Extracto
Dickkopf-1 (DKK1) es un inhibidor de la vía de señalización /β-catenina Wnt. Sin embargo, el papel de DKK1 en la progresión de cáncer de pulmón de células no (NSCLC) no se entiende completamente. En este estudio, RT-PCR y Western blot se utilizaron para examinar la expresión de DKK1 en un panel de diez líneas celulares de NSCLC humanos y tejidos de NSCLC. expresión DKK1 estaba altamente transactivated en la gran mayoría de estas líneas de cáncer. La expresión de DKK1 se reguló tanto en los niveles de proteína en los tejidos de NSCLC en comparación con los tejidos pulmonares normales adyacentes ARNm y. La inmunohistoquímica y de inmunofluorescencia revelaron que DKK1 se distribuye principalmente en el citoplasma, tanto en tejidos de carcinoma y líneas celulares. expresión de la proteína DKK1 también se evaluó en secciones de parafina de 102 pacientes con NSCLC mediante técnicas de inmunohistoquímica, y 65 (63,73%), los tumores fueron DKK1 positivo. El análisis relativo mostró una relación positiva significativa entre DKK1 expresión y la metástasis de ganglios linfáticos (
P Hotel & lt; 0,05). Los pacientes con tumores positivos tenían DKK1-DFS más pobres que aquellos con CECA negativo (SSE a 5 años; 15,4% frente al 27%; p = 0,007). Para explorar más a fondo los efectos biológicos de DKK1 en las células NSCLC, que sobre-expresan DKK1 en la celda 95C NSCLC usando el vector de expresión eucariota pCMV-Tab-2b y realizamos una caída de DKK1 en LTEP a-2 células utilizando un vector de expresión de ARN de horquilla corta pSilencer 5.1. DKK1 no tuvo ningún efecto sobre la proliferación, pero parecía jugar un papel en la migración y la invasión capacidad. La sobreexpresión de DKK1 promueve la actividad migratoria e invasiva de 95ºC, mientras que DKK1 caída dio lugar a la supresión de la migración y la invasión de los potenciales LTEP-a-2 células. Tomados en conjunto, estos resultados indican que DKK1 puede ser un regulador crucial en la progresión del NSCLC. DKK1 podría ser una posible diana terapéutica en el CPNM
Visto:. Li S, Qin X, X Guo, Cui A, Y Él, Wei S, et al. (2013) Dickkopf-1 es oncogénico y participa en el crecimiento invasiva en el cáncer de pulmón de células pequeñas. PLoS ONE 8 (12): e84944. doi: 10.1371 /journal.pone.0084944
Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 26, 2013; Aceptado: 19 Noviembre 2013; Publicado: 31 de diciembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) es una de las enfermedades más comunes y la incidencia va en aumento [1-4]. A pesar de los avances en la detección y las mejoras en el tratamiento precoz, la supervivencia a largo plazo de NSCLC sigue siendo insatisfactoria. recidiva tumoral y la metástasis son los principales factores de influencia de pronóstico. Los biomarcadores que puedan predecir el riesgo de recurrencia y la metástasis son extremadamente urgente. Por lo tanto, es necesario identificar nuevas dianas que participan en la progresión del tumor y las estrategias de tratamiento de diseño apropiado para pacientes con NSCLC.
Dickkopf-1 (DKK1) es una proteína secretada que participan en Wnt vía de señalización que actúa como un inhibidor. En el Wnt /β-catenina convencional, Wnt-1 de proteína se une al receptor Frizzled (Fz) y la lipoproteína de baja densidad de receptores relacionados con señales /6 (LRP5 /6), lo que provocó para la proliferación a través de β-catenina [5 proteínas ,,,0],5,6]. DKK1 se une a LRP5 /6 y bloquea la interacción con Wnt-1, lo que resulta en la degradación de β-catenina y el retraso de la proliferación [7-10]. La expresión y los papeles de DKK1 es diferente en varios tipos de cáncer, los estudios actuales han informado de que la sobreexpresión de DKK1 se encuentra en muchos tumores malignos, incluyendo el cáncer de mama, cáncer de pulmón, carcinomas esofágicos y el carcinoma hepatocelular (HCC) [11-15], lo que indica un potencial la función oncogénica de DKK1 [16]. A pesar de estos estudios, hay poco se ha informado sobre el significado de la expresión DKK1 en la progresión del NSCLC y el pronóstico.
