Extracto
Cáncer de células madre son células cancerosas caracterizan por propiedades de células madre y representan una pequeña población de las células tumorales que impulsa el desarrollo del tumor, progresión, metástasis y resistencia a los medicamentos. Hasta la fecha, los mecanismos moleculares que generan y regulan las células madre de cáncer no están bien definidos. BORIS (Hermano de Regulador de los sitios marcados) o CTCFL (CTCF-como) es una proteína de unión al ADN que se expresa en tejidos normales sólo en las células germinales y se reactiva en los tumores. Evidencias recientes han puesto de manifiesto la correlación de
BORIS /CTCFL
expresión con una mala supervivencia global de los pacientes con cáncer diferentes. Hemos demostrado previamente una asociación de células con la expresión de genes en células de cáncer stemness embrionarias BORIS-expresión. Aquí, se estudió el papel de BORIS en las células tumorales epiteliales. El uso de baliza molecular BORIS que ya fue validado, hemos sido capaces de demostrar la presencia de
BORIS
mRNA en poblaciones madre del cáncer enriquecidas en células (parte de población y esferas) de células de tumor de mama de cuello de útero, colon y. BORIS estudios de silenciamiento mostraron una disminución de la capacidad de formación de esferas en las células tumorales de mama y de colon. Es importante destacar que, BORIS-silenciamiento llevó a la baja regulación de
hTERT
, células madre (
NANOG
,
Oct4
,
Sox2
y
IMC1
) y marcadores de células madre del cáncer (
ABCG2
,
CD44 genes
ALDH1
) guía y. Por el contrario, BORIS-inducción condujo a la regulación de los mismos genes. Estos fenotipos se observaron en las células tumorales de mama invasivo cervical, de colon y. Sin embargo, se observó un comportamiento completamente diferente en las células de tumor de mama no invasivos (MCF7). De hecho, estas células adquieren un fenotipo mesenquimal epitelial después de BORIS silenciamiento. Nuestros resultados demuestran que BORIS se asocia con poblaciones enriquecidas en células madre del cáncer de varias células tumorales epiteliales y los diferentes fenotipos dependerá del origen de las células tumorales
Visto:. Alberti L, L Losi, Leyvraz S, Benhattar J (2015) diferentes Efectos de BORIS /CTCFL en stemness Expresión génica, Formación de Esfera y la célula de supervivencia en cáncer epitelial de células madre. PLoS ONE 10 (7): e0132977. doi: 10.1371 /journal.pone.0132977
Editor: Gabriele Saretzki, Universidad de Newcastle, Reino Unido
Recibido: April 2, 2015; Aceptado 19 de junio de 2015; Publicado: 17 Julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Alberti et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Financiación:. el apoyo financiero fue dada por la Swiss National Science Foundation (31003A-113505) y la Fundación Emma Muschamp. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Uno de los autores (JB) se emplea por un laboratorio de patología molecular (Biopath Lab). Biopath Lab prestado apoyo en forma de salarios, pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Uno de los autores (JB) es empleado de un laboratorio de patología molecular (Biopath Lab). Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
evidencias enorme apoyo de la opinión de que el cáncer humano se podría considerar como una enfermedad de células madre [1- 3]. La teoría de las células madre cancerosas (CSC) supone que los cánceres son vistos como tejidos complejos donde el crecimiento celular aberrante es impulsado por una pequeña población de células definidas como células iniciadoras del tumor. Estas células se caracterizan por tres propiedades principales: capacidad de proliferación sin control, la capacidad de auto-renovación y capacidad de diferenciarse en una progenie no CSC [3, 4]. Curiosamente, las propiedades de estas células malignas son muy similares a los tres rasgos que caracterizan a las células madre normales: el potencial de proliferar extensivamente, la auto-renovación y la capacidad de desarrollar en múltiples linajes. En consecuencia, las células tumorales con estas propiedades también se denominan células madre del cáncer. Las primeras observaciones de la presencia de células madre cancerosas se realizaron en la leucemia mieloide aguda humana [5] y en