Extracto
La vía mTOR se estimula de manera aberrante en muchas células cancerosas, incluyendo adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), y por lo tanto es un objetivo potencial para la terapia. Sin embargo, el eje /S6K mTORC1 también media bucles de retroalimentación negativa que atenúan la señalización a través de insulina /IGF receptor y otros receptores de tirosina quinasa. Represión de estos bucles de retroalimentación desata sobre-activación de las vías de aguas arriba que potencialmente contrarrestar los efectos antiproliferativos de los inhibidores de mTOR. Aquí, demostramos que el tratamiento de PANC-1 o MiaPaCa-2 células de cáncer de páncreas con inhibidores de mTOR rapamicina o sitio activo suprime la fosforilación S6K y S6 inducida por la insulina y la neurotensina agonista de GPCR. La rapamicina causó un notable aumento en la fosforilación de Akt en Ser
473, mientras que los inhibidores del sitio activo de la mTOR (KU63794 y PP242) abrogadas por completo la fosforilación de Akt en este sitio. A la inversa, los inhibidores del sitio activo de mTOR causar un marcado aumento en la activación de ERK mientras que la rapamicina no tenían ningún efecto estimulante sobre la activación de ERK. Los resultados implican que primera y segunda generación de inhibidores de mTOR promover sobre-activación de diferentes vías pro-oncogénica en células PDAC, lo que sugiere que la supresión de los bucles de realimentación debe ser una consideración importante en el uso de estos inhibidores para la terapia de PDAC. Por el contrario, la metformina abolió la activación mTORC1 sin sobre-estimulación de la fosforilación de Akt en Ser
473 e impidió la activación de ERK estimulada por mitógenos en células PDAC. La metformina indujo una inhibición más pronunciada de la proliferación que cualquiera KU63794 o rapamicina, mientras que, el inhibidor de mTOR sitio activo fue más eficaz que la rapamicina. Por lo tanto, los efectos de la metformina sobre Akt y la activación de ERK son notablemente diferentes de alostéricos o sitio activo inhibidores de mTOR en células PDAC, aunque todos estos agentes inhibieron potentemente el eje /S6K mTORC1
Visto:. Soares HP, Ni y, Kisfalvi K, Sinnett-Smith J, e Rozengurt (2013) Diversos modelos de Akt y ERK Comentarios activación en respuesta a la rapamicina, inhibidores de mTOR sitio activo y metformina en células de cáncer de páncreas. PLoS ONE 8 (2): e57289. doi: 10.1371 /journal.pone.0057289
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Agosto, 2012; Aceptado: 20 de enero de 2013; Publicado: 21 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Soares et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud Subvenciones P30DK41301, P01CA163200 y R01DK55003, Departamento de Veteranos de Grant Affair 1I01BX001473 y fondos del Presidente Ronald S. Hirshberg dotado de Investigación del cáncer de páncreas todo a ER. (Http://www.nih.gov/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el objetivo de mamífero de la rapamicina (mTOR) es una proteína quinasa altamente conservadas evolutivamente que juega un papel clave en la integración del factor de crecimiento, nutrientes y el estado de energía de las células [1]. funciones de mTOR como una subunidad catalítica en dos complejos multiproteicos distintas, complejo mTOR 1 (mTORC1) y mTORC2. mTORC1, caracterizado por la subunidad reguladora Raptor, controla al menos dos reguladores de la síntesis de proteínas, las proteínas 40S ribosomal subunidad S6 quinasa (S6K) y la traducción eucariótica factor de iniciación 4E (eIF4E) proteína de unión 1, que se refiere como 4E-BP1 [1 ], [2]. El heterodímero de la TSC2 supresor de tumor (tuberina) y TSC1 (hamartina) reprime la señalización mTORC1 actuando como la proteína GTPasa-activador para la pequeña proteína G Rheb (Ras homólogo enriquecido en el cerebro), un potente activador de mTORC1 de señalización en su GTP estado ligado [3], [4]. La fosforilación de Akt por TSC2 y /o ERK /p90rsk suprime su actividad de activación GTPasa hacia Rheb, conduce a la activación mTORC1 [5]. mTORC1 se forma aguda y de forma alostérica rapamicina inhibe por medio de la unión de FKBP12. mTORC2, caracterizado por Rictor, no es inhibida por el tratamiento a corto plazo con este agente y fosforila varias proteínas quinasas AGC, incluyendo Akt en Ser