En este estudio, se analizó por primera vez la expresión de un panel de líneas celulares de cáncer humano y 102 muestras resecadas de CPNM, y exploró la correlación entre la expresión DKK1 y factores clinicapathological. Posteriormente se detectaron los efectos biológicos de DKK1 sobre la migración y la invasión en células de carcinoma de páncreas cultivadas.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio fue aprobado por los comités éticos de el Segundo hospital de la Universidad médica de Hebei y Tianjin pecho Hospital.All los participantes proporcionaron su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio.
celulares cultivadas y transfección
el andenocarcinoma de pulmón A549 línea celular y pulmón gran línea celular NCI-H460 se adquirieron de ATCC. Las líneas celulares de pulmón andenocarcinoma SPC-A-1, LTEP-a-2, GLC82 A2 y PC-9; líneas de células escamosas de pulmón YTMLC-9 y las grandes líneas de células pulmonares 95C, 95D están dotados de Tianjin instituto de cáncer de pulmón [14]. Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de suero de medio que contiene 10% de bovino fetal (FBS, GIBCO), 100 UI /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina mantuvo a 37 ° C en aire humidificado que contiene 5% de CO
2.
Las células fueron cultivadas a 80% de confluencia y se transfectaron con el vector eucariota recombinada y vector vacío utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, EE.UU.) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Las muestras de pacientes
En este estudio, las muestras de tejido fijado en formol NSCLC 102 pacientes fueron utilizados para la tinción inmunohistoquímica que se obtiene a partir del Segundo hospital de la Universidad médica de Hebei. Diez tejidos frescos del paciente, incluyendo NSCLC primario y tejidos normales adyacentes emparejados se obtuvieron del Hospital de Tianjin en el pecho. Todos los tejidos se almacenaron en nitrógeno líquido antes de su uso. Las muestras de tejido fueron molidas en nitrógeno líquido para aislar el ARN total y proteínas.
Construcción de plásmidos
El vector de expresión pCMV-Tag-2b eucariota (Invetrogen) fue reconstruido para expresar DKK1. secuencia de 815 pares de bases de longitud DKK1 (NM: 012.242,2) incluyendo
EcoRI
y
BamH I
sitios de enzimas de restricción se amplificó a partir de ADN genómico. Las secuencias de los cebadores fueron: 5'-Forward TGGATCCATGATGGCTCTGGGCGCAGCGGGAG-3 ', inversa: 5'-CGAATTCTTAGTGTCTCTGACAAGTGTGAAGCCTAGAAG-3'. El producto amplificado de PCR se subclonó en el vector pCMV-Tag-2b. El vector recombinante se denominó pCMV-Tag-2b-DKK1. El vector de caída se construyó mediante el uso de un eucariota pSilencer vector de expresión de 5,1 (Ambion). La secuencia diana del gen DKK1 era 5'-AATAAGTACCAGACCATTGAC-3 ', y el vector resultante se designó como pSilencer-DKK1. La secuencia de control negativo fue 5'-CTACCGTTGTTATAGGTG-3 '. El plásmido de control negativo siRNA (pSilencer-NC) codifica un siRNA, que no tiene similitud de secuencia significativa con secuencias de genes humanos. Todas las secuencias de construcción fueron diseñados de acuerdo con la línea siRNA Buscador de destino de Ambion. Se llevó a cabo análisis de la secuencia para verificar los vectores resultantes.