consecuencia desarrollado en diferentes tipos de tumores sólidos humanos, como de mama [6], el cerebro [7], colon [8, 9], de páncreas [10 ] y 11] tumores [ováricos. Se ha demostrado que muchos pacientes con cáncer, especialmente con tumores sólidos, responder mal a las terapias convencionales, tales como quimioterapia y radioterapia, y después de una remisión parcial inicial, los tumores recaída. Las razones de este fracaso podría explicarse por la resistencia de drogas y radiactividad de los CAC. Además, se ha demostrado que células madre cancerosas son más frecuentes en tumores altamente agresivos y refractarios [6-7]. Por lo tanto, es extremadamente importante para identificar las poblaciones de CSC y sus marcadores para desarrollar terapias dirigidas-CSC para superar la resistencia de los CAC a los fármacos contra el cáncer convencionales. El uso de enfoques experimentales, las células madre cancerosas de muchos tipos de tumores se han caracterizado fenotípicamente y varios marcadores de CSC se han identificado [4, 12]. Sin embargo, la mayoría de los marcadores identificados no son totalmente específicos de células madre cancerosas, ya que también se expresan en las células normales, y por lo tanto, se requiere el uso de múltiples marcadores. Serán necesarios muchos esfuerzos en la investigación del cáncer para optimizar la orientación CSC terapias. Existen varios enfoques para enriquecer las poblaciones CSC, que se utilizan principalmente para
in vitro
análisis y métodos de cribado en. Un enfoque se basa en la selección de una subpoblación de células que es capaz de flujo de salida colorantes. El flujo de salida de estos colorantes es una capacidad de células madre cancerosas que expresan genes que codifican los transportadores de fármacos casete de unión a ATP-(ABC), tales como ABCG2 [13-15]. El tinte más utilizado es Hoechst 33342, que es un colorante de unión a ADN. La subpoblación seleccionada por este método se denomina población lado (SP). La actividad de aldehído deshidrogenasa (ALDH) es otra propiedad funcional de las células madre, que se utiliza para aislar enriquecido población CSC [16, 17]. Un
in vitro
enfoque adicional se basa en no adherente de cultivo libre de suero [8, 18]. Usando este método, las células de diferentes tipos de tumores (incluyendo cerebro, mama y colon), que tienen la capacidad de auto-renovación y para mantener las propiedades de las células madre, pueden formar colonias esferoide esferas con el nombre [19].
BORIS (Hermano de Regulador de los sitios marcados) es una proteína de unión al ADN que comparte con su paralog CTCF, un dominio de dedos de zinc-11, por tanto, también llamada CTCFL (CTCF-como) [20]. proteína BORIS está involucrado en la reprogramación epigenética y pertenece a la familia de antígenos de testículo de cáncer, ya que se expresa en células germinales normales y reactivada en los tumores. Informes recientes indican que la expresión de BORIS se asocia con la etapa avanzada en diferentes tipos de cáncer, como el de ovario, de próstata, de esófago y cáncer hepatocelular [21-24]. En los cánceres de ovario, la expresión de BORIS puede conferir también mal pronóstico [21]. Nuestro estudio anterior ha demostrado la asociación de la expresión de BORIS con células madre y genes marcadores de CSC en células de carcinoma embrionario [25]. En total, estas evidencias nos llevó a investigar más la presencia y las funciones moleculares de BORIS en las poblaciones enriquecidas en células madre cancerosas en otros tipos de células tumorales y, específicamente, en las células cervicales, de colon y de tumores de mama. Como todavía no existe un anticuerpo contra BORIS validado, se utilizó la baliza molecular BORIS (BORIS-MB), que fue previamente probado y validado en
in vivo
detección de
BORIS
ARNm [25 ]. BORIS-MB nos permitió visualizar las células BORIS-positivos en las células epiteliales tumorales analizadas. Curiosamente, encontramos que
BORIS
está altamente expresado en poblaciones enriquecidas-CSC aislados de SP y esferas. Por otra parte, los estudios funcionales revelaron que BORIS podría desempeñar un papel importante en la auto-renovación de los tumores y en la adquisición de la firma del epitelio mesenquimal (EMT) en la base del origen de las células tumorales.