473 [6], [7]. La vía mTORC1 juega un papel clave en el receptor de insulina /IGF señalización [8], [9] y se activa de forma aberrante en muchos tipos de cáncer, incluyendo adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), una de las enfermedades humanas más letales. En consecuencia, las células expresan PDAC insulina y el IGF-1 y los receptores sobre-expresa el IRS-1 e IRS-2 [10] - [12] y PDAC (pero no es normal) Visualización de tejidos activada (fosforilada) IGF-1R [13]. variaciones de genes en el sistema de señalización de IGF-1 se han asociado a una peor supervivencia en pacientes con PDAC [14]. La inactivación de p53, como se ve durante la progresión de 50 a 70% de los PDAC, hasta regula la vía de insulina /IGF-1 /mTORC1 [15]. Crosstalk entre /IGF-1 los receptores de insulina y la proteína G-receptor acoplado (GPCR) sistemas de señalización potentemente estimular mTORC1, síntesis de ADN y la proliferación celular en un panel de células PDAC [16] - [20]. señalización mTORC1 juega un papel fundamental en la proliferación y supervivencia de las células PDAC [21] y se activa en los tejidos de cáncer de páncreas [20], [22] - [24]. En consecuencia, mTORC1 se ha convertido en una atractiva diana terapéutica en PDAC y otros cánceres comunes.
Además de la señalización que promueve el crecimiento, mTORC1 /S6K también media bucles de retroalimentación negativa que restringen la señalización a través de insulina /IGF receptor de la tirosina y otra receptores de quinasa a través de fosforilación y la represión transcripcional de IRS-1 [25] - [30] y la fosforilación de Grb10 [31], [32]. En consecuencia, la supresión de la actividad mTORC1 por rapamicina previene inhibitorios IRS-1 fosforilaciones y la degradación, aumentando de ese modo la activación de PI3K /Akt en diversos tipos de células del cáncer [30], [33] - [35]. Estos estudios implican que el potencial actividad anticancerígena de la rapamicina (o análogos) puede ser compensado por la liberación de la inhibición por retroalimentación de la activación de PI3K /Akt [25], [30], [33] - [35]. Además, la rapamicina inhibe de forma incompleta 4E-BP-1 fosforilación [36] - [40]. En consecuencia, la actividad antitumoral clínica de la rapamicina y sus análogos (rapálogos) ha sido más bien limitada en muchos tipos de cáncer [41], [42], incluyendo PDAC [43], [44]. En un esfuerzo para dirigir la vía de mTOR de manera más eficaz, se han identificado nuevos inhibidores de mTOR que actúan en el catalítica del sitio activo (sitio activo de los inhibidores de mTOR), incluyendo PP242 [37], Torin [45], KU63794 [38] y su análogo de AZD8055 [46]. Estos compuestos inhiben 4E-BP-1 fosforilación en sitios de rapamicina resistente (por ejemplo Thr
37/46) y bloquear la fosforilación de Akt en Ser
473 a través de la inhibición de la mTORC2. Sin embargo, los inhibidores de mTOR sitio activo también eliminan los bucles de retroalimentación que limitan la activación de PI3K [25] y, en consecuencia, su eficacia terapéutica también puede ser disminuida por la activación de las vías ascendentes que se oponen a sus efectos anti-proliferativos.
También es mTORC1 regulada negativamente por la metformina, el fármaco más utilizado en el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2 (DM2). La metformina se perfila como un nuevo agente potencial en la quimioprevención del cáncer. Estudios epidemiológicos recientes vinculados administración de metformina a la incidencia reducida, la recidiva y mortalidad de una variedad de cánceres en pacientes con DM2 [20], [47] - [56], incluidos los PDAC [54], [56]. A nivel celular, la metformina estimula indirectamente AMP-activated proteína quinasa (AMPK) de activación [57], aunque se han propuesto otros mecanismos de acción a muy altas concentraciones de este biguanida. AMPK inhibe la activación mTORC1 través de la estimulación de la función TSC2 [58] - [60], lo que lleva a la acumulación de Rheb-PIB (la forma inactiva) y por fosforilación directa de Raptor, que interrumpe su asociación con mTOR, que conduce a la disociación del complejo mTORC1 [61]. La consecuencia preciso de la supresión de los bucles de retroalimentación negativa mediada por el eje mTORC1 /S6K en respuesta a la metformina sigue siendo mal definidos y, en particular, no se sabe si los inhibidores de mTOR rapamicina, sitio activo y plomo metformina a un exceso de activación de aguas arriba similares vías en las células PDAC.