Western Blot
Western blot se realizó para detectar la expresión de DKK1 en muestras de NSCLC resecado y líneas celulares de cáncer. Las muestras congeladas de NSCLC fueron molidas en nitrógeno líquido; líneas celulares se cultivaron a 80% de confluencia y se recogieron. Las muestras de tejido y las células se lisaron en tampón de lisis RIPA (solución salina tamponada con fosfato que contiene 1% de Triton X-100 y 1 nM PMSF) a 4 ° C durante 30 min y se centrifugaron a 12.000 rpm durante 15 min. La concentración de proteína se cuantificó usando el ensayo de proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL). Las cantidades iguales de proteína se cargaron y electroforesis en un gel de SDS-PAGE 10%, que después se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (NC). La membrana se incubó durante 60 min en PBS que contenía 0,1% de Tween-20 y 5% de leche desnatada para bloquear cualquier unión no específica; esto fue seguido por la incubación a 4 ° C con anticuerpo policlonal de conejo anti-DKK1 humana (LifeSpan, WA, EE.UU., 1: 500 diluciones). La membrana se lavó tres veces durante 10 min en PBS con 0,1% de Tween-20 y después se incubaron durante 1 h con HRP-conjugado bovino anti-conejo (1: 5.000 diluciones) anticuerpo secundario (tecnología biológica Boster, Wuhan, China) en habitación temperatura. Las proteínas se detectaron entonces immumoreactive usando sustrato ECL siguiendo las recomendaciones del fabricante. β-actina se utilizó como una proteína endógena para la normalización. software de análisis de imágenes IPP se utilizó para la cuantificación.
RT-PCR y PCR en tiempo real
Para el análisis de la expresión DKK1 en las células NSCLC, el ARN total se aisló con Trizol. Igualdad de mRNA de cada muestra se transcribió inversamente en ADNc usando el cebador aleatorio. GAPDH se utilizó como control interno, las reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando los siguientes cebadores: DKK1, adelante 5'-CAACGCTATCAAGAACCTGC-3 ', 5'-Reverse GATCTTGGACCAGAAGTGTC-3'; GAPDH, adelante 5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3 ', 5'-Reverse TGGXGTGTGAACCACGAGAA-3'. PCR se optimizó para el número de ciclos para garantizar la intensidad de producto a estar dentro de la fase lineal de la amplificación, los productos de PCR fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa al 2%.
PCR en tiempo real se realizó utilizando SYBR
® verde (Código DRR041A, Takara) en un volumen total de 30μl más de un ciclo de dos pasos usando el siguiente protocolo de temperatura: 10 segundos a 95 ° C seguido de 42 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 55 ° C durante 30 s. Las reacciones se colocaron en una placa de 96 pocillos (ABI) utilizando un instrumento en tiempo real precalentado (ABI 7500HT). Los niveles relativos de expresión se cuantificaron y se analizaron usando software Bio-Rad iCycler iQ. Se realizaron tres experimentos independientes para analizar las expresiones de genes relativos y cada muestra se ensayó por triplicado. Los valores de Ct se utilizaron para calcular la expresión de los niveles de mRNA. La cantidad de expresión del gen diana (2-Ct) se normalizó usando la referencia de GAPDH endógeno, la cantidad de gen diana en la muestra de control se estableció como el calibrador en 1.0. Las secuencias de cebadores utilizados para la PCR en tiempo real se enumeran en la Tabla S1.
Ensayo de proliferación
MTT ensayo se utilizó para analizar la proliferación celular. Después de 24 h de transfección, las células fueron sembradas en placa de 96 pocillos a 5,0 × 10
3 células /ml y se cultivaron durante 24 h, 48 h, 72 h, y 96 h, respectivamente. En cada punto de tiempo, se añadió reactivo MTT 10μl (5 mg /ml, Sigma) a cada pocillo, y se incubó durante 4 horas a 37 ° C. se añadió 200μl DMSO (Invitrogen) para disolver los cristales de formazán de 30 min después de descartar el sobrenadante. espectrometría de absorbancia se midió a una longitud de onda de 490 nm en un lector de microplacas (Spectra Max M5, MD, EE.UU.). Para asegurar los resultados de cada muestra se analizó por triplicado y todos los experimentos se realizaron tres veces.