Materiales y Métodos
las células y esferas preparación
las líneas celulares humanas (HeLa, adenocarcinoma de cuello uterino; HT29, adenocarcinoma de colon; NCCIT, carcinoma embrionario) fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC) y la humana líneas celulares de mama (MCF7 y MDA-MB-231) fueron proporcionados por el Dr. Renaud Stéphanie (Instituto de Biotecnología de la Universidad de Lausana). Las células se cultivaron a 37 ° C con 5% de CO
2, ya sea en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco, Invitrogen) para las células HeLa y HT29, o en medio RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen) para NCCIT, MCF7 y las células MDA-MB-231, suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor. (FBS; Invitrogen) y 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, Invitrogen)
Para el cultivo de esfera, las células (HT29, MCF7 y MDA-MB-231) se separaron primero con una solución de 0,25% de tripsina (Invitrogen) y se lavaron dos veces en PBS (Invitrogen). Luego, las células se filtraron dos veces usando una célula-colador de 40 tamaño de malla micras (Falcon) y se cultivaron en medio libre de suero que contenía DMEM /F-12 medio (Invitrogen) suplementado con B27 (Invitrogen), 5 mg /ml de heparina (Sigma ), 20 ng /ml EGF (factor de crecimiento epidérmico, BD Biosciences), 20 ng /ml de FGF (factor de crecimiento de fibroblastos, BD Biosciences) y 5 mg /ml de insulina (Sigma). Las células se sembraron en ultra bajo de fijación placas de 6 pocillos (Corning) en la densidad de 1.000 células /ml durante 10-15 días. Las esferas se contaron y se recogen para la extracción de RNA. Una alícuota de esferas se sembró en medio normal con suero para permitir la diferenciación.
análisis de fluorescencia utilizando BORIS-MB
Las células se prepararon como se describe anteriormente [25]. Brevemente, las células en suspensión (1 x 10
6 células /ml) se incubaron a 37 ° C durante 1,5 horas en medio DMEM libre de suero con Cy3-BORIS MB (200 nM) y Hoechst 33342 (5 mg /ml) en presencia de un reactivo de transfección Lipofectamine RNAiMAX siRNA (Invitrogen). Las células se lavaron, se resuspendieron en EDTA PBS-5 mM y cytocentrifugated sobre portaobjetos de vidrio utilizando una centrífuga cytospin y luego examinado bajo un fluorescente (Axioplan2 Imaging, Zeiss) o un confocal (LSM 710 Quasar, Zeiss) microscopio.
Para la tinción de fluorescencia ABCG2, se prepararon las células tal como se describe más allá. Después de cytospin, las células se fijaron con acetona fría en hielo durante 8 minutos y se tiñeron a 4 ° C durante la noche con anticuerpo de conejo anti-humano ABCG2 (Sigma) usado a una dilución de 1:20 en PBS. Los portaobjetos se lavaron con PBS y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con el burro anti-conejo anticuerpo secundario marcado con Alexa Fluor 488 (Sigma) utilizada a 1: 500 dilución en PBS. Los portaobjetos se examinan con microscopio de fluorescencia.
Análisis
FACS y clasificación de SP
células HeLa (1 x 10
6 células /ml) se incubaron en medio libre de suero a 37 ° C durante 1,5 horas con Hoechst 33342 (Invitrogen) a una concentración final de 12,5 mg /ml ya sea solo o en combinación con 50 mM verapamil (Sigma) como un control. Las suspensiones celulares se mezclaron periódicamente durante la incubación. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS y se resuspendieron en EDTA PBS-5 mM. Antes del análisis, las células se incubaron con yoduro de propidio (2 mg /ml) y se filtró usando una celda de colador de 40 micras de malla (Falcon). análisis SP se realizaron utilizando LSRII (Becton Dickinson) y la clasificación de SP y NSP (no-SP) utilizando FACS Aria (Becton Dickinson) en la instalación de EPFL (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne). Hoechst 33342 fue excitada a 355 nm y su fluorescencia se analizó mediante doble longitud de onda de emisión, 445 nm para Hoechst azul y 650 nm para Hoechst rojo.
expresión ectópica BORIS
Las células HeLa se transfectadas con el plásmido pCMV-BORIS usando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen) como se describe anteriormente [25].
BORIS caída por el sistema lentiviral shRNA inducible
líneas celulares que expresan shRNAs establos con inducibles orientación humana
BORIS
ARNm se prepararon como se describe anteriormente [25]. líneas celulares tumorales HeLa, HT29, MCF7 y MDA-MB-231 se utilizaron en estos experimentos.
