva, PDA con una frecuencia similar de metástasis y la morfología celular (Figura 3D, E, Tabla S1).
(A-B) Representante Alcian tinción de azul a las 9 semanas en
Kras; Dicer
Het gratis (A) y
Kras; Dicer
Homo
ratones (B). f: grasa. La barra de escala 100 mM. C, La cuantificación de las lesiones positivas con azul Alcian de 9 semanas de edad
Kras; Dicer
Het
y
Kras; Dicer
Homo
ratones. Las líneas indican los medios. P-valor calculado a partir de una prueba t no pareada de dos colas. (D, E) la histología Representante de PDA de
Kras; Dicer
Het gratis (D) y
Kras; Dicer
Homo
ratones (E). La barra de escala 100 mM. curva (F) La supervivencia de
Kras; Dicer
Het gratis (n = 7) y
Kras; Dicer
Homo gratis (n = 6) ratones.
Dicer suprimido las células han demostrado ser desplazado por células unrecombined en otros órganos del endodermo derivado, en el hígado, por ejemplo, [33] , y la eliminación de las células recombinadas podría contribuir a la falta de diferencia esperada en la progresión de la enfermedad en
Kras; Dicer
Homo
frente a
Kras; Dicer
ratones Het
. En contraste con el punto de tiempo de 3 semana cuando las células acinares normales eran mucho menos frecuentes en
Kras; Dicer
Homo
frente a
Kras; Dicer
Het
ratones, se encontraron áreas considerables de tejido acinar normal en el Kras; Dicer
H
o
m
o
ratones en este punto del tiempo (Figura 3A, B). También notamos la presencia de grasa reemplazar tejido pancreático en algunos
Kras; Dicer
Homo
animales (Figura 3B). El análisis del tejido distribución YFP en el páncreas de
Kras; Dicer
Het; YFP
frente a
Kras; Dicer
Homo; YFP
animales revelaron una disminución notable en la distribución YFP a las 9 semanas (Figura S5), lo que sugiere la repoblación con células que no se habían sometido a recombinación. Por lo tanto, a pesar de la promoción inicialmente ADM que normalmente acelera el desarrollo PanIN y PDA, la progresión de PDA no es mejorada sustancialmente en ausencia de Dicer y puede estar asociada con la selección contra la deficiencia de Dicer.
Dicer Pérdida compromisos viabilidad durante Kras Driven ADM
pérdida de Dicer conduce a un aumento de la apoptosis en varios órganos del endodermo (por ejemplo, el hígado y el intestino [33], [34] para hacer frente a si la falta de aceleración prevista de desarrollo PanIN en
Kras; Dicer
Homo
ratones podrían implicar aumento de la muerte celular, se auditado TUNEL + /+ YFP células a las 3 semanas de edad, en contraste con las células doble positivas raras en
Dicer
Het; YFP.
y
Kras; Dicer
Het; YFP
ratones,
Dicer
Homo;. YFP
ratones muestran una velocidad relativa más alta de TUNEL + /+ células YFP (Figura 4B, E) Por otra parte, hemos observado una aumento adicional en las células doble positivas en
Kras; Dicer
Homo; YFP
ratones en comparación con
Dicer
Het; YFP
y
Kras; Dicer
Het; YFP
ratones (Figura 4D, E). Curiosamente, la pérdida de Dicer parecía sinergia con KRAS mutado para promover la muerte celular, como
Kras; Dicer
Homo; YFP
ratones mostraron significativamente más apoptosis que
Dicer
Homo; YFP
células (Figura 4E). Por lo tanto, mientras que el procesamiento de Dicer intacta constriñe Kras impulsado acinar ductal de reprogramación, se pueden requerir algunas señales dependientes Dicer para mantener la viabilidad durante metaplasia Kras impulsada.
(A-D) TUNEL (azul) y YFP (verde) tinción en 3 semanas de edad
Dicer
Het; YFP gratis (A),
Dicer
Homo; YFP gratis (B),
Kras; Dicer
Het; YFP gratis (C), y
Kras; Dicer
Homo; YFP
ratones (D). La barra de escala 100 mM. E. Cuantificación de células TUNEL + YFP + en (A-D). La media ± desviación estándar.