La cicatrización de heridas ensayo
La capacidad de migración se determinó usando un ensayo de cicatrización de heridas. células equivalentes se sembraron en placas de 12 pocillos sin antibióticos. Después de 24 h de transfección, las células fueron heridos con una punta de micropipeta de plástico 100 pl estéril, y los restos flotantes se lavaron con PBS y se cultivaron en medio libre de suero. Anchura de la herida se midió a diferentes puntos de tiempo. 3-4 lugares diferentes se visualizaron y fotografiaron bajo un microscopio invertido de contraste de fases (40 × objetivo, TE2000-E, Nikon, Japón).
Boyden ensayo de cámara de
ensayo se utilizó cámara de Boyden para examinar la capacidad de invasión de células. Las células fueron transfectadas con lipofectmine 2000. Después de 16 horas, se trataron con tripsina y se resuspendieron células. 5,0 × 10
4 células en 300μl de medio RPMI-1640 se colocaron en el compartimento superior (tamaño de poro de 8 micras; BD Biosciences). Las cámaras inferiores se rellenaron con 500μl de medio completo con 10% de FBS. Después de la incubación durante 48 horas a 37 ° C, las células de la superficie superior del filtro se retiraron con un hisopo de algodón. Las células migratorias sobre la superficie inferior de los insertos fueron fijadas y teñidas con 0,1% de cristal violeta durante 30 minutos a 37 ° C y se lavaron dos veces con PBS. Las células teñidas se visualizaron después bajo un microscopio y número de células se contó en cinco campos aleatorios (aumentos 100 x). cámara de Boyden se llevaron a cabo por duplicado en dos experimentos separados.
La inmunohistoquímica y de inmunofluorescencia
Para investigar el estado de la proteína DKK1 en muestras clínicas de NSCLC que se había incrustado en bloques de parafina, se realizó la tinción IHC de acuerdo con el siguiente procedimiento. secciones de parafina fueron desparafinados con xileno y rehidratada en soluciones de etanol graduado. La actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó con 3% de H
2O
2 durante 15 minutos a temperatura ambiente y después las secciones se calentaron con 0,01 M de citrato (pH = 6,0) a 95 ° C durante 15 min en el microondas durante la recuperación de antígeno . Después de la incubación con anti-DKK1 anticuerpo policlonal de conejo (ab22827, Abcam Inc, Cambridge, MA, dilución 1: 200) durante 2 h a temperatura ambiente, los controles negativos sin el anticuerpo primario. Las secciones se incubaron con marcado con HRP anti-conejo IgG anticuerpo secundario. La intensidad de la tinción de DKK1 se evaluó usando los siguientes criterios [12,14]: positivo fuerte (2 +), oscuro tinción marrón & gt; 50% de las células tumorales en el citoplasma; débilmente positivo (1+), cualquier menor grado de coloración marrón en las células tumorales; ausente (marcado como 0), inmunorreactivas para DKK1 10% o menos de las células tumorales. Las puntuaciones fueron evaluados por dos patólogos sin conocer los datos clinicopatológicas.