a continuación, se demuestra que el tratamiento de la PANC-1 o MiaPaCa-2 células de cáncer de páncreas con inhibidores de mTOR rapamicina o sitio activo suprime S6K y S6 fosforilación inducida por la insulina, una combinación de insulina y la neurotensina agonista de GPCR o suero. La rapamicina causó un aumento del impactante de la fosforilación de Akt en Ser
473, mientras que los activos de sitio los inhibidores de mTOR KU63794 y PP242 abrogadas por completo la fosforilación de Akt en este sitio. Una característica sobresaliente de los resultados presentados aquí es que los inhibidores del sitio activo de mTOR, a diferencia de la rapamicina, causan un marcado aumento en la activación de ERK en las células PDAC. Los resultados implican que los inhibidores de mTOR primera y segunda generación promueven sobre-activación de diferentes vías pro-oncogénica en células PDAC, a saber, Akt y ERK. La metformina también abolió la activación mTORC1 pero sin sobre-estimulación de la fosforilación de Akt en Ser
473. Por otra parte, la metformina previene la fosforilación de ERK en respuesta a los agonistas-cruz hablando en células PDAC. Nuestros resultados demuestran que los efectos de la metformina sobre Akt y la activación de ERK son notablemente diferentes de los provocados por inhibidores de mTOR alostéricos o sitio activo, aunque todos estos agentes inhibieron potentemente el eje /S6K mTORC1.
Materiales y Métodos
cultivo celular
las líneas celulares de cáncer pancreático humano Panc-1 y MiaPaCa-2 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Estas líneas celulares albergan mutaciones activadoras en los
KRAS
oncogén. Las células fueron cultivadas en Dulbecco modificado de Eagle Medium (DMEM) con glutamina 2 mM, 1 mM Na-piruvato, 100 unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (FBS) a 37 ° C en una atmósfera humidificada atmósfera que contiene 10% de CO
2.
análisis de transferencia Western
Los cultivos confluentes de células PANC-1 o MIA Paca-2 cultivadas en placas de 3 cm se lavaron y después se incubaron durante 24 horas con DMEM que contiene glucosa 5 mM y 1% de FBS. Las células se lavaron dos veces con DMEM que contiene glucosa 5 mM y se incubaron en medio libre de suero durante 4 h y después se trataron como se describe en los experimentos individuales. Los cultivos se lisaron entonces directamente en 2 × SDS-PAGE de tampón de muestra [200 mM Tris-HCl (pH 6,8), EDTA 2 mM, 0,1 M Na
3Vo
4, 6% de SDS, 10% de glicerol, y 4% de 2-mercaptoetanol], seguido por SDS-PAGE en geles al 10% y la transferencia a membranas Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA). a continuación, transferencias de Western se realizaron sobre membranas incubadas durante la noche con los anticuerpos especificados en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 0,1% de Tween-20. Las bandas inmunorreactivas se detectaron con ECL (quimioluminiscencia potenciada) reactivos (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ). Los anticuerpos utilizados detectan el estado fosforilado de S6K en Thr
389, S6 en la Ser
235/236, 4E-BP1 en Thr
37/46 y Thr
70, Akt en Ser
473 y Thr
308 y ERK1 /2 en Thr
202 y Tyr
204 o los niveles totales de estas proteínas.
proliferación de las células dependientes de anclaje.
PANC -1 células (10
5) se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 35 mm en DMEM que contenía FBS al 10%. Después de 24 h de incubación a 37 ° C, grupos de cultivos se incubaron con neurotensina y la insulina con o sin metformina en DMEM que contiene 0,25% de FBS o rapamicina, KU63794 o metformina en DMEM que contenía 2,5% de FBS. Los cultivos se incubaron a continuación durante 4 d, y el recuento total de células se determinó a partir de un mínimo de seis pocillos por condición usando un contador Coulter, después de grupos de células fueron desagregados haciendo pasar la suspensión de células 10 veces a través de un calibre 19, y posteriormente, una aguja de calibre 21.