BORIS ADNc expresión inducible por el sistema lentiviral
Las líneas celulares estables con inducible humana que expresa
BORIS
cDNA se generaron utilizando el sistema lentiviral doxiciclina-inducible [26]. BORIS ADNc a partir de pCMV-BORIS plásmido fue clonado en pINDUCER20 por el sistema de puerta de enlace Cloning (Invitrogen). El vector lentiviral pINDUCER20 contiene el marcador de selección de antibióticos de G418 (geneticina), que permite seleccionar sólo las células transducidas. Este vector también contiene un casete con un promotor inducible por doxiciclina que controla la transcripción del cDNA clonado. Para la generación de lentivirus, seguimos nuestro procedimiento como se describe anteriormente [25]. La suspensión viral se combina con 8 mg /ml de polibreno (Sigma) se utilizó para infectar células diana (HeLa, HT29, MCF7 y MDA-MB-231). Veinticuatro horas después de la infección el medio se reemplazó con medio suplementado con G418 500 mg /ml (Roche). Después de 2 semanas de selección de antibióticos, se añadieron 2 g /ml de doxiciclina (Sigma) al medio para permitir la inducción de
BORIS
expresión de ADNc y medio que contiene doxiciclina era renovados cada 3 días.
análisis cuantitativo de RT-PCR
análisis de QRT-PCR se realizaron como se describe anteriormente [25]. Se utilizó el método ΔΔCt para determinar los niveles relativos de expresión, que eran normalizado a
GAPDH
nivel. Como ya se ha informado [25], para todos los genes diana amplificadas por PCR eficiencia se extendía desde 94 al 101%, con un coeficiente de correlación (r2) entre el 0,96 y 1.0. Los valores de Ct de GAPDH midieron los niveles similares (Ct = 10,07 ± 0,25) para todas las células analizadas.
Las secuencias de cebador utilizado además se muestran en la Tabla S1.
CD44 + /CD24 - análisis por citometría de flujo
CD44 expresión + /CD24- se analizó en células diseñadas para exhibir de forma estable caída
BORIS
ARNm o expresar
BORIS
ADNc. Las células se trataron con tripsina y 10
6 células se resuspendieron en 100 l de PBS-1% de FBS. Se añadieron anticuerpo monoclonal de ratón CD44-APC-H7 anti-humano (BD Pharmingen) y un ratón monoclonal anti-CD24 humano-Alexa Fluor 647 de anticuerpos (BD Pharmingen) a diluciones de 1:20 y 1: 5, respectivamente, como se sugiere por el fabricante, y se incubó durante 40 min a 4 ° C. DAPI se añadió a una concentración de 1 mg /ml durante los últimos 10 minutos de incubación. Después de lavar con PBS-1% de SFB, citometría de flujo análisis se realizaron utilizando Gallios citómetro de flujo (Beckman Coulter). Al menos 5 x 10
4 eventos fueron contados para todas las muestras. El análisis del porcentaje de células + /CD24- CD44 se estimó después de excluir las células muertas (células positivas) y DAPI gating sobre las células eGFP y tRFP positivos. Los resultados fueron analizados utilizando el software FlowJo. Se realizaron tres experimentos independientes.
Colonia ensayo de formación de
Las células se trataron con tripsina y se resuspendieron en medio. Trescientos células fueron sembradas en 6 así /placas por triplicado. Las células se cultivaron en medio que contiene doxiciclina-recién. Después de 2 semanas, las células se fijaron con 1 ml de 4% de formaldehído durante 10 min a temperatura ambiente y se tiñeron con 1 ml de 0,1% de cristal violeta para 10 min. Después de lavar con PBS, cada pocillo fue fotografiado y las colonias (determinado como & gt; 50 células /colonia). Se contaron usando el programa ImageJ
ensayo de migración
La migración celular se determinó utilizando insertos de cultivo celular (BD Falcon) con tamaño de poro 8 micras. Brevemente, se recogieron y se resuspendieron en medio libre de suero de las células, 5 x 10
4 Las células se sembraron en la parte superior de inserciones colocadas en placas de 24 pocillos. En el fondo del pozo de los insertos se añadieron 500 l medio suplementado con 10% FBS. Después de 48 horas de incubación, las células no migran se eliminaron con un hisopo de algodón y las células que migran (en la superficie inferior de la pieza de inserción) se fijaron con 1 ml de 4% de formaldehído y luego se tiñeron con 1 ml de 0,1% de cristal violeta por 10 min. Después se lavaron 3 veces con PBS, se contaron las células que migran menos de diez de alta potencia campos microscópicos al azar por inserción y el número medio de células que migran se calculó para cada grupo de células.