TE13 células se cultivaron en cubreobjetos de vidrio, que luego se fijaron con paraformaldehído al 4% y se permeabilizaron con 0,2% Triton X-100 en PBS durante 10 min a la habitación temperatura. Las células se bloquearon a continuación con 3% de BSA durante 30 minutos a temperatura ambiente, y después se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en PBS que contenía BSA 3% durante 60 min a temperatura ambiente. Después de ser lavado con PBS, las células se tiñeron con FITC conjugado con anticuerpos secundarios (Santa Cruz Biotechnology) durante 30 min a 37 ° C. Por último, los cubreobjetos se lavaron con PBS y se montaron núcleos con DAPI y se visualizaron con el microscopio confocal de barrido láser.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el software SPSS 10.0. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar. Se utilizaron la prueba t de Student y el análisis unidireccional de la varianza. Las relaciones entre las variables agrupadas se analizaron mediante la prueba de chi-cuadrado. Las curvas de supervivencia fueron producidos de acuerdo con el método descrito por Kaplan y Meier. Las diferencias entre las curvas se estimaron utilizando pruebas de log-rank. Los valores de p & lt; 0,05 se consideraron significativos. Todos los experimentos se realizaron al menos por triplicado [15].
Resultados
DKK1 expresión en líneas celulares de cáncer humanas cultivadas
La expresión de DKK1 se caracterizó en varios humana líneas celulares de cáncer. proteína DKK1 fue detectable en todas las líneas celulares (Figura 1). se observó expresión superior en LTEP-A-2 y GLC-82 líneas celulares. Bajo la expresión se observó en líneas celulares de cáncer A2 y 95c. expresión DKK1 mRNA también se examinó mediante el uso de RT-PCR, los resultados fueron consistentes con los resultados de transferencia Western (Figura 1. B). La localización subcelular de expresión DKK1 en la línea celular de NSCLC se define por la tinción de inmunofluorescencia. Los resultados mostraron que la expresión DKK1 se distribuyó principalmente en el citoplasma con una apariencia granular (Figura 1. C).
(A) Expresión de DKK1 en el nivel de ARNm (RT-PCR: 28 ciclos de amplificación). GAPDH mRNA se utilizó como control interno. (B) Expresión de DKK1 en el nivel de proteínas. β-actina se utilizó como control interno. (C) la localización subcelular de la proteína DKK1 endógena en células de NSCLC. DKK1, teñidas con rodamina B, fue en el citoplasma de la célula que aparece material de grano fino. núcleo celular apareció como fluorescencia azul manchado con DAPI (ampliación 100x).
Expresión DKK1 en los tejidos de NSCLC
Para examinar la expresión de la proteína DKK1 en el CPNM, secciones 102 pacientes con CPNM parafina se evaluaron mediante análisis inmunohistoquímico. De éstos, 46 (45,1%) mostraron una fuerte expresión DKK1 positivo, principalmente en el citoplasma de las células tumorales, con una distribución granular de color marrón oscuro. 19 (18.63%) muestras fueron expresión positiva débil con partículas de color amarillo pálido. mientras que el restante 37 (36.27%) fueron negativos. La tasa total de tinción positiva fue 63,73%. En contraste, ninguno de los epitelio normal mostró un nivel significativo de la tinción inmunohistoquímica (Figura 2A). Además, se analizó la correlación entre la expresión DKK1 y parámetros clínico; es interesante observar que las expresiones positivas de Dkk1 fueron acompañados principalmente con los ganglios linfáticos metástasis (Tabla 1). La tasa total de 5 años de supervivencia libre de enfermedad (SSE a 5 años) de los pacientes con DKK1 negativo fue del 27%, mientras que los pacientes con tumores DKK1-positivos mostraron DFS más pobres que aquellos con tumores negativos (SSE a 5 años; 15,4% frente 27%, P = 0,007) (Figura S1). Estos resultados indican que la sobreexpresión Dkk1 es un evento frecuente en NSCLC humano, lo que podría tener una relación potencial para la metástasis del NSCLC.
(A) Expresión por tinción inmunohistoquímica. DKK1 fuerte expresión positiva en el cáncer de pulmón que muestra tinción principalmente en el citoplasma de las células tumorales (aumento 100 x). DKK1 Representante débil cáncer de pulmón positiva con partículas de color amarillo pálido en las células tumorales (magnificación × 100). de células de cáncer de pulmón negativo DKK1 muestra casi ninguna mancha apreciable de células tumorales (magnificación × 100). tejido pulmonar normal y sin manchas. (B) La expresión de mRNA en tejidos DKK1 NSCLC y tejidos pulmonares normales emparejados. (C) La expresión de la proteína en los tejidos DKK1 NSCLC y tejidos pulmonares normales emparejados. N, tejido normal; T, tejido tumoral. expresiones positivas de DKK1 fueron acompañados principalmente con ganglios linfáticos metástasis.