Materiales
DMEM se obtuvo de Invitrogen (Carlsbad, CA). Neurotensina y la insulina se obtuvieron de Sigma Chemical (St. Louis, MO). La rapamicina, KU63794 y PP242 fueron de R & amp; D Systems, Inc. de Minneapolis. Todos los anticuerpos se adquirieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). El rábano picante anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa y anti-IgG de ratón eran de GE Healthcare Bio-Sciences Corp (Piscataway, NJ). Todos los demás reactivos fueron de la más alta calidad disponible.
Resultados
Estimulación de p70S6K y la fosforilación S6 en respuesta a la insulina y la neurotensina en las células PDAC es completamente abolida por la rapamicina o KU63794
Inicialmente, se determinó la influencia de rapamicina y KU63794 sobre la fosforilación mediada por mTORC1 de S6K en células PDAC. La rapamicina es un inhibidor alostérico de mTORC1 que actúa a través de FKBP-12, mientras que KU63794 es un inhibidor de la ATP-competitiva altamente específico de mTOR que inhibe tanto mTORC1 y mTORC2. Los cultivos de PANC-1 (Fig. 1) o MiaPaCa-2 se incubaron (Fig. 2) las células durante 2 h en ausencia o presencia de rapamicina (a 10 o 100 nM) o KU63794 (a 1 o 5 M). Luego, los cultivos se estimularon con una combinación de insulina (10 ng /ml) y la neurotensina GPCR agonista (5 nM) durante 2 h para provocar diafonía positivo [18], [20]. La fosforilación de Thr en S6K
389, un objetivo directo de mTORC1, y la fosforilación de S6 (Ser
235/236), un sustrato de S6K, se controló utilizando anticuerpos específicos que detectan el estado fosforilado de esos residuos. La estimulación de cualquiera de las células PANC-1 o MiaPaCa-2 con insulina y neurotensina inducida por fosforilación robusta de S6K en Thr
389 y S6 (Figs. 1 y 2). La exposición a la rapamicina o KU63794 previno completamente el aumento de la fosforilación de estas proteínas en respuesta a la estimulación por la insulina y la neurotensina en las células, ya sea PANC-1 (Fig. 1) o MiaPaCa-2 (Fig. 2). Hemos comprobado que los niveles totales de S6K y S6 no cambiaron en respuesta a los tratamientos. Los resultados indican que alostéricos o sitio activo inhibidores de mTOR potentemente bloquean el eje mTORC1 /S6K a las concentraciones utilizadas en las células PDAC
Los cultivos de células Panc-1 se incubaron en ausencia. (-) O en el presencia de KU63794 (Ku) a 1 M o 5 M o rapamicina (Rap) en 10 o 100 nM durante 2 h en DMEM que contiene glucosa 5 mM, como se indica. Después, se estimularon las células durante 2 h con 5 nM de neurotensina (NT) y 10 ng de insulina /ml (Ins) y se lisaron con tampón de muestra 2 x SDS-PAGE. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpos que detectan el estado fosforilado de S6K en Thr
389, S6 en Ser
235/236, 4E-BP1 en Thr
37/46 y Thr
70, Akt en Ser
473 y Thr
308 y ERK en Thr
202 y Tyr
204. Inmunotransferencia con anticuerpos que reconocen S6K total, el S6, 4E-BP1, Akt y ERK se utilizó para verificar que los tratamientos con células no cambió el nivel total de estas proteínas y confirmar la igualdad de carga de gel. Las veces de aumento en la fosforilación de ERK se cuantificó usando V3.0 Medidor Multi y se representa en forma de barras. Se obtuvieron resultados similares en 3 experimentos independientes
Los cultivos de células MiaPaCa-2 se incubaron en ausencia. (-) o en presencia de KU63794 (Ku) a 1 M o 5 M o rapamicina ( Rap) en 10 o 100 nM durante 2 h en DMEM que contiene glucosa 5 mM, como se indica. Después, se estimularon las células durante 2 h con 5 nM de neurotensina (NT) y 10 ng de insulina /ml (Ins) y se lisaron con tampón de muestra 2 x SDS-PAGE. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpos que detectan el estado fosforilado de S6K en Thr
389 (pS6K), S6 en Ser
235/236 (PS6), 4E-BP1 en Thr
37/46 y Thr
70, Akt en Ser
473 y ERK en Thr
202 y Tyr
204. Inmunotransferencia con anticuerpos que reconocen S6K total, el S6, 4E-BP1, Akt y ERK se utilizó para verificar que los tratamientos con células no cambió el nivel total de estas proteínas y confirmar la igualdad de carga de gel. Las veces de aumento en la fosforilación de ERK se cuantificó usando V3.0 Medidor Multi y se representa en forma de barras. Se obtuvieron resultados similares en 3 experimentos independientes.