proliferación celular y quimio-sensibilidad ensayos
análisis de la proliferación celular después de BORIS BORIS silenciamiento y la inducción se evaluó mediante el ensayo MTT como se describe anteriormente [25].
in vitro
efecto de crecimiento En de 5-fluorouracilo (5- FU) se determinó mediante el ensayo de MTT. En pocas palabras, cada grupo de células, después de BORIS silenciamiento, se sembró por triplicado a la densidad de 1 x 10
4 células /pocillo en placas de 96 pocillos en medio que contiene doxiciclina. El día después, se añadió 5-FU (Sigma) a diferentes concentraciones: 0,5, 5, 50 y 500 mg /ml. Las células se incubaron durante 2 días y luego la viabilidad celular se midió por el ensayo MTT. La inhibición del crecimiento o fracción de supervivencia se expresó como un porcentaje de los controles sin tratar que se midieron a la vez, usando la ecuación: (absorbancia de la muestra tratada /absorbancia de la muestra sin tratar) x 100.
El análisis estadístico
La significación estadística se evaluó mediante el análisis de la prueba t de Student de dos colas. Valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
BORIS
ARNm se expresa en las células de población secundarios
Para investigar la presencia de
poblaciones BORIS
mRNA en CSC-enriquecidos de células tumorales epiteliales, que utilizan como modelos de lo humano HeLa (cuello uterino), HT29 (colon), MCF7 (cáncer de mama no invasivo) y MDA-MB-231 (mama invasivo) líneas de células tumorales. El análisis de expresión mostró un menor nivel de
BORIS
mRNA en células HeLa y HT29 comparación con las células tumorales embrionarias (NCCIT), mientras que en MCF7 y MDA-MBA-231
BORIS
ARNm era casi indetectable ( Fig 1A). Por lo tanto, las células tumorales HeLa, HT29, MCF7 y MDA-MBA-231 se pueden clasificar como las células tumorales que expresan BORIS-bajo.
(A)
BORIS
expresión en líneas celulares de tumores humanos. El ARN total de NCCIT (embrionario), HeLa (cuello uterino), HT29 (colon), MCF7 (cáncer de mama no invasivo) y MDA-MB-231 (mama invasivo) se extrajeron las células tumorales y
se analizó la expresión de BORIS
por QRT-PCR. Los resultados se normalizaron a
GAPDH
y en relación con las células NCCIT. Las barras de error representan la media ± SD (n = 3). (B)
BORIS
expresión tal como se detectó usando BORIS-MB. Imágenes representativas de HeLa, HT29, MCF7 y MDA-MB 231 células, magnificación de 40X. Las células fueron incubadas con Cy3-BORIS MB (200 nM) y Hoechst 33342 (5 mg /ml) a 37 ° C durante 1,5 horas en medio libre de suero y luego se examinan bajo microscopía de fluorescencia. Las flechas blancas indican las células negativas Hoechst, que también son
BORIS
ARNm positiva detectada por BORIS-MB.
Población lado Hoechst (SP) análisis es una técnica probada para enriquecer tallo y principios células progenitoras en diferentes líneas celulares [13-15]. El análisis de imágenes de fluorescencia se realizó utilizando Hoechst 33342 en combinación con
BORIS
ARNm detección utilizando BORIS-Molecular Beacon (BORIS-MB), tal como se describe anteriormente [25]. Los análisis de imágenes de fluorescencia mostró que las células positivas BORIS son sólo un subconjunto de células en todas las líneas de células tumorales epiteliales analizados (Fig 1B), en consonancia con los resultados obtenidos en las células tumorales embrionarias [25]. La frecuencia estimada de células positivas BORIS es de aproximadamente 0,1% en HeLa, 0,5% en HT29 y menos de 0,05% en las células MCF7 y MDA-MBA-231; en contraste era aproximadamente el 5% en NCCIT [25]. Curiosamente, los análisis de imágenes de fluorescencia mostraron que la mayoría de las células positivas se BORIS también Hoechst negativo (flechas blancas en la Fig 1B y S1 Fig). Por lo tanto,
BORIS
expresión puede estar asociada con Hoechst fenotipo negativo de células SP en células de tumor de mama de cuello de útero, colon y. Sin embargo, un pequeño porcentaje (menos de 10%) de células positivas se BORIS Hoechst positivo.