Parámetros
n
expresión DKK1
χ
2
P
value
Positive(%)
Negative(%)
Age(years)<606439(60.9%)25(39.1%)0.5780.2940 ≥603826 (68,4%) 12 (31,6%) GenderMale8151 (63,0%) 30 (37,0%) 0.0990.4820 Female2114 (66,7%) 7 (33,3%) DifferentiationWell3221 (65,6%) 11 (34,4%) 0.0640.8003
*
Moderate4327 (62,8%) 16 (37,2%) Poor2717 (63,0%) 10 (37,0%) TT1117 (63,6%) 4 (36,4%) 0.12130.7276
**
T23623(63.9%)13(36.1%)T31824(66.7%)12(33.3%)T41911(57.9%)8(42.1%)N(Metastasis)Positive(N1+N2)5447(87.0%)7(13.0%)26.9760.0000 Negativo (N0) 4818 (37,5%) 30 (62,5%) Tabla 1. Correlación entre DKK1 y diversos parámetros clínico
*
Bien grupo vs. moderada;
**
T3 vs T4.
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A continuación observamos la expresión de DKK1 en los tejidos de NSCLC resecado quirúrgicamente y tejidos normales emparejados. Entre 10 casos de NSCLC, 7 mostraron expresión significativamente upregulated de DKK1 ARNm en tejido de cáncer en comparación con el correspondiente tejido normal (Figura 2B). Western blot resultados mostraron la misma tendencia en el nivel de proteína DKK1 (Figura 2C).
Efecto de la sobreexpresión DKK1 sobre la migración y la invasión en 95C
Para probar el papel biológico de DKK1 en las células NSCLC, nos examinado la consecuencia de la sobreexpresión de DKK1 sobre la migración celular y la capacidad de invasión en la línea celular 95C, que en realidad tienen un nivel muy bajo de DKK1 endógeno. vector de expresión eucariota pCMV-Tag-2b-DKK1 se construyó a sobreexpresan el gen DKK1. Se observó un aumento significativo en los niveles tanto de la proteína DKK1 y mRNA en la línea celular 95C transfectadas con pCMV-Tag-2b-DKK1 comparación con el control en blanco y el control negativo (Figura 3 A). Posteriormente, el ensayo de MTT reveló que la sobreexpresión de DKK1 no alteró la capacidad de proliferación de las células (datos no presentados). Sin embargo, la capacidad de migración fue promovido en el ensayo de curación de la herida (Figura 3. B, C). cámara de Boyden se utilizó para probar la capacidad de invasión, 95C células fueron transfectadas con cualquiera pCMV-Tag-2b-DKK1 o pCMV-Tag-2b, y el grupo de control en blanco se añadió reactivo de transfección sin plásmido. Después de la transfección 18 h, las células se volvieron a sembrar en la parte superior del inserto. Las células que invadieron a través de la barrera y llegaron al otro lado del inserto de la cámara se registraron después de 48 h de incubación. resultados cámara de Boyden mostraron que las células que pasaron a través de la membrana en el grupo de pCMV-Tag-2b-DKK1 era mayor que los otros dos grupos (Figura 3. D). Estas observaciones indican que la sobreexpresión de DKK1 puede promover significativamente la capacidad de invasión de las células 95c (Figura 3. E).