Reglamento
diferencial de los sitios de fosforilación 4EBP1 en respuesta a la estimulación mitogénica, rapamicina y KU63794 en las células PDAC
La fosforilación de 4EBP1 también fue supervisado por utilizando anticuerpos 4E-BP1 específicas de sitio que detectan p-Thr
37/46 o p-Thr
70 en lysayes de (Fig. 2) las células PANC-1 (Fig. 1) o MiaPaCa-2. Estas células muestran un alto nivel basal de fosforilación de 4E-BP1 en Thr
37/46 que no fue aún mayor por la estimulación con insulina y neurotensina. Sin embargo, la estimulación de células reduce la movilidad de 4E-BP1 en SDS /PAGE, una respuesta sugestivo de aumento de la fosforilación en otros sitios. De hecho, el tratamiento de las células PANC-1 o MiaPaCa-2 con neurotensina y la insulina marcadamente estimulada 4E-BP1phosphorylation en Thr
70. La fosforilación constituve de 4E-BP1 en Thr
37/46 fue abolida por el tratamiento con KU63794 pero no se vio afectada por la rapamicina, ya sea en 10 o 100 nm, de acuerdo con informes de que la rapamicina y sus análogos no inhiben la fosforilación de 4E-BP1 en estos sitios en otros tipos de células. Por el contrario, la fosforilación de respuesta de señal de 4E-BP1 en Thr
70 fue impedida por el tratamiento con cualquiera KU63794 o rapamicina a 100 nM. Hemos comprobado que los niveles totales de 4E-BP1 no cambian en respuesta a los resultados treatments.These revelaron una regulación poco apreciado de la fosforilación de 4E-BP1 en diferentes residuos en respuesta a señales externas y demuestran que la rapamicina inhibe inducible pero no constitutivo 4E-BP1 fosforilación en células PDAC mientras que los inhibidores de mTOR sitio activo suprimir la fosforilación de 4E-BP1 en todos los sitios.
rapamicina y KU63794 inducen la sobre-estimulación de diferentes vías de aguas arriba en células estimuladas con insulina PDAC y neurotensina o insulina sola
con el fin de determinar si los inhibidores de mTOR alostéricos y sitio activo eliminar bucles de retroalimentación que restringen la actividad de rutas de señalización aguas arriba en las células PDAC, hemos examinado el efecto de estos inhibidores de la fosforilación de Akt en respuesta a la señalización mitogénica en PANC Paca-2 células -1 y Mia. La estimulación de estas células con insulina y neurotensina indujo un marcado aumento en la fosforilación de Akt en Ser
473 (. Figs 1 y Fig. 2). El tratamiento con 10 nM o 100 nM de rapamicina promueve la sobre-estimulación de la fosforilación de Akt en Ser
473, en consonancia con la supresión de mTORC1 /S6K captación del eje bucles. En contraste, la exposición previa a la del sitio activo KU63794 inhibidor de mTOR, que inhibe tanto mTORC1 y mTORC2, bloqueó la fosforilación de Akt en Ser
473 en PANC-1 (Fig. 1) y MiaPaCa-2 células (Fig. 2), en línea con la idea de que mTORC2 es la principal proteína quinasa que fosforila Akt en Ser
473 células en PDAC. KU63794 no impidió que la fosforilación de Akt en Thr
308.