ABCG2 se describe como la bomba de eflujo principal responsable de fenotipo negativo Hoechst en células SP [27]. Por lo tanto, una posible co-expresión de
BORIS Vaya con el ABCG2 proteína quimio-resistencia transportador, se investigó en primer lugar. Se utilizaron células HeLa en este experimento. Como puede verse en la figura 2A, las células BORIS positivos son ambos negativos para Hoechst (flechas blancas) y positivas para la proteína ABCG2. Para confirmar la presencia de
BORIS
mRNA en población enriquecida-CSC de las células HeLa, las células SP y también las células no-SP (NSP) se clasificaron por FACS. El porcentaje de células SP fue de 0,5% a 1,5% de las células totales (Fig 2B), en consonancia con los informes anteriores [15, 27]. La fracción SP fue completamente reducido mediante la adición de verapamilo, un inhibidor de los transportadores ABC-, lo que indica que la población de células SP fue de buena fe. El análisis de QRT-PCR mostró que
BORIS
nivel de ARNm de células SP fue significativamente mayor (12 veces, p & lt; 0,05) en comparación con NSP y las células HeLa parentales (Figura 2C). También el
ABCG2
nivel de mRNA fue mayor (aproximadamente 1,5 veces) en SP ordenadas las células en comparación con NSP y las células parentales (figura 2D). A fin de verificar la presencia de
BORIS
en la población enriquecida-CSC SP, la frecuencia de SP se analizó en las células HeLa transfectadas con pCMVBORIS (Fig 2E). Como era de esperar, las células que sobreexpresan BORIS fueron significativamente más enriquecidos en células SP (2 veces, p = 0,01) en comparación con células parentales HeLa. Todos estos resultados indican que el aislamiento de células BORIS-positivo podría dar lugar a un enriquecimiento de la población CSC en las células tumorales HeLa.
(A) El análisis de inmunofluorescencia de ABCG2 en células HeLa. Las células se incubaron con BORIS-MB y Hoechst 33342 a 37 ° C durante 1,5 h en medio libre de suero. Después de cytocentrifugation los portaobjetos se fijaron con acetona fría y después se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo ABCG2. El BORIS positivo /ABCG2 positivos /negativos células Hoechst se indican con flechas blancas. aumento de 10X. (B) Representante gráfico de puntos de citometría de flujo análisis de SP. Las células HeLa se incubaron con Hoechst 33342 (12,5 mg /ml) ya sea solo o en combinación con verapamil (50 M). El análisis se realizó utilizando LSRII y la clasificación mediante FACS Aria. Las puertas indican las células SP y NSP ordenados. (C)
BORIS
mRNA y (D)
ABCG2
la expresión de ARNm en SP y NSP aislado de células HeLa. El ARN total se extrajo y se analizó mediante qRT-PCR. Los gráficos indican los niveles de mRNA de
BORIS
y
ABCG2
genes normalizado a
GAPDH
y relacionados con las células HeLa parentales. Los datos se representan como media ± DE de 3 experimentos independientes. El asterisco indica p & lt; 0,05. (E) Análisis de SP en células BORIS sobreexpresados. células HeLa fueron transfectadas transitoriamente con un vector de expresión de BORIS (HeLa pCMVBORIS). Después de 2 días, 1 x 10
6 Se incubaron las células con Hoechst 33342 (12,5 mg /ml) ya sea solo (parte superior) o en combinación (parte inferior) con 50 mM verapamil. El análisis se realizó utilizando LSRII citometría de flujo y se muestra un experimento representativo de 3 experimentos independientes.