(A) RT-PCR y Western blot de la expresión DKK1. nivel DKK1 en la celda 95C transfectadas con pCMV-Tag-2b-DKK1 es significativamente más alta que en pCMV-Tag-2b y grupo de control en blanco. (B) Las células 95c heridos y curativas. (C) La medición de la distancia de migración (*
P Hotel & lt; 0,05). (D) La capacidad de invasión de 95C transfectadas con pCMV-Tag-2b-DKK1 se ha mejorado significativamente. (E) se analizó estadística El número de células que migran a través de los filtros revestidos con Matrigel. Los ensayos se realizaron en pocillos por triplicado (*
P
& lt; 0,01).
Desmontables de DKK1 endógena de siRNA redujo la migración y la invasión en LTEP-A-2
Se analizaron los efectos de la caída DKK1 sobre la migración y la invasión en LTEP-a-2 línea celular . Para determinar la eficacia de abatimiento del shRNA, el nivel DKK1expression en líneas LTEP-a-2 de células fue examinado por ambos RT-PCR y Western blot. El siRNA específico reduce efectivamente la expresión endógena de DKK1 en las células que fueron transfectadas con pSilencer-DKK1 en comparación con las células que se transfectaron con pSilencer-NC vector (Figura 4. A).
(A) RT- PCR y Western blot de la expresión DKK1. DKK1 nivel in-a-2 LTEP de células transfectadas con pSilencer-DKK1 es significativamente menor que en pSilencer-NC y el grupo de control en blanco. (B) Los LTEP-a-2 células heridos y curativas. (C) La medición de la distancia de migración (*
P Hotel & lt; 0,05). (D) La capacidad de invasión de LTEP-a-2-transfectadas con pSilencer DKK1 fue reprimida de forma significativa. (E) se analizó estadística El número de células que migran a través de los filtros revestidos con Matrigel. Los ensayos se realizaron en pocillos por triplicado (*
P Hotel & lt; 0,01).
Desmontables de DKK1 endógena de siRNA no afectó LTEP-a-2 de proliferación (datos no mostrados), pero reprimida significativamente la capacidad de migración en el ensayo de curación de heridas. La tasa de migración de las células pSilencer-DKK1 en la cicatrización de heridas fue significativamente menor después de la transfección 48h que la de pSilencer-NC y el grupo blanco de control (Figura 4. B, C). Cuando se cultivan en la cámara de Boyden, el número de células que migraron a través de los filtros porosos recubiertos con Matrigel se redujo significativamente en células pSilencer-DKK1 desmontables DKK1 en comparación con pSilencer-NC y el grupo de control en blanco (Figura 4. D, E).
sobreexpresión de DKK1 expresión genes asociados alterado
para explorar el mecanismo de DKK1 en la progresión del cáncer de pulmón, PCR en tiempo real se realizó para detectar el efecto de la sobreexpresión DKK1 en la expresión de genes implicados en la carcinogénesis relativos. La sobreexpresión de DKK1 no alteró la expresión de la proteína relacionada con el ciclo celular cyclinD1 y las proteínas relacionadas con la apoptosis Bcl-2 y la caja. AKT-1 asociado con la vía de señalización se reguló mínimamente en la célula 95C transfectadas con pCMV-Tag2b-DKK1. La expresión de MMP-2 y VEGFC en la célula 95C transfectadas con pCMV-Tag2b-DKK1 se incrementó 7,78 veces y 2,13 veces en comparación con el control de las células 95c, respectivamente (Tabla S2).