Dicer
Het; YFP gratis (n = 3),
Dicer
Homo; YFP gratis (n = 4),
Kras; Dicer
Het; YFP gratis (n = 3), y
Kras; Dicer
Homo; YFP
ratones (n = 4). P-valor calculado a partir de una de dos colas, la prueba t no pareada de TUNEL + células YFP + en
Dicer
Homo; YFP
y
Kras; Dicer
Homo; YFP
ratones. F. acinar enriquecido y viabilidad genes de análisis de la expresión (izquierda) asociado. RT-PCR análisis de Nupr1, AGR2, ITIH4, y Reg3b en acinar de células
Dicer
Het enriquecido; YFP gratis (n = 4),
Dicer
Homo; YFP gratis (n = 4),
Kras; Dicer
Het; YFP gratis (n = 3), y
Kras; Dicer
Homo; YFP gratis (n = 3) ratones (derecha). La media ± desviación estándar. P-valor calculado a partir de una prueba t no pareada de dos colas comparar la expresión en células clasificadas AGR2 de
Dicer
Het; YFP
y
Kras; Dicer
Het; YFP
ratones.
Se realizó el análisis de expresión para la detección de factores dependientes de Dicer potencialmente implicados en el mantenimiento de la viabilidad durante Kras ADM impulsada. Para sincronizar mejor ADM en
Kras; Dicer
Het
y
Kras; Dicer
Homo
ratones, se utilizan pancreatitis inducida ceruleına. Como se predijo a partir de estudios anteriores [6], caerulein tratamiento en el control, 3 semanas de edad
Kras; Dicer
Het
ratones condujo al desarrollo de conducto como estructuras de 2 días después del tratamiento (Figura S6A), y la sustitución generalizada del compartimiento exocrina con ADM, PanINs, y fibrosis, 21 días después del tratamiento (Figura S6C). Reflejando la falta de desarrollo acelerado PanIN entre 3 y 9 semanas en
Kras; Dicer
Homo
ratones (Figura 3F), se observó menos metaplasia y tejido acinar considerablemente más normal de 21 días después del tratamiento ceruleına en
Kras; Dicer
Homo
ratones (Figura S6D). RNA-Seq Análisis de ARN agrupados de FACS aislado YFP +, CD49f +, células acinares CD133- de 3 semanas de edad
Kras; Dicer
Het; YFP gratis (3 ratones) y
Kras; Dicer
Homo; YFP gratis (5 ratones) los ratones 2 días después de ceruleına (Figura S6E) reveló ~120 genes regulados negativamente de manera significativa entre el mutante y control. El apoyo a la observación de que la pérdida de Dicer compromete la diferenciación acinar, 42 genes asociados con las células acinares terminales diferenciadas fueron significativamente downregulated (Figura 4F, el cuadro S2, conjunto completo de datos Tabla S3). También redujeron fueron los genes implicados en el mantenimiento de la viabilidad durante la regeneración o la tumorigénesis, incluyendo Nupr1 /P8, AGR2, ITIH4, y miembros de la familia de proteínas Reg3 (Figura 4F, el cuadro S2). Recientemente, tanto Nupr1 y AGR2 han demostrado que se sobreexpresa durante la progresión PanIN-PDA y jugar un papel en el desarrollo y el mantenimiento de PanIN PDA viabilidad [35], [36], [37]. expresión de la proteína de la familia Reg3 se activa en respuesta a la pancreatitis [38], y miembro de la familia Reg3b (también conocido como Pap1) específicamente está implicado en el mantenimiento de la viabilidad acinar y puede actuar aguas abajo de Nupr1 [39], [40]. Aunque ITIH4 no se ha implicado en el desarrollo PDA, se ha demostrado estar involucrados en el mantenimiento de la viabilidad de aguas abajo de la PDA mediador c-myc crítico [41] en un modelo de cáncer de hígado [42]. RT-PCR análisis de estos genes candidatos en acinos ordenados de 3 ratones semanas de edad, reveló que su expresión inversamente correlacionada con la apoptosis (Figura 4F, derecha). Nupr1, AGR2, ITIH4, y la expresión Reg3b se redujo en células clasificadas de
Kras; Dicer
Homo; YFP ratones
comparación con el control
Dicer
Het; YFP
y
Kras; Dicer
Het; YFP
animales. Además, AGR2, la expresión ITIH4, y Reg3b se redujo en células clasificadas de
Dicer
Homo; YFP
ratones en comparación con los controles. Curiosamente, AGR2 también se incrementó significativamente en células clasificadas de
Kras; Dicer
Het; YFP
ratones en comparación con las células de los
Dicer
Het; YFP
ratones, lo que sugiere que Kras puede contribuir a AGR2 upregulation incluso antes de que ocurra ADM. Por lo tanto, se requiere la expresión de Dicer para el mantenimiento del estado de diferenciación acinar madura y para la expresión de genes pro-viabilidad durante Kras ADM impulsada.