La vía ERK /RSK, que desempeña un papel fundamental en la proliferación celular PDAC también conduce a la activación mTORC1 [5], [62]. En las células de mama y cáncer de vejiga, la inhibición del eje mTORC1 /S6K por rapamicina activación inducida retroalimentación de ERK [63]. En consecuencia, se examinaron los efectos de la rapamicina y KU63794 sobre la activación de ERK en células PDAC. De acuerdo con estudios anteriores [16], [64], [65], la estimulación de cualquiera de las células PANC-1 o MiaPaCa-2 con insulina y neurotensina marcadamente activado ERK (ERK fosforilada en Thr
202 y Tyr
204 ), como se ilustra en las Figs. 1 y 2. En contraste con los resultados obtenidos en otros tipos de células [63], el tratamiento ya sea con 10 o 100 nM de rapamicina durante 2 h no alteró el basal o el nivel estimulado de la fosforilación de ERK en PANC-1 y las células MiaPaCa-2 . Se obtuvieron resultados similares cuando estas células PDAC fueron tratados con rapamicina para 4 o 24 h (resultados no mostrados). En contraste, la exposición a KU63794 (1-5 M) aumentó el nivel basal de la fosforilación de ERK y sorprendentemente mejora la estimulación de la fosforilación de ERK inducida por la insulina y la neurotensina en las células, ya sea PANC-1 o MiaPaCa-2. La cuantificación de los resultados con ERK se ilustra en los paneles inferiores de las Figs. 1 y 2 (barras). Estos resultados demuestran que la rapamicina, un inhibidor alostérico de mTORC1 y KU63794, un inhibidor del sitio activo de la mTOR, conducir a exceso de activación de diferentes vías pro-oncogénicos aguas arriba en las células PDAC.
Estimulación de la PANC-1 células o MiaPaCa-2 con insulina sola inducidos sólido aumento de la PI3K /Akt /mTORC1 pero no induce aumento significativo de ERK fosforilada en Thr
202 y Tyr
204 (Fig. 3). En consecuencia, se determinó si los efectos diferenciales de la rapamicina y KU63794 representado en PDAC estimularon con la combinación de la insulina y de neurotensina (Figs. 1 y 2) también se pueden producir cuando las células PANC-1 y MiaPaCa-2 son desafiados con la insulina sola. Los cultivos de estas células se incubaron durante 2 h en ausencia o presencia de rapamicina (10-100 nM) o KU63794 (1-5 M) y después se estimularon con insulina (10 ng /ml). Hicimos un seguimiento de la fosforilación de Thr en S6K
389, S6 en Ser
235/236, Akt en Ser
473 y Thr
308 y ERK en Thr
202 y Tyr
204. La exposición previa a cualquiera de rapamicina o KU63794 abolió el aumento en la fosforilación de S6K y S6 en respuesta a la insulina en cualquiera de las células PANC-1 o MiaPaCa-2 (Fig. 3). La exposición a la rapamicina sobre-activado mientras que el tratamiento con KU63794 suprimió la fosforilación de Akt en Ser
473 en las células PDAC de insulina estimulada. La rapamicina no produjo ningún efecto detectable sobre la activación de ERK en las células un-estimulado o tratada con insulina. Una característica sobresaliente de los resultados mostrados en la Fig. 3 es que la exposición a KU63794 indujo un marcado aumento en la fosforilación de ERK en Thr
202 y Tyr
204. Estos resultados corroboraron que el inhibidor alostérico de mTORC1 y el sitio activo inhibidor del sitio de mTOR promover la sobre-activación de diferentes vías de aguas arriba en células PDAC desafiados con insulina o la insulina y la neurotensina, una combinación que provoca la interferencia entre /IGF y GPCR sistemas de señalización de la insulina .
los cultivos de PANC-1 (paneles superiores) y MiaPaCa-2 (paneles inferiores) se incubaron en ausencia (-) o en presencia de KU63794 (Ku) a 1 M o 5 M o rapamicina (Rap) en 10 o 100 nM durante 2 h en DMEM que contiene glucosa 5 mM, como se indica. Después, se estimularon las células durante 2 h con 10 ng de insulina /ml y se lisaron con tampón de muestra 2 x SDS-PAGE. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpos que detectan el estado fosforilado de S6K en Thr
389, S6 en Ser
235/236, Akt en Ser
473 y Thr
308 y ERK en Thr
202 y Tyr
204. Inmunotransferencia con S6K total, el S6, Akt y ERK se utilizó para verificar la igualdad de carga de gel. Las veces de aumento en la fosforilación de ERK se cuantificó usando V3.0 Medidor Multi y se representa en forma de barras. Se obtuvieron resultados similares en 3 experimentos independientes.