Discusión
la familia de proteínas DKK humanos se compone de DKK1, DKK-2, DKK-3, DKK-4 y una proteína relacionada DKK3-único, denominado empapado [17]. DKK1, que codifica una proteína secretada, es un antagonista de la señalización /β-catenina Wnt que está implicado en la progresión tumoral [13,18-22]. DKK1 se expresa en numerosos cánceres humanos; podría desempeñar diversas funciones biológicas en las células tumorales en función del tipo de célula en cuestión. DKK1 está regulada positivamente en algunos tipos de tumores humanos, incluyendo CPNM, carcinoma hepatocelular, cáncer de páncreas [12,14,19,23]. Parecía que DKK1 podría desempeñar un papel crucial en la progresión de estos tipos de tumores, pero los efectos biológicos de DKK1 en NSCLC no se han aclarado. En este estudio, se confirmó que DKK1 se expresa en un panel de líneas celulares de NSCLC. Immunoflouresence mostró que DKK1 expresión de localización subcelular fue distribuido principalmente en el citoplasma de células de NSCLC. El estudio de la expresión de IHC DKK1 en 102 especímenes NSCLC secciones revelaron que la expresión positiva de DKK1 se correlaciona con los ganglios linfáticos metástasis; que puede ser un predictor de la metástasis del cáncer. Con respecto al pronóstico, la expresión positiva de la proteína DKK1 correlaciona con una supervivencia triste 5-años. DKK1 está regulada positivamente en los tejidos de NSCLC en comparación con los tejidos normales emparejados. Por lo tanto, es posible que DKK1 está implicado en la progresión del NSCLC.
DKK1 es una proteína secretada que contiene una secuencia de péptido señal y dos dominios y funciones ricos en cisteína como un regulador negativo de la señalización de Wnt [6, 7]. Además, DKK1 se informó a ser un blanco de abajo del factor β-catenina /de células T y participa en un bucle de retroalimentación negativa en la señalización Wnt en las células de cáncer de colon [24,25]. Los estudios han indicado que la sobreexpresión de DKK1 se asocia con un mal pronóstico [14,19,21], mientras que poco se sabe acerca de la función de DKK1 en el CPNM. Para estudiar más a fondo los efectos biológicos de DKK1 en ivtro, en primer lugar, se verificó que la sobreexpresión de DKK1 promueve la migración y la invasión en la línea celular 95C NSCLC humano. Mientras tanto, la sobreexpresión de DKK1 upregulated la expresión de proteínas relacionadas con la metástasis, pero el mecanismo detallado necesita ser mayor estudio. Por otra parte, el uso de la expresión eucariota de DKK1 shRNA, demostramos que desmontables de DKK1 suprime la migración y la invasión de la línea de células de NSCLC resultados LTEP-a-2.Las indicar que DKK1 podría tener un papel positivo en la progresión del NSCLC, pero el mecanismo implicado en la invasión necesita estudiar más.
Sin embargo, algunos estudios han informado de que DKK1 suprime el crecimiento celular y la migración [16,26] lo que sugiere que puede haber otros papeles de DKK1 en la señalización /β-catenina vía. DKK1 podría desempeñar diversas funciones biológicas en diferentes tipos de células cancerosas. Un análisis retrospectivo de expresión DKK1 mostró que DKK1 se altera durante la progresión del CaP [27]. Hasta el momento, sólo se han publicado algunos estudios sobre las funciones de DKK1 en CPNM, principalmente centrándose los valores de diagnóstico y pronóstico [12,21,28-30]. El papel de DKK1 en NSCLC, su mecanismo de función y aspectos clínicos necesitan más estudios.
En resumen, aunque la función detallada de DKK1 en la progresión del NSCLC no está bien aclarado, nuestros resultados sugieren la posible función de DKK1 en la promoción de la migración y el crecimiento invasivo en líneas celulares de cáncer, y que podrían servir una nueva diana terapéutica para el NSCLC.
Apoyo a la Información
Figura S1.
curva de supervivencia libre de enfermedad clasificada de acuerdo a la expresión DKK1 para todos los pacientes representados por los métodos de Kaplan-Meier.
doi: 10.1371 /journal.pone.0084944.s001 gratis (TIF)
Tabla S1.
secuencia de los cebadores utilizados para la PCR en tiempo real.
doi: 10.1371 /journal.pone.0084944.s002 gratis (DOC) sobre Table S2. la expresión de los genes
Diferencial en 95C transfectadas con pCMV-Tag2b-DKK1 en relación con 95C transfectadas con pCMV-Tag2b.
doi: 10.1371 /journal.pone.0084944.s003 gratis (DOC)