Ratón PDA puede desarrollarse en ausencia de Dicer
Dicer niveles se han demostrado ser importantes reguladores de la tumorigénesis, actuando como un supresor tumoral haploinsufficient en el contexto de Kras mutantes en ambos tumores de pulmón y sarcomas, así como en retinoblastoma [13], [14]. Sin embargo, los tumores en estos modelos parecen ser el resultado de las células que han conservado la expresión de al menos un alelo condicional unrecombined. Para determinar si las células deficientes Dicer eran capaces de contribuir a Kras PDA impulsado probamos la expresión de Dicer y de recombinación genómica a partir de 3 líneas celulares PDA generados a partir de
Kras; Dicer
Het
y
Kras; Dicer
Homo
ratones. Por RT-PCR se observó expresión de Dicer similar en las tres líneas celulares derivadas de PDA
Kras; Dicer
Het
ratones (Figura 5A). Debido a la alta tasa de apoptosis observada a las 3 semanas de edad, la reducción de la expresión de genes que apoyan el desarrollo PanIN, y la falta de progresión de la enfermedad acelerada, se espera observar de retención de al menos un alelo en líneas PDA derivados de
Kras; Dicer
Homo
PDA. Sorprendentemente, se encontró que una línea está representada disminuyó drásticamente la expresión de Dicer, mientras que las dos líneas restantes expresan ya sea un nivel similar, o superior, como
Kras; Dicer
Het
líneas derivadas. PCR específica de alelo reveló que Dicer recombinación directamente correlacionada con la expresión (Figura 5B: "Undel", no condicional Dicer alelo recombinación; "Hemi", la recombinación de un alelo; "Homo", la recombinación de ambos alelos). RT-PCR para 3 miRNAs maduros informó que se sobre-expresa en PDA humana [43], [44] reveló reducción en los 3 miRNAs en la línea eliminada homocigotos a menos del 95% de la expresada en la línea de no borrado (Figura 5C) . Por lo tanto, Kras PDA impulsado en el ratón parece ser capaz de evadir la selección negativa durante el inicio de la enfermedad y desarrollar en ausencia de Dicer. Como se predijo a partir de modelos que demuestran que la regulación a la baja, pero no una pérdida completa de procesamiento de miRNA, puede mejorar la tumorigénesis [12], [13], el hemizygous suprime la línea creció más rápido, mientras que los homocigotos suprime la línea más lenta (Figura 5D). Todas las 3 líneas celulares también fueron capaces de formar tumores cuando se implantan por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes, con una cinética que reflejan las tasas de crecimiento de cultivo de células (Figura 5E). Alelo PCR específica reveló que los tumores no eran el resultado de las células que se sometieron a la recombinación espontánea (UNDEL, Hemi), o de una subpoblación contaminante de células competentes Dicer (homo), aunque sí que observar la presencia del amplicón WT Dicer en los tumores derivados de la Hemi líneas y Homo, indicativo de la contratación del estroma huésped (Figura 5F). Por lo tanto, a pesar de la eliminación Dicer deteriora la viabilidad durante las primeras etapas de la neoplasia Kras impulsado, pérdida de Dicer no es mutuamente excluyente con la transformación de páncreas.