PP242, como KU63794, aumenta la activación de ERK en las células PANC-1 estimuladas con insulina y neurotensina
A continuación, se determinó si el sorprendente sobre -activación de ERK por el sitio activo de mTOR KU63794 inhibidor podría ser también producido por un sitio activo inhibidor de mTOR estructuralmente no relacionado. Los cultivos de PANC-1 se incubaron durante 2 h en ausencia o presencia de PP242 (1-5 M), un sitio activo recientemente identificado inhibidor de mTOR [37], y estimularon durante 2 h con insulina y neurotensina. Hicimos un seguimiento de la fosforilación de Thr en S6K
389, S6 en Ser
235/236, 4EBP1 en Thr
37/46, Akt en Ser
473 y ERK en Thr
202 y Tyr
204. Como se muestra en la Fig. 4 A, la exposición previa a PP242 suprimió la fosforilación de S6K, S6, 4EBP1 y Akt en células PANC-1. La característica clave de los resultados es que PP242, como KU63794, indujo un marcado aumento en la fosforilación de ERK en Thr
202 y Tyr
204 (Fig. 4A y la cuantificación en la Fig. 4B). Debido PP242 es un inhibidor de mTOR menos selectiva [66], a fin de determinar si las concentraciones de PP242 que promovieron la activación de ERK coinciden con los que inhiben la actividad mTORC1. Como se muestra en la Fig. 4C, PP242 mejorado la activación de ERK y se inhibe la fosforilación S6 casi idénticas concentraciones
Un
, cultivos de células PANC-1 se incubaron en ausencia. (-) O en presencia de al PP242 1 M o 5 M durante 2 h en DMEM que contiene glucosa 5 mM, como se indica. Después, se estimularon las células durante 2 h con 5 nM de neurotensina (NT) y 10 ng de insulina /ml (Ins) y se lisaron con tampón de muestra 2 x SDS-PAGE. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpos que detectan el estado fosforilado de S6K en Thr
389, S6 en Ser
235/236, 4E-BP1 en Thr
37/46, Akt en Ser
473 y ERK en Thr
202 y Tyr
204. Inmunotransferencia con anticuerpos que reconocen S6K total, el S6, 4E-BP1, Akt y ERK se utilizó para verificar que los tratamientos con células no cambió el nivel total de estas proteínas y confirmar la igualdad de carga de gel. Se obtuvieron resultados similares en 3 experimentos independientes.
B
, las barras representan el aumento de la fosforilación de ERK inducida por la insulina (Ins) y de neurotensina (NT) en células sin o con exposición previa a PP242. La cuantificación se realizó usando Multi V3.0 Gauge
C,
cultivos de células PANC-1 se incubaron como en el panel A, pero en presencia de concentraciones crecientes de PP242. Se analizaron las muestras para detectar el estado de fosforilados en Ser S6
235/236 y ERK en Thr
202 y Tyr
204. Inmunotransferencia con total de ERK y S6 (no mostrado) se utiliza para verificar la igualdad de carga de gel. La cuantificación se realizó utilizando V3.0 Medidor Multi.
D
, cultivos de células PANC-1 se incubaron en ausencia (-) o en presencia de cualquiera de KU63794 (Ku) o PP242 en 5 M durante 2 h. Después, se estimularon las células durante 2 h con 5 nM de neurotensina (NT) y 10 ng de insulina /ml (Ins) y se lisaron con tampón de muestra 2 x SDS-PAGE. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpos que detectan el estado fosforilado de ERK en Thr
202 y Tyr
204, Akt en Ser
473 y Thr
308. Inmunotransferencia con Akt total y ERK se utilizó para verificar la igualdad de carga de gel.
Hemos comprobado que los activos de sitio los inhibidores de mTOR KU63794 y PP242, en concentraciones que un marcado aumento de la activación de ERK y Akt inhibe la fosforilación en Ser
473 no impidió que la fosforilación de Akt en Thr
308 en células PDAC (Fig. 4D). De hecho, el KU63794 específico inhibidor de mTOR ligeramente mayor fosforilación de Akt en Thr
308, en consonancia con la supresión de la retroalimentación bucles que restringen la actividad de PI3K (Fig. 4D). PP242 fue menos eficaz que KU63794 en el aumento de la fosforilación de Akt en Thr
308, más probable es que refleja la inhibición fuera del objetivo de PI3K [66]. Por lo tanto, los inhibidores de mTOR específica del sitio del sitio activo KU63794 y PP242 suprimen la fosforilación de Akt en Ser
473, no disminuyó la fosforilación de Akt en Thr
308 y estimulado sobre-activación de la fosforilación de ERK en Thr
202 y Tyr
204 en células PDAC.