Colon-esferas y mammo-esferas expresan altos niveles de
BORIS
ARNm
El crecimiento de las células en suspensión, con un medio (cultura esfera) libre de suero, es un enfoque común para el enriquecimiento de CSC-[7-8]. Como se informó esta propiedad a ser restringida a las células madre /progenitoras [19],
BORIS
expresión se examinó también en la formación-esferas de dos puntos (HT29) y las células de tumor de mama (MCF7). Una alícuota de las esferas se sembraron en medio que contiene suero para permitir la diferenciación. Curiosamente,
BORIS
análisis de la expresión revelaron un nivel significativamente mayor de
BORIS
mRNA en el colon-esferas (37,2 ± 7,3 veces, n = 4), así como en mammo-esferas (30.9 ± 6.4 pliegue, n = 4), en comparación con las células parentales y diferenciadas-esferas (figura 3). Estos resultados sugieren que
BORIS
se expresa en las esferas enriquecidos-CSC de las células del colon y del tumor de mama.
Las células fueron sembradas a baja densidad (1.000 células /ml) en medio de cultivo en la esfera baja placas de unión. Después se recogieron las esferas 10-15 días para la extracción de ARN y una alícuota de esferas se sembró en medio normal con suero para permitir la diferenciación (-esferas diferenciadas).
BORIS
expresión fue analizado por PCR QRT en el colon-esferas (A) (esferas HT29) y-esferas diferenciadas (esferas HT29 DIFF) y en (B) mammo-esferas (esferas MCF7) y-esferas diferenciadas ( MCF7 DIFF esferas). Los datos se normalizaron a
GAPDH
y en relación con las células parentales (células). Se muestra un experimento representativo de 4 experimentos independientes. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (p & lt; 0,05) entre las esferas y las células parentales. (C) se muestran imágenes representativas de Colon-esferas y mammo-esferas, magnificación 4X. barras de escala indican Negro 250 micras.
Expresión de genes y fenotipo CSC en desmontables células BORIS
Para explorar un posible papel de BORIS en células madre cancerosas, se seleccionaron una estrategia desmontables utilizando el sistema lentiviral con inducible expresar shRNAs dirigidos humana
BORIS
ARNm. El BORIS SH-3, lentivirus revueltos-shRNA (CTR) sh sh BORIS-4 y se generaron y validados previamente [25]. Estos lentivirus se utilizaron para infectar células tumorales HeLa, HT29, MCF7 y MBA-MD-231.
Se ha demostrado que BORIS activa
hTERT
expresión [28] y afecta a la expresión de stemness genes en las células tumorales embrionarias [25]. En este estudio, estas correlaciones se exploraron en las células tumorales epiteliales. Después de 2 semanas de BORIS precipitación, análisis de expresión de
hTERT
,
CTCF
, los marcadores CSC más frecuentes (
ABCG2
,
CD44
,
ALDH1
) y células madre (
NANOG
,
Oct4
,
Sox2
,
se realizaron
) genes Bmi1. muestra la figura 4A, para todos los genes analizados, la media de las veces el cambio de BORIS sh-3 y BORIS sh-4 células en comparación con células de cada línea de células tumorales por ingeniería CTR sh.
hTERT
expresión fue significativamente las reguladas en todas las células tumorales analizadas en la excepción de MCF7, en el que se observó una regulación significativa (13 veces).
CTCF
expresión se redujo en todas las células, incluso si la disminución no fue significativa (de 40% a 20% con respecto al control). En particular, la ausencia de BORIS trigged una disminución de la
ABCG2
expresión (93% para MCF7, 25% para MDA-MB-231, 80% para HT29 y 60% para HeLa).
CD44
se había reducido regulado en todas menos una línea celular, MCF7, en el que se observó un aumento de 2,5 veces.
ALDH1
,
NANOG
,
Oct4
,
Sox2
y
IMC1
fueron generalmente reducido regulado en todas las células tumorales después de BORIS silenciamiento. En conjunto, estos resultados sugieren que BORIS podría afectar significativamente la regulación de los
hTERT
/telomerasa, se derivan de células y genes marcadores CSC en las células tumorales epiteliales.