A. Dicer RT-PCR en líneas celulares PDA genera a partir de
Kras; Dicer
Het gratis (azul) y
Kras; Dicer
Homo
ratones (rojo). Cada barra representa los datos de 3 pozos independientes de cada línea celular. La media ± desviación estándar. B. PCR para detectar WT, unrecombined (UNREC), y sean eliminados locus genómico (DEL) Dicer en líneas celulares de A. Los controles son amplificados de ADN a partir de fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) de genotipo Dicer se indica después del tratamiento con adenovirus Cre. C. miARN QPCR para miARN-16, 107, 191 en líneas celulares derivadas de
Kras; Dicer
Homo
ratones. Cada barra representa 3 pozos independientes de cada línea celular. La media ± desviación estándar. D. Crecimiento de líneas celulares derivadas de PDA
Kras; Dicer
Homo
ratones. Cada punto representa los valores de 3 pozos independientes. La media ± desviación estándar. P-valor calculado a partir de una prueba t no pareada de dos colas comparando el número de células a las 72 horas en cultivos de células y Undel Homo. el crecimiento del tumor E. subcutánea de líneas celulares derivadas de PDA
Kras; Dicer
Homo
ratones. Media ± desviación estándar en cada punto de tiempo. Undel (n = 7), Hemi (n = 7), Homo (n = 12). F. PCR para detectar WT, UNREC, y DEL Dicer locus genómico de tumores subcutáneos en el momento del sacrificio en E. controles son Dicer
fl
o
x /+ MEFs tratadas con adenovirus Cre como en B. Tumor los ADN son precedidos por la amplificación de ADN de líneas celulares de sus padres.
Discusión
función de Dicer es esencial para el desarrollo de varios órganos, incluyendo tejidos derivados del endodermo, tales como el hígado y el gut [33], [34]. Se requiere el mantenimiento de la expresión de Dicer en los primeros progenitores pancreáticos Pdx1 positivos para el desarrollo tanto de la exocrinas del páncreas endocrino y compartimentos [20]. Aquí, nos encontramos con que la función Dicer sigue siendo importante en todo el desarrollo de páncreas y desempeña un papel en la regulación de identidad acinar y viabilidad. Nuestro modelo utiliza una línea piloto que inicia la recombinación Dicer en el páncreas en desarrollo en una etapa embrionaria más tarde que el conductor Cre utilizado por Lynn et al [21]. Observamos efectos brutos mínimos sobre el desarrollo de páncreas, lo que sugiere requisitos de la etapa sensible para el procesamiento de miRNA en el establecimiento y la expansión de células progenitoras exocrina y endocrina. Sin embargo, las células acinares que se desarrollan son inestables tanto en lo que respecta a su diferenciación terminal y la viabilidad. Elementos de la identidad acinares están regulados a la baja, y el estrés celular y la apoptosis se incrementaron tanto. Por lo tanto, el procesamiento de miRNA competente parece seguir siendo importante, incluso en el compartimiento exocrina madura.
Debido a Dicer deleción en este modelo permite el desarrollo de páncreas hemos sido capaces de explorar el papel de la función Dicer en Kras desarrollo PDA mediada. Los modelos de ratón han revelado que Kras oncogénicos pueden actuar como un "maestro regulador" del desarrollo PDA, el establecimiento de linajes que pueden dar lugar a PanINs y PDA y seguir siendo críticos para la progresión [1], [2], [3]. evidencia considerable sugiere que las células acinares pueden dar lugar a PanINs por sometidos a ADM, un proceso durante el cual las células acinares perder la diferenciación terminal a expensas de un conducto de-diferenciada, como el estado [4], [5], [6], [7 ]. Kras ADM impulsado se produce gradualmente, pero puede ser acelerado por comprometer la diferenciación acinar. Insultos tales como pancreatitis, lo que provoca la regeneración desdiferenciación asociado [6], [45], la activación de las vías de progenitoras asociado (por ejemplo, Notch [24]), y la inactivación de genes que mantienen el estado acinar [28], [29], [46] todos acelerar drásticamente Kras ADM impulsado y el desarrollo PanIN. Por lo tanto, la pérdida de identidad acinar puede ser una barrera clave para la especificación dependiente Kras de acinares derivado precursores de PDA. Nuestros datos sugieren que la pérdida de la función Dicer elimina la barrera de diferenciación para ADM Kras conducido. ADM se produce a las 3 semanas en
Kras;