El mecanismo por el cual los inhibidores del sitio activo potenciar la activación de ERK no se entiende bien. Nuestros resultados no apoyan la existencia de células PDAC de un putativo mTORC1 /S6K /PI3K bucle de realimentación /ERK, se propone en otros tipos de células [63], ya que una potente inhibición del eje /S6K mTORC1 por cualquiera de rapamicina o everolimus no produjo sobreestimulación de ERK en las células PDAC. En apoyo de esta conclusión, las células PANC-1 se trataron con KU63794 o PP242 y se estimularon con insulina y neurotensina en la ausencia o presencia de A66 [67], un inhibidor selectivo de la 110α subunidad catalítica de PI3K. Como se muestra en la Fig. 4D, la exposición a A66 no impidió que la mejora de la activación de ERK en respuesta a la exposición a cualquiera KU63794 o PP242. Hemos corroborado que A66, a la concentración utilizada, potentemente PI3K inhibió dentro de las células Panc-1, ya que impidió la fosforilación de Akt inducida por insulina en Thr
308, el residuo clave en el bucle de activación de Akt fosforilada por PDK1 dependiente de PI3K.
a fin de obtener una mayor comprensión del mecanismo por el que el tratamiento con KU63794 induce sobre-activación de ERK también se determinó el efecto de este inhibidor de mTOR sitio activo de la activación de MEK, la quinasa aguas arriba que fosforila ERK. la activación de MEK se obtuvo mediante la evaluación de la fosforilación de la Ser
217 y Ser
221 en su bucle de activación. Como se muestra en la Fig. S1, el tratamiento de las células PANC-1 o MiaPaCa-2 con KU63794 notablemente mayor fosforilación de MEK inducida por la insulina y la neurotensina. En conjunto, los resultados demuestran que los inhibidores de mTOR sitio activo llevaron a /ERK hiper-activación MEK a través de un /bucle de realimentación S6K independiente de PI3K en células PDAC.
patrones diferenciales de Akt y ERK activación en respuesta a la rapamicina, everolimus, KU63794 y PP242 en las células PANC-1 estimuladas con suero
Los resultados anteriores se obtuvieron con células estimuladas con mitógenos PDAC definidos que actúan a través de receptores específicos. Para ampliar aún más estos hallazgos también a prueba si los patrones diferenciales de Akt y la activación de ERK se producen cuando las células son estimuladas con suero bovino fetal. Los cultivos de células PANC-1 se incubaron durante 2 h en ausencia o presencia de rapamicina (100 nM), everolimus (100 nM), KU63794 (1 M) o PP242 (1 M) y se estimularon con medio que contiene suero bovino fetal. Hicimos un seguimiento de la fosforilación de S6 en Ser
235/236, Akt en Ser
473 y ERK en Thr
202 y Tyr
204. La exposición previa a la rapamicina, everolimus, o KU63794 PP242 abolió el aumento en la fosforilación de S6 en respuesta a suero (Fig. 5). La exposición a la rapamicina o everolimus sobre-activa mientras que el tratamiento con KU63794 o PP242 suprimió la fosforilación de Akt en Ser
473 en células estimuladas con suero PDAC. La rapamicina o everolimus no produjeron ningún efecto detectable sobre la activación de ERK mientras que la exposición a KU63794 o PP242 indujeron un marcado aumento en la fosforilación de ERK en Thr
202 y Tyr
204 en suero de las células tratadas (Fig. 5). Estos resultados corroboraron que alostérico y los inhibidores del sitio activo de sitio de mTOR promover la sobre-activación de diferentes vías de aguas arriba en células PDAC bajo una variedad de condiciones experimentales, incluyendo las células estimuladas con insulina, la insulina y la neurotensina agonista de GPCR o con suero bovino fetal fresco.
los cultivos se incubaron en ausencia (-) o en presencia de 5 mM KU63794 (Ku), 5 mM PP242, 100 nM de rapamicina (Rap) o 100 nM everolimus durante 2 h en DMEM que contiene 5 mM glucosa, como se indica. Después, se estimularon las células durante 2 h con bovino fetal a una dilución final de 2% (suero) y se lisaron con tampón de muestra 2 x SDS-PAGE. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpos que detectan el estado fosforilado de Akt en Ser
473, S6 en Ser
235/236, y ERK en Thr
202 y Tyr
204 . Como se muestra en la Fig. Los resultados se presentan como media ± SEM. Los resultados se presentan como media ± SEM.