(A) MCF7, MDA-MB- se diseñaron 231, células HeLa y HT29 de forma estable exhibir derribado
BORIS
ARNm. BORIS sh-3, SH-4 y sh CTR (shRNA de control que contienen la secuencia codificado) lentivirus se utilizaron para infectar estas células. Cada células transducidas se cultivaron con doxiciclina para inducir la expresión de BORIS shRNA. Medio que contiene doxiciclina fue reemplazado cada 3 días. Después de 2 semanas, el ARN se aisló de BORIS sh-3, SH-4 y CTR sh de cada línea celular transducida. los niveles de mRNA de los genes indicados se analizaron mediante qRT-PCR. Los gráficos representan para cada gen los medios de veces de inducción de tanto BORIS shRNA (BORIS sh-3 y 4-sh) en relación con el del control de las células. Los errores estándar se calcularon teniendo en cuenta la propagación de errores de ambos BORIS shRNA análisis. Los gráficos muestran un experimento representativo. (B) Representante flujo citometría de gráficos de puntos de CD44 y CD24 expresión en MCF7, MDA-MB-231, células HeLa y HT29 diseñado para exponer de forma estable derribado
BORIS
ARNm. se muestran CD44 y expresión de CD24 patrones de los dos BORIS shRNA (BORIS sh-3 y SH-4) y el control (SH CTR). Se utilizaron anticuerpos anti-CD24 marcado con AlexaFluor 647 y el anticuerpo anti-CD44 marcado con APC-H7. El porcentaje de CD44 + población /CD24- se estimó después de gating en células eGFP y tRFP positivos (transducidas y dox inducida por shRNA, respectivamente) y las puertas finales se basan en el control de isotipo correspondiente a cada línea celular. Todos los experimentos se llevaron a cabo de forma independiente tres veces y un experimento representativo se muestran para cada grupo de células.
CD44 + /CD24- subpoblación se ha encontrado para ser enriquecido con características iniciadoras de tumores, especialmente en las células del cáncer de mama [6, 29]. En este estudio, CSC subpoblación se analizó por citometría de flujo en células tumorales BORIS-desmontables. Se observó un comportamiento diferente de MCF7 en comparación con las otras células (Fig 4B). Los análisis revelaron una notable adquisición de CD44 + /CD24- fenotipo en células derivadas-MCF7 desmontables-BORIS, de ninguno CD44 + células /CD24- en el control a aproximadamente 70% en las células BORIS-desmontables. Se observó una disminución no significativa de CD44 + /CD24- subpoblación en las células-shRNA BORIS MDA-MB-231-derivados. En las células del tumor no mama, HT29 y HeLa, no se observaron cambios de expresión con las dos células que muestran un típico CD44 + /CD24- fenotipo epitelial.
Desmontables de BORIS afecta a la proliferación celular en células de mama MCF7
La supervivencia celular se evaluó después de BORIS caída. La proliferación celular y la capacidad de formar colonias se midieron cada semana durante un mes. La formación de colonias (o clonogénico) de ensayo monitoriza la capacidad de una células de cáncer para producir una colonia viable después del tratamiento [30] y se utilizó para analizar la
in vitro
capacidad de las células tumorales para formar colonias después de BORIS caída. Los resultados no mostraron diferencias significativas en la proliferación celular en todo menos en línea de células de un tumor. Las células MCF7 excepción de que se trate en el que un aumento significativo (3 a 4 veces, p & lt; 0,0001) de la proliferación celular en comparación con células de control se observó (Fig 5A). ensayos de formación de colonias confirmaron los resultados de proliferación celular (Fig 5B). Después de un mes de BORIS-caída, el número de colonias no fueron significativamente diferentes para HeLa, HT29 y MDA-MB-231, en comparación con los controles. Por el contrario, el número de colonias fue significativamente mayor en MCF7. Estos resultados indican que, a excepción de las células de cáncer de mama MCF7, BORIS silenciamiento en células tumorales epiteliales no tienen un impacto significativo en la supervivencia celular.
(A) la proliferación celular, más de 1 mes de BORIS dox inducida - las células y el CTR-shRNA, se analizó cada semana mediante el ensayo de MTT. Los resultados de los dos específico BORIS-shRNA (BORIS sh-sh-3 y 4) se indican en porcentaje en comparación con la proliferación celular de las células control (shRNA revueltos, CTR sh). Las barras de error representan la media ± SD (n = 3). Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (p & lt; 0,05) entre BORIS sh sh y CTR. (B) Imágenes representativas de ensayo de formación de colonias después de 1 mes de BORIS caída. Trescientos células se sembraron en cada pocillo de placas de 6 pocillos con medio que contiene doxiciclina, cada grupo de células se prepararon por triplicado.